漆酶基因的克隆及其在產(chǎn)朊假絲酵母中的表達(dá)

高娃，其布日，薩初拉，蘇少鋒，吳青海，白蘇樂，呼和*，郁彭 *

（1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院 ，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

農(nóng)作物秸稈是寶貴的生物質(zhì)資源，儲存著大量的養(yǎng)分。充分利用秸稈資源，促進(jìn)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分循環(huán)，是農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的基礎(chǔ)[1]。我國秸稈資源十分豐富，每年農(nóng)作物秸稈的總量達(dá)6億噸以上，但利用率非常低，大量秸稈無法被有效回收，只能就地焚燒，造成了環(huán)境污染和資源浪費，合理的加工處理可以有效提高農(nóng)作物秸稈作為動物飼料原料的利用率[2-3]。造成秸稈飼料利用率低的主要原因是隨著農(nóng)作物的成熟，木質(zhì)化程度增高，秸稈細(xì)胞壁中木質(zhì)素含量也增加。木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，木質(zhì)素和半纖維素形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)存在于植物細(xì)胞壁中，并將纖維素分子包埋在內(nèi)，形成非常復(fù)雜的聚合物，使降解纖維素的酶與纖維素分子接觸困難[4-6]，很難在常規(guī)條件下降解。因此木質(zhì)素被認(rèn)為是限制秸稈有效利用的主要因素。

漆酶屬多銅氧化酶家族[7]，廣泛存在于自然界中，是一種木質(zhì)素降解酶。自然界中，漆酶主要來源于白腐真菌。白腐真菌是食用菌中的一類通過其特殊的酶系統(tǒng)高效降解木質(zhì)素的微生物，將木質(zhì)素降解為CO2和H2O[8]，漆酶在此過程中起了重要作用。然而，自然界中真菌漆酶的產(chǎn)量低、酶活低、純化難、生長周期長，限制了它的應(yīng)用[9-10]。在蛋白質(zhì)表達(dá)體系中，異源宿主高效表達(dá)更能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要。研究者們[11-14]通過漆酶的異源表達(dá)提高漆酶的產(chǎn)量，利用基因工程技術(shù)克隆不同來源的漆酶基因（lac），在不同宿主中異源表達(dá)，雖取得了一些成績，但離理想的工業(yè)化生產(chǎn)還有一定的差距，有待于進(jìn)一步提高酶蛋白的產(chǎn)量。

當(dāng)前廣泛使用的酵母表達(dá)系統(tǒng)有畢赤酵母和釀酒酵母，但各有缺陷。釀酒酵母大量表達(dá)時常常會發(fā)生質(zhì)粒丟失現(xiàn)象；在發(fā)酵中通常有乙醇產(chǎn)生，很難進(jìn)行高密度發(fā)酵。畢赤（甲醇）酵母雖能高表達(dá)、高分泌和高穩(wěn)定[15-16]，但不是食品酵母，誘導(dǎo)時需要加甲醇，無法被部分行業(yè)（食品和飼料）所接受[17]；同時，甲醇耗氧多、產(chǎn)熱大、有毒并且易燃，在工業(yè)生產(chǎn)中需進(jìn)行防爆設(shè)計，導(dǎo)致生產(chǎn)成本增大。與之相比，產(chǎn)朊假絲酵母（Candida utilis，C.utilis）作為基因工程表達(dá)宿主具有很多優(yōu)勢，被食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)證為食品級酵母，可運(yùn)用于食品、飼料及制藥業(yè)[18]；C.utilis在嚴(yán)格好氧條件下不產(chǎn)生乙醇；C.utilis屬多倍體，使用其基因組中重復(fù)序列（rDNA）作為整合載體的同源重組位點，可使外源基因與C.utilis染色體之間發(fā)生多拷貝同源重組[19]。因而C.utilis作為基因工程表達(dá)宿主具有很好的應(yīng)用潛力。到目前，還未見白腐真菌來源的漆酶在C.utilis中異源表達(dá)的相關(guān)報道。

