靈芝菌粗酶液緩解糙米老化的條件優(yōu)化

馬譽(yù)暢，崔美林

（山西師范大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030031）

糙米是稻谷脫殼后不加工或較少加工所獲得的全谷粒米，由米糠、胚和胚乳3大部分組成。與成品大米相比，糙米不僅含有更多的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，同時(shí)還富含膳食纖維、谷維素、谷胱甘肽、γ-氨基丁酸、米糠多糖、二十八烷醇、肌醇等多種功能因子，具有極高的功能價(jià)值[1]。因此，在追求均衡營(yíng)養(yǎng)、健康生活的現(xiàn)階段，糙米的利用越來(lái)越受人們的關(guān)注。但是作為富含淀粉的谷物類，糙米與其他谷物一樣存在淀粉易老化問(wèn)題，老化后的淀粉，不僅口感變差，消化吸收率也隨之降低，降低了其感官品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，最終導(dǎo)致糙米食用價(jià)值明顯下降[2]。因此，緩解淀粉老化是糙米擴(kuò)大應(yīng)用亟需解決的關(guān)鍵問(wèn)題。目前多采用添加糖類[3]、乳化劑[4]、親水膠體[5]及酶水解法[6]來(lái)減緩淀粉老化問(wèn)題，其中酶解作用效果顯著且高效無(wú)污染，逐漸成為緩解淀粉老化的主要方式之一[7]。在對(duì)糯米、米粉、馬鈴薯淀粉、饅頭等的淀粉抗老化研究中發(fā)現(xiàn)，β-淀粉酶、α-淀粉酶、纖維素酶、酸性蛋白酶和木聚糖酶均可以緩解淀粉老化[8-12]；此外，利用纖維素酶和酸性蛋白酶分解麩皮或麩質(zhì)蛋白質(zhì)，將其分解產(chǎn)物加入淀粉質(zhì)食品中，同樣能起到很好的抗老化作用，證明了此類分解產(chǎn)物亦具有抑制淀粉老化的效果[13]。

靈芝菌為擔(dān)子菌綱多孔菌科靈芝屬真菌，是我國(guó)名貴的藥用真菌和新資源食品，有“益心氣，助心充脈，安神，益肺氣”等功效，具有重要的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值[14]。同時(shí)，靈芝菌在發(fā)酵過(guò)程中可產(chǎn)生多種酶類，具備緩解淀粉老化的潛力。本文主要對(duì)靈芝菌發(fā)酵過(guò)程中的抗老化相關(guān)酶進(jìn)行測(cè)定，并利用菌絲胞內(nèi)酶液緩解糙米老化，以期為糙米的廣泛應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種與材料

靈芝菌株（赤芝，Ganoderma lucidum）：中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心；糙米：市售。

1.1.2 主要試劑

瓊脂、蛋白胨、酵母浸粉：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；麥芽浸粉、VB1、3，5-二硝基水楊酸、木聚糖、福林（Folin）、乳酸鈉、木糖、檸檬酸三鈉、麥芽糖、酪蛋白、L-酪氨酸（純度≥99%）：北京索萊寶科技有限公司；磷酸二氫鉀、硫酸鎂、可溶性淀粉、葡萄糖、乙酸鈉、碳酸鈉、鹽酸、氫氧化鈉、檸檬酸、乳酸：天津光復(fù)精細(xì)化工研究所；三氯乙酸、乙酸、無(wú)水乙醇：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；以上試劑均為分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備

ZHY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；LS-50HD立式壓力蒸汽滅菌器：江陰濱江醫(yī)療設(shè)備有限公司；DPX-9052B-2電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SW-CJ-2D型凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；JY92-IIDN超聲波細(xì)胞破碎儀：寧波新芝生物科技股份有限公司；SHA-C水浴恒溫振蕩器：金壇市榮華儀器制造有限公司；752N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海儀電分析儀器有限公司；RVA-TecMaster快速黏度分析儀：瑞典波通儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基

斜面及平板培養(yǎng)基：馬鈴薯1%，葡萄糖2%，KH2PO40.3%，MgSO40.15%，VB10.005%，瓊脂2%。121℃濕熱滅菌20 min，VB1過(guò)濾除菌。

種子液培養(yǎng)基：馬鈴薯1%，葡萄糖2%，KH2PO40.3%，MgSO40.15%，VB10.005%，pH值5.5。121℃濕熱滅菌 20 min，VB1過(guò)濾除菌。

