超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測咖啡中黃曲霉毒素和雜色曲霉素

李碩，李莉

（1.中國計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100029；2.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050）

黃曲霉毒素（aflatoxin，AFTs）是黃曲霉、寄生曲霉等真菌產(chǎn)生的一類結(jié)構(gòu)相似的次生代謝產(chǎn)物[1]。目前已有報(bào)道的黃曲霉毒素有20余種，其中研究最多的主要有黃曲霉毒素B1（aflatoxin B1，AFB1），黃曲霉毒素B2（aflatoxin B2，AFB2），黃曲霉毒素G1（aflatoxin G1，AFG1）和黃曲霉毒素 G2（aflatoxin G2，AFG2）[2-3]。雜色曲霉素（sterigmatocystin，STG）是 AFB1、AFG1等的合成前體物質(zhì)[4]，結(jié)構(gòu)與黃曲霉毒素極為相似，都含有雙呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)。毒理學(xué)試驗(yàn)表明[5-6]：黃曲霉毒素和雜色曲霉素都具有肝毒性和免疫抑制效應(yīng)，可誘發(fā)肝癌等癌癥疾病。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）將黃曲霉毒素B1列為1級致癌物，雜色曲霉毒素列為2B級致癌物[7]?？Х仁鞘澜缛箫嬃现?，在我國飲料消費(fèi)市場中所占份額逐年提升。真菌毒素污染作為影響咖啡質(zhì)量安全的關(guān)鍵風(fēng)險(xiǎn)因素之一，越來越受到人們的關(guān)注。目前，在咖啡產(chǎn)品中，赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）是唯一受到法規(guī)監(jiān)管的真菌毒素，我國食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2761規(guī)定了研磨咖啡（烘焙咖啡）和速溶咖啡中赭曲霉毒素A的最高限量要求[8]。其它對人體具有潛在致癌性卻尚未被納入監(jiān)管視線中的真菌毒素則很容易被忽視。根據(jù)國外研究報(bào)道[9-10]，咖啡生豆和烘焙咖啡豆中也可能受到黃曲霉毒素、雜色曲霉素和展青霉素的污染。目前國內(nèi)有關(guān)咖啡類產(chǎn)品中黃曲霉毒素和雜色曲霉素的研究和報(bào)道均較少，開展咖啡中黃曲霉毒素和雜色曲霉素的檢測方法的研究，有利于對咖啡中真菌毒素污染水平進(jìn)行監(jiān)測，為咖啡中真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供技術(shù)和數(shù)據(jù)支持。

液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)以其卓越的靈敏度、準(zhǔn)確性和選擇性，現(xiàn)已廣泛用于不同食品基質(zhì)中黃曲霉毒素和雜色曲霉素的分析檢測[11-16]。QuEChERS（quick，easy，cheap，effective，rugged，safe）技術(shù)早期應(yīng)用于食品中農(nóng)藥殘留的測定，由于該技術(shù)快捷、簡便、高效和綠色環(huán)保，目前已迅速推廣到食品檢測的其他領(lǐng)域[17-23]。QuEChERS與固相萃?。╯olid-phase extraction，SPE）的原理相似，都是利用填料與基質(zhì)中的干擾物質(zhì)結(jié)合從而達(dá)到吸附除雜的效果，和SPE相比操作更加簡單快捷，適用范圍也更廣。本研究將超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)與QuEChERS樣品前處理技術(shù)相結(jié)合，開發(fā)出咖啡中黃曲霉毒素和雜色曲霉素的分析方法，實(shí)現(xiàn)了批量樣品的快速篩查和定量檢測，為開展咖啡中多種真菌毒素的污染水平監(jiān)測提供有力的技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