為此，本文從云芝栓孔菌中克隆lac基因，構(gòu)建同源整合表達(dá)載體，以產(chǎn)朊假絲酵母（C.utilis）為宿主構(gòu)建表達(dá)漆酶的基因工程產(chǎn)朊假絲酵母菌，為提高漆酶的產(chǎn)量和開發(fā)降解秸稈中木質(zhì)素的微生物發(fā)酵劑提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 菌株、試劑及培養(yǎng)基

云芝栓孔菌Trametes versicolor（BNCC 145690）：北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司；pBR322質(zhì)粒（3050）：TaKaRa公司；產(chǎn)朊假絲酵母（31395）：中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；E.Z.N.ATMGel Extraction膠回收試劑盒：英國OMEGA公司；BcaBESTTMRNA PCR Kit、酵母總蛋白質(zhì)提取試劑盒、PrimeSTAR GXL DNA Polymerase、載體 pMDTM19-T Vector：TaKaRa 公司；T4 DNA 連接酶、BamHI、SalI-HF、XbaI、NheI-HF、EcoRV、EcoRV-HF等內(nèi)切酶類：Biolabs公司；Lyticase溶壁酶、TIANamp Yeast DNA kit酵母基因組DNA提取試劑盒、TIANprep Midi Plasmid質(zhì)粒小提中量試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基：酵母提取物1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，加蒸餾水定容，121℃15min高壓滅菌，備用。

YPD固體培養(yǎng)基：YPD液體培養(yǎng)基中添加2%的瓊脂粉，滅菌備用。

產(chǎn)酶培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖10，酒石酸銨0.1，KH2PO40.2，MgSO4·7H2O 0.5，MnSO40.035，CuSO4·5H2O 0.007，加水至 1 L，121℃滅菌 20 min。

50 mmol/L的琥珀酸緩沖液（pH4.5）：0.81 g琥珀酸鈉，定容至100 mL水中。稱0.59 g琥珀酸，用配制的琥珀酸鈉將pH值調(diào)至4.5。

0.4 mmol/L的愈創(chuàng)木酚：0.04 mmol（4.5 μL）愈創(chuàng)木酚，用1 mL 95%的乙醇溶解。

1.2 構(gòu)建含lac基因的C.utilis表達(dá)載體

1.2.1 lac基因的克隆

提取云芝栓孔菌中總RNA，以提取的總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）擴(kuò)增，獲得目的基因并與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化提質(zhì)粒，得到重組質(zhì)粒。引物序列（5’-3’）如下。

Lac-R1：CAACATGTCGAGGTTTCACTCTC

Lac-R2：CCATTTACTGGTCGCTGGGGT

1.2.2 酵母三磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子和終止子片段的克隆

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中C.utilis的GAP-p和GAP-t基因序列結(jié)合pBR322質(zhì)粒序列特征設(shè)計引物，以C.utilis基因組為模板，經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增獲得酵母三磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene-prompter，GAP-p） 片段和終止子（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene-terminator，GAP-t）片段，將目的片段 GAP-p、GAP-t分別連接至載體pMD19-T simple vector，得質(zhì)粒載體pTGP、pT-GT，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，陽性克隆進(jìn)行鑒定并保存?zhèn)溆?。引物序列?’-3’）如下。

啟動子：GAP-p1：GGATATCTTACAGCGAGCACTCAA

GAP-p2：GCTCTAGAATGTTGTTTGT

終止子：GAP-t1：CTAGCTAGCTATGACTTTTAT

GAP-t2：GGGATCCTTCATTCATCCCTCACTATCG

1.2.3 放線菌酮（cycloheximide，CYH）抗性基因的克隆

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中C.utilis的CYH敏感基因（L41）序列結(jié)合pBR322質(zhì)粒序列特征設(shè)計一對引物P4/RM4，和1對反向互補(bǔ)引物P5/R5；以C.utilis基因組為模板，PCR擴(kuò)增出L41上游片段和下游片段（兩片段的一端具有堿基重疊區(qū)）；以此上游片段、下游片段等量混合為模板，進(jìn)行套疊PCR，即獲得CYH抗性基因；將目的片段連接至載體pMD19-T simple vector上得到質(zhì)粒載體pT-CYH，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，陽性克隆鑒定并保存?zhèn)溆?。引物序列?’-3’）如下。

