基于RAPD技術(shù)對窖泥梭菌近似菌株的分類研究

林世剛，田雨思，毛輝，鄒偉，2，葉光斌，2*

（1.四川輕化工大學(xué) 生物工程學(xué)院，四川 自貢 644000；2.四川輕化工大學(xué) 釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室，四川 宜賓 643000）

濃香型白酒位列中國白酒四大基礎(chǔ)香型之首，其獨特風(fēng)味得益于微生物菌群的生長和代謝以及復(fù)雜的協(xié)同作用[1]。在窖泥環(huán)境中，梭菌屬被認(rèn)為是豐富度較高的物種。其能夠利用淀粉等有機(jī)質(zhì)產(chǎn)生多種物質(zhì)包括己酸、丁酸、乙酸等，以及產(chǎn)生多種醇、醛、酮等化合物，對酒體風(fēng)味物質(zhì)貢獻(xiàn)較大，典型的有庫氏梭菌（Clostridium kluyveri）、酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum）和丁酸梭菌（Clostridium butyricum）等[2]。胡曉龍等[3]對庫氏梭菌 N6（Clostridium kluyveri N6）進(jìn)行了研究，并發(fā)現(xiàn)其代謝產(chǎn)物較為豐富，包括一些酯類和醇類等。也有研究表明丁酸梭菌（Clostridium butyricum）在發(fā)酵過程中會產(chǎn)生一些抗菌肽物質(zhì)丁酸梭菌素抑制雜菌的生長[4]。梭菌不僅具有產(chǎn)生酒體風(fēng)味物質(zhì)的能力，其一些自身代謝產(chǎn)物也參與窖泥中其他菌體的代謝和生長，進(jìn)而使酒體風(fēng)味更加豐富。對窖泥中的梭菌進(jìn)行研究，有助于分析和利用窖泥微生物資源，為調(diào)控濃香型白酒品質(zhì)和產(chǎn)量的研究提供理論支持。窖泥中微生物種類繁多，功能各不相同，明確其分類地位及與表型特征之間的關(guān)系是研究利用窖泥微生物種群資源的重要一環(huán)。

傳統(tǒng)方法中，通常會綜合表型性質(zhì)，如菌落及顯微形態(tài)、產(chǎn)酶特性、發(fā)酵產(chǎn)物等對細(xì)菌進(jìn)行初步的鑒定；該方法在判斷具有相似表型性狀但在遺傳學(xué)上沒有實質(zhì)關(guān)聯(lián)的菌株時不夠準(zhǔn)確[5]。基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分析是現(xiàn)有微生物分類方法中最為快速和常規(guī)的方法。但是對于16S rDNA序列相似度高的近似種或亞種，它們難以通過傳統(tǒng)方法和現(xiàn)在16S rDNA序列鑒定區(qū)分開來[6]。因此有必要通過其他方法將它們做進(jìn)一步的區(qū)分。學(xué)者們提出了很多以DNA為目標(biāo)物的近似菌株的分型方法，主要有限制性片段長度多態(tài)性分析技術(shù)（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性分子分型（amplified restriction fragment polymorphism，AFLP）、脈沖場凝膠電泳（pulsed field gel electrophoresis，PFGE）、多位點序列分型（multi locus sequence typing，MLST）、變性梯度凝膠電泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE）、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記等[7-16]。最新應(yīng)用在細(xì)菌分型上的技術(shù)還包括紅外光譜分析和基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜等[17-18]。

RAPD技術(shù)是一種基于基因組聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的多態(tài)性分析的分子分型技術(shù)，最早由Williams等[19]在1990年提出，其原理：以長度為10 bp的隨機(jī)核苷酸作為引物，對研究菌種的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳分離，最終顯示為不同的擴(kuò)增圖譜，再對其進(jìn)行聚類分析。RAPD的研究和應(yīng)用較為廣泛，對新種的確定和相似菌株的分類有很強(qiáng)的參考意義。近年來，RAPD分型在醫(yī)學(xué)上使用較多，Azimirad等[20]采用RAPD分型技術(shù)成功對腹瀉患者艱難梭菌進(jìn)行了分型。Shoaei等[21]則使用RAPD分型研究了對伊朗糖尿病患者耐藥艱難梭菌的基因多態(tài)性，并比較了不同RAPD簇之間菌株基因的相似性。但目前在窖泥近似菌株的分型中未見報道。

本研究通過篩選的4種多態(tài)性良好的隨機(jī)引物對窖泥中19株近似梭菌進(jìn)行RAPD分型，旨在分析濃香型白酒窖泥中16S rDNA序列相似度大于97%的近似菌種的物種多樣性，能夠為后續(xù)該類菌株分類及開發(fā)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 供試菌株和隨機(jī)引物

從四川某酒廠窖泥和窖泥富集液中共分離獲得22株梭菌，其中有19株難以鑒定到種，菌種O1-5Da、Tz-1、5-20由于菌種遺失導(dǎo)致關(guān)于這3株菌株的試驗無法重復(fù)，故不參與此次試驗后續(xù)的RADP分型分析。供試菌株基本信息見表1。本試驗所用隨機(jī)引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，編號及隨機(jī)引物的序列信息見表2。