AFB1、AFB2、AFG1和 AFG2混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（各化合物質(zhì)量濃度為 10 μg/mL）、STG 標(biāo)準(zhǔn)溶液（10 μg/mL）：青島普瑞邦生物工程有限公司；乙腈（色譜純）：德國Merck公司；甲酸（質(zhì)譜級）：美國Fisher Scientific公司；氯化鈉、無水硫酸鎂（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；SHIMADZU WondaPakQuEChERS凈化管（2 mL，25 mg PSA，25 mg C18，150 mg MgSO4）：日本島津公司；LUMTECH MPFC-QuEChERS超濾型凈化柱（適用于復(fù)雜基質(zhì)）：北京綠綿科技有限公司；Waters PRiME HLB凈化柱（60 g/3 mL）：美國Waters公司；試驗(yàn)用水均為超純水；咖啡豆、咖啡粉、速溶咖啡、濃縮咖啡：市售。

1.2 儀器與設(shè)備

LC20AD超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀：日本島津公司；AL 204型電子天平：瑞士梅特勒-托利多公司；Advance RO+Pro VF超純水純化系統(tǒng)：德國Sartorius公司；KQ-3200DE超聲波清洗器：江蘇昆山市超聲儀器有限公司；Vortex Genie 2型渦旋混勻器：美國Scientific Industries公司；GTR21-1B型醫(yī)用離心機(jī)：北京新時(shí)代北利醫(yī)療器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

精密稱取2.5 g（精確至0.000 1 g）咖啡粉樣品（咖啡豆需事先研磨成粉）或液體咖啡樣品于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈混合提取液（乙腈∶水∶甲酸=70∶25∶5，體積比），旋渦混勻 30 s后，在室溫（25℃）下超聲提取30 min。隨后向離心管中加入1 g氯化鈉和4 g無水硫酸鎂，劇烈振搖1 min，經(jīng)8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min。移取1 mL上清液過 SHIMADZU Wonda－PakQuEChERS凈化管凈化，經(jīng)0.22 μm聚四氟乙烯針頭濾器過濾，濾液待上機(jī)測定。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

分 別 準(zhǔn) 確 移 取 1 mL AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和STG標(biāo)準(zhǔn)溶液置于10 mL棕色容量瓶中，用50%的乙腈水溶液稀釋，定容后搖勻，配制成各組分質(zhì)量濃度為1 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)混合儲備溶液。移取1 mL標(biāo)準(zhǔn)混合儲備溶液置于10 mL棕色容量瓶中，用50%的乙腈水溶液稀釋并定容，配制成各組分質(zhì)量濃度為100 μg/L的混合中間標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-20℃避光保存。

1.3.3 基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

稱取不含5種真菌毒素的咖啡粉空白基質(zhì)，按照試驗(yàn)方法進(jìn)行樣品前處理，得空白基質(zhì)提取溶液，用空 白 基 質(zhì) 提 取 溶 液 配 制 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和STG 質(zhì)量濃度分別為 1、2、5、10、15、20 μg/L 的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：安捷倫Infinity Poroshell 120SB-C18（100 mm×2.1 mm，2.7 μm）；流動相：A為水（含有0.1%甲酸），B為乙腈（含有 0.1%甲酸）；流速：0.3 mL/min；柱溫：40℃，進(jìn)樣量：5 μL。梯度洗脫程序：0～1 min，10%～20%B；1 min～9 min，20%～40%B；9 min～12 min，40%～95%B；12 min～14 min，95%B；14.1 min～16 min，10%B。

1.3.5 質(zhì)譜條件

離子源：采用電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI），正離子掃描；檢測模式為多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）模式；接口溫度為300℃，接口電壓為4.0 kV；霧化為氮?dú)?，氣流量? L/min，干燥氣為氮?dú)?，流量?0 L/min，加熱氣為氮?dú)?，流量?0 L/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別將質(zhì)量濃度為 50 μg/L 的 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和STG標(biāo)準(zhǔn)溶液注入質(zhì)譜儀，在正、負(fù)2種離子模式下進(jìn)行一級質(zhì)譜掃描。對比各化合物母離子在正、負(fù)離子模式的響應(yīng)可知，5種化合物均在正離子模式下有更高的響應(yīng)，因此選擇正離子掃描模式進(jìn)行下一步優(yōu)化。對5種化合物的[M+H]+母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，并在多反應(yīng)監(jiān)測模式下優(yōu)化電壓和碰撞能，選擇響應(yīng)強(qiáng)度最高的2個(gè)子離子作為定性和定量離子。優(yōu)化后的 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和 STG 的母離子、子離子及質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和 STG 的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of AFB1，AFB2，AFG1，AFG2and STG