L41：P4：CGTCGACAGTAAGTATGAAAAGAGC

RM4：GGGATCCGG GTTTGGTCTATGTTGCT

mL41：P5：AACCAAGCAAGTTTTCCAC

R5：GTGGAAAACTTGCTTGGTT

1.2.4 18S rDNA基因片段的克隆

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中C.utilis的18S rDNA基因序列結(jié)合pBR322質(zhì)粒序列特征設(shè)計引物P3/R3，以C.utilis基因組為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得18S rDNA片段，將目的片段連接至載體pMD19-Tsimple vector上獲得質(zhì)粒載體pT-rD，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，陽性克隆進(jìn)行鑒定并保存?zhèn)溆谩Ｒ镄蛄校?’-3’）如下（18SrDNA基因片段）。

P3：CGATATCTGCCAGTAGTCATATGC

R3：CGATATCTGACTTGCGCTTACTAG

1.2.5 重組表達(dá)載體的構(gòu)建

提取pT-GP、pT-GT和pBR322質(zhì)粒，分別用EcoRV/XbaI，XbaI/BamHI和 EcoRV/BamHI酶進(jìn)行酶切，回收目的片段，用T4 DNA連接酶將這3個片段同時連接，獲得質(zhì)粒pBR-GAP；提取pT-CYH和pBRGAP質(zhì)粒，分別用BamHI/SalI酶酶切，回收目的片段，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，獲得質(zhì)粒pBR-G-L；提取pBR-G-L質(zhì)粒和lac基因重組質(zhì)粒，分別用XbaI/NheI酶酶切，回收目的片段，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，獲得質(zhì)粒pGQL；提取pT-rD和pGQL質(zhì)粒，分別采用EcoRV-HF酶酶切，回收目的片段，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接，獲得含lac基因的重組表達(dá)載體pGQLR。

1.3 刪除來自原核微生物的DNA序列

以pGQLR載體為模板進(jìn)行引物設(shè)計，將片段序列分為兩個片段，通過重疊延伸PCR試驗技術(shù)[20]刪除來自原核的DNA序列（包括抗藥性標(biāo)記Amp在內(nèi)的細(xì)菌質(zhì)粒序列的DNA片段）。重疊延伸PCR試驗引物序列（5’-3’）如下。

P1-1S：CATGGTGGCAACGGGTAACGGGG

P1-1AS：GCATATGACTACTGGCAAGTAAGTATGAAAAGAGCCAAT

P2-1S：ATTGGCTCTTTTCATACTTACTTGCCAGTAGTCATATGC

P2-1AS：TGGTAGGCCACTATCCTACCATCGACAGTTGATAG

1.4 電轉(zhuǎn)化C.utilis和轉(zhuǎn)化子PCR鑒定

將已刪除來自原核的DNA序列的整合表達(dá)載體電轉(zhuǎn)化至C.utilis，構(gòu)建工程菌株，命名為ZHQX1。

電轉(zhuǎn)化操作在Raymond等[21]的方法基礎(chǔ)上做了一些改良。酵母轉(zhuǎn)化子提基因組，采用引物L(fēng)ac-F1+1/Lac-R1+1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，鑒定lac基因是否整合到C.utilis染色體DNA上。引物序列（5’-3’）如下。

Lac-F1+1：GCTCTAGAATGTCGAGGTTTCACTCTCTT

Lac-R1+1：CTAGCTAGCTTACTGGTCGCTGGGG

1.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）驗證

1.6 轉(zhuǎn)化子的穩(wěn)定性試驗

將工程菌ZHQX1用未添加CYH的YPD液體培養(yǎng)基進(jìn)行接種傳代培養(yǎng)后，選取培養(yǎng)第1天和第15天的菌液提取酵母基因組，采用PCR檢測目的基因，測定外源基因遺傳穩(wěn)定性。

每次轉(zhuǎn)接酵母的繁殖世代計算公式[22]為（lgN-lg0.1）/lg2。

1.7 漆酶的表達(dá)檢測

分別取150 μL原始菌-云芝栓孔菌和工程菌ZHQX1于10 mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，28℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期。分別在 24、48、72、96、192 h 時取菌液，7 200 r/min離心10 min，取上清液進(jìn)行酶活測定。