表1 供試菌株基本信息（基于16S rDNA序列的分類依據(jù)）Table 1 The basic information of tested strains（identification information were based on 16S rDNA sequences）

表2 隨機(jī)引物序列Table 2 Random primer sequences information

1.1.2 儀器與試劑

AW200SG厭氧工作站：金壇市科技分析儀器有限公司；HW326恒溫水浴鍋：上海一恒科技有限公司；ZHWY-103D恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；BF-2000M氮吹儀：北京八方世紀(jì)科技有限公司；S1000 PCR儀：百樂科技有限公司；JY-600C電泳儀：北京君意東方電泳設(shè)備公司；SC805凝膠成像儀：上海山富科技儀器有限公司；SpectraMax Drop核酸蛋白質(zhì)超微定量系統(tǒng)：美谷分子儀器（上海）有限公司；Allegra 64R高速冷凍離心機(jī)：美國貝克曼庫爾特有限公司；DM3000M顯微鏡：德國徠卡公司。

細(xì)菌DNA快速提取試劑盒：北京艾德萊生物科技有限公司；PCR擴(kuò)增試劑：5×Buffer（含Mg2+）、擴(kuò)增引物、5 U/μL DNA聚合酶：上海擎科生物公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 近似菌株的16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

將田雨思等[22]保藏菌株的16S rDNA序列與LPSN（List of Prokaryotic Names with Standing in Nomenclature）網(wǎng)站標(biāo)準(zhǔn)梭菌屬菌株序列合并在一起進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，使用鄰接法（neighbor-joining method，NJ法）在MEGA 6.0軟件中構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 隨機(jī)引物的篩選方法

從19株供試菌株中選擇4株代表菌種3-3、B2-1、G3-3、G3-5進(jìn)行10種不同隨機(jī)引物的RAPD反應(yīng)，菌株5-20由于菌株遺失，不參與分析。根據(jù)產(chǎn)物電泳后條帶的數(shù)目、亮度、特異性等篩選出適用于分型的隨機(jī)引物。

1.2.3 RAPD擴(kuò)增條件

RAPD反應(yīng)體系：總體積為50 μL，包括5×Buffer（含 Mg2+）10 μL，1 mmol/L dNTPs 1 μL，引物濃度10 nmol/L 5 μL，Taq DNA 聚合酶 1 μL，模板 DNA 1 μL，加無菌水補(bǔ)足至50 μL。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性 1 min，40.2℃退火 1 min，72℃延伸1 min，45個循環(huán)后，72℃延伸10 min。使用3%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電泳條件：110 V，30 min。電泳完成后取出進(jìn)行紫外凝膠成像。

1.2.4 聚類分析方法

根據(jù)電泳圖譜比較不同菌株的擴(kuò)增產(chǎn)物，以100bp DNA Ladder Plus標(biāo)準(zhǔn)條帶為參照，對RAPD成像圖上同一水平的條帶有無進(jìn)行統(tǒng)計，有擴(kuò)增條帶（不論強(qiáng)弱）計為“1”，無條帶計為“0”，建立 0/1矩陣。根據(jù)以上所得0/1矩陣，采用NTsys2.10軟件選擇UPGMA算法進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 近似梭菌菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株間的16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析

供試梭菌在整個梭菌類群中的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖1。

圖1 供試梭菌在整個梭菌類群中的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of tested Clostridium species in the taxonomy system of whole Clostridium group

從整個梭菌系統(tǒng)發(fā)育樹中分析，JL3-1、G3-1、G3-3、G3-5、C2-2、4-30、2-1、2-11、2-24、3-4、3-8 共11株與拜氏梭菌類聚為一類。拜氏梭菌類除了拜氏梭菌外，還包括 C.saccharobutylicum、C.chromiireducens、C.puniceum、C.saccharoperbutylacetonicum，它們間的16S rDNA序列相似度均超過97%以上，因此通過16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹分析很難將與拜氏梭菌等近似的11株菌株鑒定到具體的種級水平；菌株B2-1、F1-1與廣西梭菌（C.guangxiense）近似，廣西梭菌與其近似菌種（C.neuense）在系統(tǒng)發(fā)育樹上被歸為一簇，這2個標(biāo)準(zhǔn)菌株間的16S rDNA序列相似度高達(dá)98.2%；丁酸梭菌（C.butyricum）在系統(tǒng)發(fā)育樹中被單獨歸為一簇，目前還沒有報道序列相似度超過97%的近似菌株，本試驗菌種中的 JL3-4、JL3-5、SZ-1、SZ-2、SZ-8、3-3 被鑒定為丁酸梭菌，但是否存在潛在新種有待進(jìn)一步的驗證。