2.2 色譜條件的優(yōu)化

試驗(yàn)對比了AglientPoroshell 120SB-C18柱（2.1 mm×100 mm，2.7 μm）、Waters BEH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）和 Waters HSS T3（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）柱對于5種化合物的分離效果，研究發(fā)現(xiàn)Aglient－Poroshell 120 SB-C18柱由于填料為實(shí)心核殼顆粒，相比傳統(tǒng)化的全多孔顆粒具有更窄的粒徑分布，能夠提高柱效和分離度并降低柱壓，對于AFB2、AFG1的分離效果要明顯好于另外兩款色譜柱。因此選用Aglient－Poroshell 120 SB-C18柱作為分析柱，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和STG的質(zhì)譜總離子流圖（total ion chromatography，TIC）如圖 1 所示。

圖1 黃曲霉毒素和雜色曲霉素TIC圖Fig.1 Total ion chromatography of aflatoxins and sterigmatocystin

2.3 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1 提取溶劑優(yōu)化

乙腈和甲醇是食品中真菌毒素最常用的提取溶劑。乙腈具有沉淀蛋白的作用，對于咖啡這類油脂和蛋白質(zhì)較豐富的樣品具有更好的選擇性，因此本試驗(yàn)采用乙腈作為提取溶劑。對于咖啡粉樣品，提取溶液中有水存在時(shí)，有利于乙腈向基質(zhì)內(nèi)部的滲透，從而提高提取效率。此外，提取體系中加入無機(jī)鹽可以促進(jìn)乙腈與油相和水相分層，降低雜質(zhì)在乙腈中的溶解度，起到初步凈化的效果。本試驗(yàn)以不含5種真菌毒素的咖啡粉為空白基質(zhì)，通過加標(biāo)試驗(yàn)并計(jì)算加標(biāo)回收率的方式，考察了5種提取溶劑（1：乙腈和水體積比為70∶30；2：乙腈和水體積比為 80∶20；3：乙腈和水體積比為 90∶10；4：乙腈、水、甲酸體積比為 70∶25∶5；5：乙腈、水、甲酸體積比為70∶20∶10）對目標(biāo)化合物回收率的影響，試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2結(jié)果表明，用乙腈和水作為提取溶劑時(shí)AFG1、AFG2回收率較低，但當(dāng)提取溶劑中加入5%的甲酸后，AFG1、AFG2的回收率有了明顯的提高，加入少量的甲酸可以提高AFG1、AFG2的提取效率，但是酸度過高，5種目標(biāo)化合物的回收率都明顯降低。綜合考慮5種化合物的回收率結(jié)果，最終選擇乙腈-水-甲酸溶液（體積比為 70∶25∶5）作為提取溶劑。

圖2 提取溶劑對提取率的影響Fig.2 The effect of extracting solvents on recoveries of aflatoxins and sterigmatocystin

2.3.2 凈化方式優(yōu)化

試驗(yàn)考察了3種含不同填料的QuEChERS樣品凈化方式（A：SHIMADZU WondaPak QuEChERS凈化管；B：LUMTECH MPFC-QuEChERS 超濾型凈化柱；C：Waters PRiME HLB凈化柱）對5種真菌毒素提取回收率的影響，結(jié)果見圖3。

圖3 凈化方式對提取率的影響Fig.3 The effect of clean-up methods on recoveriesof aflatoxins and sterigmatocystin

圖3試驗(yàn)結(jié)果表明，采用SHIMADZU WondaPak QuEChERS凈化管凈化的回收率要高于其他兩種凈化方式，5種化合物的回收率為69.5%～110.6%，滿足食品理化檢測的試驗(yàn)要求。