發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母浸粉1.8%，麥芽浸粉2%，KH2PO40.3%，MgSO40.15%，VB10.005%，pH6。121℃濕熱滅菌20 min，VB1過(guò)濾除菌。

1.2.2 菌株培養(yǎng)

經(jīng)斜面培養(yǎng)后，取4塊～5塊1 cm×1 cm菌絲小塊接種于100 mL種子液培養(yǎng)基中，28℃、180 r/min條件下培養(yǎng)5 d即得靈芝種子液（取10 mL發(fā)酵5 d的種子液，離心后，當(dāng)菌絲濕重達(dá)到0.3g左右，即為種子液發(fā)酵終點(diǎn)）。然后按10%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，于28℃、180 r/min下培養(yǎng)。

1.2.3 靈芝菌發(fā)酵胞外粗酶液制備

發(fā)酵完成后，取靈芝發(fā)酵液于5 000×g，4℃下離心15 min，上層液體即為胞外粗酶液。

1.2.4 靈芝菌發(fā)酵胞內(nèi)粗酶液制備

發(fā)酵完成后，將菌株發(fā)酵液于5 000×g，4℃下離心15 min，收集菌絲沉淀，并用蒸餾水洗滌、離心，重復(fù)3次。按1∶60（g/mL）比例加入蒸餾水并用細(xì)胞破碎儀破碎菌絲，將所得勻漿液于5000×g，4℃下離心15min，上層液體即為胞內(nèi)粗酶液。

1.2.5 酶活力測(cè)定

α-淀粉酶酶活力（Uα-淀粉酶）測(cè)定：采用李合生[15]的方法進(jìn)行測(cè)定并稍加修改，即于65℃鈍化β-淀粉酶[16-17]。測(cè)得麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.6333x+0.0349，R2=0.9999。酶活力的定義：1 mL酶液反應(yīng)1 min產(chǎn)生相當(dāng)于1 μg麥芽糖的酶量，為1個(gè)酶活力單位，以U表示。

β-淀粉酶酶活力（Uβ-淀粉酶）測(cè)定：參照李合生[15]的方法并稍加修改。取待測(cè)酶液于40℃水浴中預(yù)熱10 min，采用 3，5-二硝基水楊酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）法測(cè)定α-淀粉酶 +β-淀粉酶酶活力（U（α+β）-淀粉酶），β-淀粉酶酶活力按照公式（1）計(jì)算。

纖維素酶酶活力測(cè)定：參照文獻(xiàn)[18]的方法進(jìn)行測(cè)定。測(cè)得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.5551x+0.028 7，R2=0.998 3。酶活力的定義：1 mL酶液反應(yīng)1 min產(chǎn)生相當(dāng)于1 μg葡萄糖的酶量，為1個(gè)酶活單位，以U表示。

酸性蛋白酶酶活力測(cè)定：靈芝菌發(fā)酵過(guò)程中pH值會(huì)迅速下降至4.0左右，該條件下所得蛋白酶即為酸性蛋白酶[14]，其測(cè)定參照Guo等[19]方法。測(cè)得L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.006 7x+0.010 3，R2=0.998 1。酶活力的定義：1 mL酶液1 min反應(yīng)產(chǎn)生相當(dāng)于1 μg酪氨酸的酶量，為1個(gè)酶活單位，以U表示。

木聚糖酶酶活力測(cè)定：參照Bailey等[20]的方法進(jìn)行測(cè)定。木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.136 8x-0.031 9，R2=0.997 2。酶活力的定義：1 mL酶液反應(yīng)1 min產(chǎn)生相當(dāng)于1 μg木糖的酶量，為1個(gè)酶活單位，以U表示。

1.2.6 靈芝菌粗酶液緩解糙米老化處理

挑揀顆粒飽滿完整無(wú)裂痕、大小均勻的糙米，清洗瀝干后按一定比例加入靈芝菌胞內(nèi)粗酶液，于100r/min下恒溫振蕩處理一定時(shí)間，取出后清洗至表面無(wú)酶液殘留并于100℃下滅酶1 min，最后于50℃烘干，磨粉過(guò)篩（100目）后冷藏備用。

1.2.7 緩解老化效果測(cè)定

用RVA-TecMaster型快速黏度分析儀對(duì)處理后的糙米粉進(jìn)行糊化特性測(cè)定，根據(jù)結(jié)果計(jì)算得出回生值（setback，SB），回生值按公式（2）計(jì)算。