漆酶的酶活測定：采用愈創(chuàng)木酚法。

緩沖溶液常用琥珀酸鈉溶液（pH4.5），終濃度為50 mmol/L。底物愈創(chuàng)木酚的終濃度0.4 mmol/L，反應(yīng)溫度30℃，反應(yīng)時間30 min，測定465 nm處OD值變化。

以100℃煮2 min～5 min的酶液為對照進(jìn)行試驗。酶活計算公式如下。

式中：V 為反應(yīng)體積，mL；t為反應(yīng)時間，min；Va為酶液體積，mL；ε為消光系數(shù)，9.3×103mol/（L·cm）。

2 結(jié)果與分析

2.1 lac基因的克隆

以提取自云芝栓孔菌總RNA為模板，采用BcaBESTTMRNA PCR Kit Ver.1.1進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測，結(jié)果見圖1。

圖1 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Results of RT-PCR product

如圖1所示，在1 000 bp～2 000 bp間擴(kuò)增出的條帶大小符合lac基因的預(yù)期值（約為1 500 bp）。

收集實驗組新輔助放化療后患者的治療效果、臨床分期變化情況及不良反應(yīng)情況；收集并分析兩組患者的手術(shù)切除率、保肛率、術(shù)后并發(fā)癥及預(yù)后(生活質(zhì)量及生存情況)。

圖4 CYH基因的克隆結(jié)果Fig.4 The PCR result of CYH gene fragment

2.2 酵母三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子和終止子片段、放線菌酮（CYH）抗性基因和18S rDNA基因片段的克隆

以C.utilis基因組為模板，用相應(yīng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得酵母GAP啟動子（GAP-p）片段、酵母GAP終止子（GAP-t）片段、放線菌酮（CYH）抗性基因和18S rDNA基因片段，結(jié)果如圖2～圖5所示。

圖2 GAP-p序列的克隆結(jié)果Fig.2 The PCR result of GAP-p fragment

從圖2～圖5可見，擴(kuò)增出的條帶大小與目的片段大小一致。

圖5 18S rDNA基因片段的克隆結(jié)果Fig.5 The PCR result of 18S rDNA fragment

2.3 同源整合載體pGQLR的構(gòu)建

整合載體pGQLR以pBR322為骨架載體，采用酶切連接法從3′端到5′端依次連接18S rDNA基因片段、酵母三磷酸甘油醛脫氫酶基因啟動子序列GAP-p、lac基因、酵母三磷酸甘油醛脫氫酶基因終止子序列GAP-t和放線菌酮（CYH）抗性基因。提質(zhì)粒后，采取酶切和PCR方法進(jìn)行驗證。整合載體pGQLR的構(gòu)建結(jié)果見圖6。

圖3 GAP-t序列的克隆結(jié)果Fig.3 The PCR result of GAP-t fragment

圖6 載體pGQLR的構(gòu)建Fig.6 Consruction of the vector pGQLR

此同源整合表達(dá)載體命名為pGQLR。

2.4 轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定

膠回收重疊延伸PCR試驗產(chǎn)物，將線性化的質(zhì)粒在1.5 kV、25 uF、200 Ω條件下進(jìn)行電轉(zhuǎn)化至C.utilis。轉(zhuǎn)化液離心濃縮后，全部涂在YPD固體平板（YPD+PTT+CYH）上，28℃、避光培養(yǎng)2 d～3 d后開始統(tǒng)計和挑取轉(zhuǎn)化子。提取轉(zhuǎn)化子的基因組，以其為模板，用特性引物L(fēng)ac-F1+1和Lac-R1+1進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見圖7。

從圖7可見，挑取的6個克隆擴(kuò)增出的條帶均與lac基因大小一致，說明lac基因成功整合到C.utilis染色體DNA上。

圖7 轉(zhuǎn)化子ZHQX1的PCR鑒定Fig.7 PCR Identification of ZHQX1

2.5 SDS-PAGE驗證

經(jīng)PCR鑒定為陽性的克隆進(jìn)行培養(yǎng)，采用Yeast Protein Extraction Reagent試劑盒提取蛋白質(zhì)，SDSPAGE法進(jìn)一步鑒定，結(jié)果見圖8。