2.2 最佳擴(kuò)增引物的篩選結(jié)果

隨機(jī)引物篩選的RAPD電泳圖譜見圖2。

圖2 隨機(jī)引物篩選的RAPD電泳圖Fig.2 RAPD electrophoresis of random primer screening

根據(jù)已經(jīng)測序的19株梭菌分類信息，選取5株菌（菌株編號 3-3、5-20、B2-1、G3-3、G3-5） 的基因組DNA作為模板，對上述10個隨機(jī)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由圖2可知，引物U10、T05在本次RAPD反應(yīng)中幾乎沒有雜條帶，且條帶清晰、亮度適合、擴(kuò)增特異性較強(qiáng)。引物C06、W14也有多條比較清晰明亮的條帶。因此，根據(jù)電泳結(jié)果選擇隨機(jī)引物C06、U10、T05和W14進(jìn)行后續(xù)RAPD分型分析。

2.3 RAPD擴(kuò)增結(jié)果及聚類分析

19株供試菌株RAPD擴(kuò)增試驗的結(jié)果見圖3?；赗APD 0/1矩陣構(gòu)建的19株近似梭菌聚類分析圖見圖4。選擇遺傳距離為0.82進(jìn)行聚類，可將上述的19株菌株分為10類，結(jié)果見表3。

表3 供試梭菌的聚類分析Table 3 Cluster analysis of Clostridium tested

圖3 供試梭菌的RAPD電泳圖譜Fig.3 RAPD electrophoresis of tested Clostridium strains

圖4 基于RAPD 0/1矩陣構(gòu)建的19株近似梭菌聚類分析圖Fig.4 Cluster analysis of 19 Clostridium similar strains based on RAPD 0/1 matrix

從圖3可看出4個隨機(jī)引物其PCR擴(kuò)增的條帶數(shù)目在1條～12條之間。其中引物C06和U10擴(kuò)增出的條帶較多，多態(tài)性較好，而引物T05和W14擴(kuò)增出的條帶較亮且較為清晰。同一近似種近似菌株間的RAPD擴(kuò)增存在條帶差異。例如近似于拜氏梭菌的4-30、C2-2 在隨機(jī)引物 C06、T05、U10 的擴(kuò)增中均與其他拜氏梭菌近似菌株有不同的條帶數(shù)目；近似于廣西梭菌的菌株F1-1和B2-1則在4種引物的擴(kuò)增中均存在明顯的差別。后續(xù)根據(jù)條帶有無構(gòu)建的0/1矩陣，運(yùn)用NTSYS2.10軟件進(jìn)行聚類分析，可將上述19株菌株分型為10類。

其中與拜氏梭菌菌群近似的11株菌株可分為6個小類，包括 2-1 類（2-1、2-11、2-24）、4-30 類、C2-2類、G3-1類（G3-1、G3-3）、G3-5類、JL3-1類。與丁酸梭菌菌群近似的6株菌可分為2類，包括3-3類（3-3、SZ-1）、JL3-4 類（JL3-4、JL3-5、SZ-2、SZ-8）。將廣西梭菌近似的2株菌為2類，包括B2-1類、F1-1類。整合16S rDNA序列分析、RAPD分型的分析結(jié)果，可以確定3種菌群中存在新種或亞種的可能性較大。

3 結(jié)論與展望

通過16S rDNA序列分析、RAPD分型，可將實驗室保藏的窖泥來源的19株近似梭菌分為10個小類。其中與拜氏梭菌近似的11株菌可細(xì)分為6類，它們與標(biāo)準(zhǔn)菌株 C.beijerinckii strain ATCC 25752、C.saccharobutylicum strain DSM 13864、C.chromiireducens strain DSM 23318、C.puniceum strain DSM 2619、C.saccharoperbutylacetonicum strain DSM 14923間的遺傳關(guān)系較為接近，但具體遺傳地位較為模糊；與廣西梭菌近似的2株梭菌也要開展它們與C.guangxiense strain BCRC 80950、C.neuense strain BCRC 80949 模式菌株的遺傳關(guān)系的研究；上述菌種是否存在潛在新種有待進(jìn)一步的研究。由于丁酸梭菌未報到近似新種，本次研究的丁酸梭菌菌株存在2個小類，說明窖泥來源的丁酸梭菌內(nèi)存在潛在新種，后續(xù)需要開展它們與C.butyricum strain ATCC 19398模式菌株的遺傳關(guān)系及新種研究。從上述結(jié)果可以看出在白酒窖池內(nèi)可能存在較多未被報道的新種資源，有待更進(jìn)一步的研究。

厭氧梭菌作為近年來窖泥研究熱點，學(xué)者們只能對其中小部分菌株進(jìn)行分離培養(yǎng)，對不可培養(yǎng)的菌株的研究一般采用生物技術(shù)提取窖泥總DNA進(jìn)行宏基因組擴(kuò)增子測序，對窖泥群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。然而現(xiàn)有的宏基因組擴(kuò)增子測序研究中基于16S rDNA序列相似度大于等于97%的都?xì)w為同一可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）的判定可能會低估窖泥微生物種群的多樣性。同樣，對于已經(jīng)鑒定的菌種，如果不對其全基因組進(jìn)行分析，而光依靠16S rDNA相似度作為鑒定依據(jù)很有可能忽略潛在的新種或者亞種，RAPD技術(shù)也是判定此類問題的有效方法之一。