測(cè)試前，進(jìn)行濕基校正，測(cè)定方法按照GB5009.3—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測(cè)定》[21]。測(cè)量過(guò)程根據(jù)GB/T 24852—2010《大米及米粉糊化特性測(cè)定快速粘度儀法》[22]方法進(jìn)行。以未處理糙米為對(duì)照，根據(jù)公式（3）計(jì)算回生值比率。

式中：SB對(duì)照組為未處理糙米的回生值；SB試驗(yàn)組為經(jīng)靈芝菌胞內(nèi)粗酶液處理后糙米的回生值。

1.2.8 單因素試驗(yàn)

1.2.8.1 反應(yīng)溫度對(duì)緩解糙米老化的影響

稱取10.0 g糙米，在液料比（即靈芝胞內(nèi)粗酶液∶糙米）3∶1（mL/g）、反應(yīng)時(shí)間 2 h 條件下，分別研究不同反應(yīng)溫度 22、28、34、40、46 ℃對(duì)抗老化的影響，以未處理為對(duì)照。

1.2.8.2 反應(yīng)時(shí)間對(duì)緩解糙米老化的影響

稱取 10.0 g糙米，在液料比 3∶1（mL/g）、反應(yīng)溫度34℃條件下，分別研究不同反應(yīng)時(shí)間 1、2、3、4、5 h 對(duì)抗老化的影響，以未處理為對(duì)照。

1.2.8.3 液料比對(duì)緩解糙米老化的影響

稱取10.0g糙米，在反應(yīng)溫度34℃、反應(yīng)時(shí)間2h條件下，分別研究不同液料比 1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1（mL/g）對(duì)抗老化的影響，以未處理為對(duì)照。

1.2.9 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

利用Design-Expert V8.0.6進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，反應(yīng)溫度（A）、反應(yīng)時(shí)間（B）、液料比（C）作為自變量，回生值比率（Y）為響應(yīng)值，試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)分析因素水平Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)所得的各項(xiàng)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，利用Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，利用SPSS 23.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，顯著性水平為P＜0.05。采用Origin8.5進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝菌發(fā)酵粗酶液酶活力測(cè)定

靈芝菌發(fā)酵5 d后，對(duì)其進(jìn)行胞內(nèi)與胞外粗酶液制備及酶活力測(cè)定，結(jié)果如表2所示。

表2 靈芝菌發(fā)酵胞內(nèi)與胞外粗酶液酶活力Table 2 Enzyme activities of crude enzyme solution in intracellular and extracellular fermented broth of G.lucidum

由表2可知，靈芝菌發(fā)酵胞內(nèi)粗酶液中，α-淀粉酶酶活力最高，可達(dá)（35 088.35±621.03）U/g，其次為纖維素酶酶活力，為（15 755.22±521.71）U/g，蛋白酶和β-淀粉酶酶活力較弱。胞外粗酶液中，α-淀粉酶酶活力較高，為（5 673.61± 394.61）U/g，其次為 β-淀粉酶和纖維素酶，蛋白酶酶活力最弱，為（826.24±51.87）U/g。對(duì)比胞內(nèi)與胞外粗酶液中酶活力，我們發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)各酶酶活力均顯著高于胞外。原因可能為上述酶均為胞外酶，主要由胞內(nèi)分泌，并且在菌絲處理中采用細(xì)胞破碎儀進(jìn)行破碎，可使胞內(nèi)酶獲得極大程度釋放。然而，在測(cè)定中發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)與胞外粗酶液中均未測(cè)出木聚糖酶酶活力，這與劉建鵬等[23]的研究結(jié)果不一致，這可能與試驗(yàn)菌株的種類、培養(yǎng)環(huán)境等因素有關(guān)?；谏鲜鼋Y(jié)果，選擇胞內(nèi)粗酶液進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)研究。

2.2 胞內(nèi)酶液酶活力變化

分別取發(fā)酵1 d～7 d的靈芝菌進(jìn)行胞內(nèi)粗酶液制備及酶活力測(cè)定，結(jié)果如圖1所示。

圖1 靈芝菌發(fā)酵過(guò)程中胞內(nèi)粗酶液酶活力變化Fig.1 Changes of enzyme activities in intracellular enzyme solution of G.lucidumin the process of submerged fermentation