2.4 線性關(guān)系考察

基質(zhì)效應(yīng)是影響質(zhì)譜檢測結(jié)果準(zhǔn)確性的重要因素之一，目前常用的補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)影響的方法有同位素內(nèi)標(biāo)法和基質(zhì)匹配校正曲線法[24-25]。同位素內(nèi)標(biāo)價(jià)格昂貴，不易獲得，因此本試驗(yàn)采取基質(zhì)校正曲線法進(jìn)行定量測定。分別將1.3.3中的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液注入質(zhì)譜儀進(jìn)行測定，以目標(biāo)物質(zhì)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。以加標(biāo)基質(zhì)樣品中各化合物色譜峰響應(yīng)的3倍信噪比計(jì)算檢出限（limit of detection，LOD）、10 倍信噪比計(jì)算定量限（limit of quantity，LOQ）?？Х戎悬S曲霉毒素和雜色曲霉素的相關(guān)技術(shù)指標(biāo)見表2。

表2 咖啡樣品中黃曲霉毒素和雜色曲霉素的線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 2 Linear ranges，correlation coefficients，LODs and LOQs of aflatoxins and sterigmatocystinin coffee samples

表2結(jié)果顯示，5種真菌毒素含量在1 μg/L～20 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，各真菌毒素的相關(guān)系數(shù)均大于0.99。

2.5 加標(biāo)回收率

分別向不含5種真菌毒素的咖啡粉空白基質(zhì)中添加 3 個(gè)濃度水平（2、10、20 μg/kg）的 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和STG混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收率測定，每個(gè)添加水平制備6個(gè)平行樣品上機(jī)檢測。計(jì)算5種真菌毒素的平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviations，RSD），結(jié)果見表 3。

表3 咖啡樣品中黃曲霉毒素和雜色曲霉素回收率（n=6）Table 3 Recoveries of aflatoxins and sterigmatocystin in coffee samples（n=6）

由表3可知，咖啡中5種真菌毒素的平均回收率為88.2%～119.0%，RSD為1.9%～13.2%，說明該方法準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性良好，可以滿足日常檢測的要求。對于添加質(zhì)量濃度水平2 μg/kg的回收率來說，5種真菌毒素的加標(biāo)回收率RSD均高于添加質(zhì)量濃度水平10 μg/kg和20 μg/kg的回收率RSD，原因可能是咖啡樣品基質(zhì)復(fù)雜，在待測化合物含量處于較低水平時(shí)，樣品基質(zhì)效應(yīng)相對被放大，其產(chǎn)生的背景噪音對樣品中待測物質(zhì)的質(zhì)譜響應(yīng)干擾較為顯著；當(dāng)待測溶液中待測化合物含量處于較高水平時(shí)，樣品基質(zhì)效應(yīng)產(chǎn)生的背景噪音相對于待測物質(zhì)的質(zhì)譜響應(yīng)影響減弱。

2.6 實(shí)際樣品測定

為了監(jiān)測市售咖啡中黃曲霉毒素和雜色曲霉素的污染水平，本試驗(yàn)從咖啡店、超市及網(wǎng)絡(luò)購物平臺等渠道購買了50批咖啡，涵蓋了烘焙咖啡豆、研磨咖啡粉、掛耳咖啡粉、膠囊咖啡粉、速溶咖啡粉和濃縮咖啡糖漿等主要樣品形態(tài)，包括了市場上主流品牌在內(nèi)的20多個(gè)咖啡品牌。應(yīng)用本試驗(yàn)建立的方法對市售的50批咖啡樣品進(jìn)行了檢測，50批咖啡樣品中均未檢出 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和 STG，表明我國市售咖啡中黃曲霉毒素和雜色曲霉素污染水平較低。

3 結(jié)論

本研究采用QuEChERS技術(shù)進(jìn)行樣品的前處理，并結(jié)合UPLC-MS/MS檢測技術(shù)，建立了咖啡中4種黃曲霉毒素（AFB1、AFB2、AFG1和 AFG2）和雜色曲霉素的快速篩查方法，該方法操作簡便，具有良好的選擇性和靈敏度，適用于咖啡中黃曲霉毒素和雜色曲霉素的定性確證與定量檢測。