圖8 SDS-PAGE法檢測ZHQX1蛋白的結(jié)果Fig.8 SDS-PAGE analysis of proteins secreted by ZHQX1

由圖8可見，在55 kDa～70 kDa之間有明顯的條帶，與lac基因的蛋白分子量一致。說明lac基因已經(jīng)整合到C.utilis的染色體DNA上。

2.6 轉(zhuǎn)化子的穩(wěn)定性試驗

提取工程菌ZHQX1的基因組DNA，通過目的基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖9所示。

由圖9可見，在連續(xù)傳代100世代時仍含有目的條帶，表明外源基因沒有丟失，目的基因穩(wěn)定存在，在傳代培養(yǎng)過程中保持了較高的遺傳穩(wěn)定性。

2.7 漆酶的表達(dá)檢測

不同培養(yǎng)時期云芝栓孔菌和ZHQX1的菌液，取上清做酶活測定，結(jié)果見表1。

表1 工程菌ZHQX1的酶活測定結(jié)果Table 1 Determination of enzyme activity of recombinant ZHQX1 U/L

從表1可看出，選取5個時間段取樣測定工程菌漆酶酶活。在培養(yǎng)的前2 d原始菌的酶活為0。隨著培養(yǎng)時間的延長，工程菌的漆酶酶活逐步升高，酶活在第96小時達(dá)到最高值1 078.9 U/L，是同時期原始菌—云芝栓孔菌酶活的4.8倍，在72 h的酶活是原始菌酶活的10倍。

3 結(jié)論與展望

本研究從白腐真菌—云芝栓孔菌中克隆了lac基因，用酶切連接法在pBR322載體的基礎(chǔ)上從3′端到5′端依次連接18S rDNA基因片段、酵母三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子序列GAP-p、lac基因、酵母三磷酸甘油醛脫氫酶終止子序列GAP-t和放線菌酮（CYH）抗性基因，構(gòu)建了含有l(wèi)ac基因的同源整合表達(dá)載體pGQLR。該載體的全部遺傳元件均來自食品級酵母（C.utilis）和無毒無害的真菌（云芝栓孔菌），不攜帶抗生素抗性基因，不存在抗性基因的漂移、擴(kuò)散及整合，也不攜帶其他有毒蛋白基因，不會對環(huán)境或人和動物帶來生物安全性的危害。采用重疊延伸PCR試驗技術(shù)刪除同源整合表達(dá)載體中來自原核的DNA序列后電轉(zhuǎn)化至C.utilis中，構(gòu)建了表達(dá)漆酶的食品級基因工程菌ZHQX1。

ZHQX1在連續(xù)傳代100世代時仍含有目的條帶，表明外源基因沒有丟失，在傳代培養(yǎng)過程中保持了較高的遺傳穩(wěn)定性；培養(yǎng)96 h時，ZHQX1的漆酶酶活是同時期原始菌-云芝栓孔菌的漆酶酶活的4.8倍，達(dá)到1 078.9 U/L。

已知白腐真菌分泌幾種與木質(zhì)素降解相關(guān)的酶，即木質(zhì)素過氧化物酶、漆酶、錳過氧化物酶、多功能過氧化物酶和多種輔助酶。多數(shù)分泌1種～2種降解木質(zhì)素的酶，也有少數(shù)白腐菌可分泌3種降解木質(zhì)素的酶[23]，表明木質(zhì)素的降解過程中主要以多種木質(zhì)素降解酶協(xié)同作用完成的。因此，下一步還需構(gòu)建表達(dá)木質(zhì)素過氧化物酶、錳過氧化物酶、多功能過氧化物酶的工程菌，并進(jìn)行工程菌優(yōu)化組合研究；還可以通過優(yōu)化酶基因關(guān)鍵調(diào)控元件（提高啟動子強(qiáng)度、優(yōu)化信號肽），改造和優(yōu)化工程菌代謝通路等研究來進(jìn)一步提高酶蛋白產(chǎn)量。