在靈芝菌發(fā)酵過(guò)程中，4種酶的酶活力均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。其中，α-淀粉酶在第4天時(shí)酶活力達(dá)到最高值，為（69 496.21±1 250.72）U/g；β-淀粉酶酶活力第 3天達(dá)到最高值，為（9 616.89±0.00）U/g，第4 天為（9 607.24±335.73）U/g，二者無(wú)顯著性差異；纖維素酶與酸性蛋白酶的酶活力均在第4天達(dá)到最大值，分別為（75 517.73±2 142.82）U/g和（7 515.79±204.08）U/g。在靈芝發(fā)酵至第3天時(shí)各酶酶活普遍大幅度上升并在第4天達(dá)到最大值，主要是由于這一階段為靈芝菌大量繁殖的階段，代謝最為旺盛。而在發(fā)酵后期由于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏與大量菌體自溶，各類酶的酶活均出現(xiàn)下降。這與陳志杰等[14]、許錫凱等[24]研究結(jié)果一致。

2.3 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

選取發(fā)酵第4天靈芝菌胞內(nèi)粗酶液對(duì)糙米抗老化效果進(jìn)行研究，分別從反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和液料比3個(gè)因素進(jìn)行試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如圖2～圖4所示。

圖2 不同反應(yīng)溫度對(duì)靈芝菌粗酶液緩解糙米老化的影響Fig.2 Effect of different temperature on alleviating retrogradation of brown rice by crude enzyme solution of G.lucidum

圖3 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)靈芝菌粗酶液緩解糙米老化的影響Fig.3 Effect of different time on alleviating retrogradation of brown rice by crude enzyme solution of G.lucidum

圖4 不同液料比對(duì)靈芝菌粗酶液緩解糙米老化的影響Fig.4 Effect of different liquid-solid ratio on alleviating retrogradation of brown rice by crude enzyme solution of G.lucidum

由圖2可知，當(dāng)反應(yīng)溫度小于34℃時(shí)，隨著反應(yīng)溫度的升高，回生值比率呈上升趨勢(shì)，抗老化效果顯著提升。當(dāng)反應(yīng)溫度為34℃時(shí)，回生值比率達(dá)到最大值為16.8%，當(dāng)反應(yīng)溫度大于34℃時(shí)，回生值比率逐漸下降，抗老化效果下降，這可能是因?yàn)殪`芝菌培養(yǎng)溫度為28℃，其所含酶抗高溫能力不強(qiáng)，當(dāng)溫度過(guò)高時(shí)會(huì)嚴(yán)重影響酶活，酶活開始下降。這與文獻(xiàn)報(bào)道的真菌低溫酶活力變化一致[25-26]。綜上，34℃為最佳反應(yīng)溫度。

由圖3可知，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間小于2 h時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，回生值比率明顯提高；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為2 h時(shí)，回生值比率達(dá)到最大值，為16.7%；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間大于2 h時(shí)，回生值比率逐漸下降，抗老化效果下降，這可能是因?yàn)榉磻?yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，糙米顆粒表面的淀粉大部分被水解，酶對(duì)糙米的淀粉接觸面變少，反應(yīng)效率下降。此外，反應(yīng)時(shí)間變長(zhǎng)，淀粉顆粒進(jìn)行不可逆吸水程度提高，水分含量上升，導(dǎo)致淀粉易老化、老化速度加快[27-28]，從而導(dǎo)致總體的回生值比率下降；并且反應(yīng)時(shí)間越長(zhǎng)，糙米浸泡時(shí)間越久，對(duì)糙米的形態(tài)造成嚴(yán)重影響，不利于糙米的食用和儲(chǔ)藏。綜上，2 h為最佳反應(yīng)時(shí)間。

由圖4可知，隨著液料比的增加，回生值比率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)液料比為4∶1（mL/g）時(shí)，回生值比率達(dá)到最大值為17.0%，當(dāng)液料比大于4∶1（mL/g）時(shí)，回生值比率逐漸下降，抗老化效果下降，這可能因?yàn)槊概c糙米接觸面積已接近飽和[29]；而水分含量增多，糙米顆粒膨脹加大，淀粉顆粒游離，表面淀粉減少，酶與淀粉接觸面減少，且淀粉顆粒進(jìn)行不可逆吸水程度提高，水分含量上升，導(dǎo)致淀粉易老化、老化速度加快[27-28]，導(dǎo)致總體的回生值比率下降；并且液料比越大，原料成本越高。綜上，4∶1（mL/g）為最佳液料比。

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化糙米抗老化條件

2.4.1 回歸方程的建立與方差分析

以回生值比率（Y）作為響應(yīng)值，響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 3 Design program and results of response surfaces

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of the regression model

對(duì)表3的數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸方程擬合，得到回生值比率（Y）的二次回歸模型：Y=0.241-0.017A+0.031B+0.024C+0.009AB+0.005AC-0.005BC-0.034A2-0.052B2-0.077C2。

由表4可知，回生值比率（Y）模型的P值為0.0001，回歸模型方差極顯著，擬合度較好；失擬項(xiàng)P值為0.975 8>0.05，不顯著，表明通過(guò)試驗(yàn)得到的二次回歸方程能較好地預(yù)測(cè)結(jié)果。二次多項(xiàng)式模型回生值比率（Y）的決定系數(shù)R2=0.973 7，這表明所建立的模型能夠較好地?cái)M合因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系。以回生值比率為響應(yīng)值，一次項(xiàng)A表現(xiàn)為顯著，一次項(xiàng)B、C以及二次項(xiàng)A2、B2、C2均表現(xiàn)為極顯著。通過(guò)主因子效應(yīng)分析可以得出，試驗(yàn)因素對(duì)抗老化影響的強(qiáng)弱順序：反應(yīng)時(shí)間>液料比>反應(yīng)溫度。

2.4.2 各因素相互作用分析

在響應(yīng)面結(jié)果中，將其中1個(gè)因素固定，對(duì)另外2個(gè)因素進(jìn)行分析得到響應(yīng)曲面，曲面越陡峭，說(shuō)明影響越顯著[30]。各因素相互作用對(duì)響應(yīng)值的影響結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 各因素交互作用對(duì)靈芝菌粗酶液緩解糙米老化影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface map and contour diagram of the interaction of different factors against the effects on alleviating retrogradation of brown rice by crude enzyme solution of G.lucidum

如圖5（c）所示，隨著液料比和反應(yīng)時(shí)間的增加，回生值比率先上升至趨于平緩，隨著液料比繼續(xù)增加，回生值比率下降。但圖形波動(dòng)相對(duì)較為平穩(wěn)，且對(duì)應(yīng)等高線為圓形，由此可知，反應(yīng)時(shí)間和液料比交互作用差異不顯著，同理，其他因素交互作用差異不顯著（P>0.05），此結(jié)果與表4所得結(jié)果一致。

2.4.3 抗老化條件的優(yōu)化和驗(yàn)證

響應(yīng)面結(jié)果分析得到靈芝胞內(nèi)粗酶液緩解糙米老化的最優(yōu)條件：反應(yīng)溫度31.869℃、反應(yīng)時(shí)間1.967h、液料比 4.126∶1（mL/g），此時(shí)，所得到的回生值比率的預(yù)測(cè)值為24.6%。考慮到實(shí)際操作的可行性，修正反應(yīng)條件：反應(yīng)溫度 32 ℃、反應(yīng)時(shí)間 2 h、液料比 4∶1（mL/g）。在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次平行性試驗(yàn)，所得結(jié)果回生值比率為24.0%，結(jié)果與理論值無(wú)顯著差異，由此可知，此模型可用于靈芝菌胞內(nèi)粗酶液液對(duì)糙米抗老化的反應(yīng)條件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，響應(yīng)面所得的反應(yīng)參數(shù)能有效緩解糙米老化，為糙米應(yīng)用提供理論依據(jù)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)主要研究了靈芝菌發(fā)酵過(guò)程的α-淀粉酶、β-淀粉酶、纖維素酶和酸性蛋白酶的酶活變化。其中，胞外粗酶液各類酶酶活力均明顯低于胞內(nèi)。而胞內(nèi)粗酶液中，α-淀粉酶、纖維素酶和酸性蛋白酶的酶活力在發(fā)酵第4天達(dá)到最大，分別為（69 496.21±1 250.72）、（75 517.73±2 142.82）、（7 515.79±204.08）U/g，繼而將發(fā)酵第4天的胞內(nèi)粗酶液用于緩解糙米老化，經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化后，最優(yōu)條件為反應(yīng)溫度32℃，反應(yīng)時(shí)間2 h，液料比4∶1（mL/g），此條件下所得回生值比率最高，可達(dá)24.0%。