響應(yīng)面法優(yōu)化花椒葉多酚提取工藝及其抗氧化活性

高岳，尹帥，袁孝瑞，劉玉，袁一博，趙圣明*

（1.蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品科技學(xué)院，江蘇 蘇州 215008；2.河南科技學(xué)院 食品學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

花椒屬于蕓香科植物，花椒葉多呈卵形和稀披針形，喜愛(ài)溫暖濕潤(rùn)的環(huán)境，耐嚴(yán)寒，抗干旱，抗病性強(qiáng)。全球約有250種花椒，廣泛分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)。在我國(guó)，花椒主要分布在山東、河南、河北、四川、陜西和長(zhǎng)江以南地區(qū)[1]。花椒作為一種食品調(diào)味料，被譽(yù)為“八大調(diào)味品”之一，同時(shí)又是傳統(tǒng)中藥，常被用作食品添加劑和藥物[2-3]?；ń犯缓飰A、揮發(fā)油、脂肪酸、香豆素、酰胺和三萜類等生物活性物質(zhì)[4]。生物堿具有抑菌、抗腫瘤、抑制血小板凝集等生理功能[5]；揮發(fā)油具有抑菌殺蟲、抗氧化等功效[6]?；ń啡~和果皮中提取出的香精油可作為植物殺蟲劑或驅(qū)避劑用于倉(cāng)庫(kù)、糧庫(kù)害蟲防治[7]?；ń纷训鞍卓咕膶?duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等食品中常見(jiàn)有害細(xì)菌均有一定抑制作用，且對(duì)冷熱加工食品均能起到抑菌作用[8]。

植物多酚屬于植物次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要包括花青素、單寧、黃酮、酚酸等活性成分[9]。目前關(guān)于植物多酚抗氧化活性的研究較多。張玉娟[10]采用分離純化技術(shù)對(duì)花椒葉抗氧化成分進(jìn)行靶標(biāo)分離和結(jié)構(gòu)鑒定，明確了花椒葉抗氧化活性基團(tuán)，并發(fā)現(xiàn)黃酮類化合物中抗氧化活性最強(qiáng)的是乙酸乙酯組分和丙酮組分的酚類成分，通過(guò)分析活性組分確定花椒葉所含抗氧化物質(zhì)主要是綠原酸、表兒茶素、蘆丁和金絲桃苷等，效果最佳的成分是金絲桃苷和槲皮苷；Sun等[11]測(cè)定10種不同品種花椒葉主要黃酮類化合物含量，發(fā)現(xiàn)花椒葉主要含金絲桃苷和槲皮苷；范菁華[12]采用超聲波輔助提取花椒葉中總黃酮并研究其體外抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)D4020型樹(shù)脂純化的花椒葉總黃酮清除DPPH自由基的效果遠(yuǎn)優(yōu)于VC；李君珂等[13]研究發(fā)現(xiàn)在白鰱咸魚加工過(guò)程中加入花椒葉多酚可顯著降低魚脂肪氧化程度。響應(yīng)面法優(yōu)化已應(yīng)用于草莓多酚、香水蓮花多酚、無(wú)花果干等植物多酚的提取[14-16]，但目前有關(guān)花椒葉多酚的提取工藝優(yōu)化研究較少。本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化正丁醇對(duì)花椒葉多酚的提取工藝并對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，旨在為有效開(kāi)發(fā)花椒葉提供相關(guān)工藝技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮花椒葉：采自新鄉(xiāng)南太行山區(qū)；福林酚試劑：北京索萊寶科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海源葉生物科技有限公司；沒(méi)食子酸、碳酸鈉：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；正丁醇：湖南匯虹試劑有限公司；乙醇、硫酸亞鐵、雙氧水：南京化學(xué)試劑有限公司；水楊酸：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；2，2'-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸 [2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]：上海阿拉丁生化科技有限公司。以上化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-S4型恒溫水浴鍋：廣州一馬環(huán)?？萍加邢薰荆籉W100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)、WGL-125B電熱鼓風(fēng)干燥箱：天津泰斯特儀器有限公司；WFJ7200型可見(jiàn)分光光度計(jì)：尤尼柯（上海）儀器有限公司；MC210S電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；SHB-III循環(huán)水式真空泵：鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；RE-2A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 花椒葉多酚提取方法

將新鮮花椒葉清洗干凈去除雜質(zhì)，置于干燥箱中烘干，利用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)20目篩；每個(gè)處理組取1.0 g花椒葉粉末用50 mL正丁醇浸提，并抽濾收集各提取液，定容至50 mL備用。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

參考熊汝琴等[17]測(cè)定青花椒總酚含量的方法，準(zhǔn)確稱量0.1 g沒(méi)食子酸溶解于蒸餾水，定容至100 mL得到質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的沒(méi)食子酸溶液，分別取不同體積沒(méi)食子酸溶液于50 mL容量瓶定容，再取各不同濃度的沒(méi)食子酸溶液2 mL，加入2 mL福林酚試劑搖勻，靜置5 min，加入4 mL體積分?jǐn)?shù)10%的碳酸鈉溶液，用蒸餾水定容，用可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)765 nm下各標(biāo)準(zhǔn)液吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：y=0.587x-0.026，R2=0.998 6，y 表示吸光度，x表示沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度（mg/mL）。

1.5 樣品多酚含量的測(cè)定

吸取0.1 mL多酚提取液按照1.4方法進(jìn)行顯色反應(yīng)，測(cè)定吸光度，利用回歸方程求出提取液中多酚含量，利用下式計(jì)算樣品多酚含量。

式中：Y為樣品多酚含量，mg/g；C為提取液多酚濃度，μg/mL；V為提取液體積，mL；X為樣品稀釋倍數(shù)；M為樣品取樣量，g。

式中：M1為多酚質(zhì)量，g；M2為花椒葉樣品質(zhì)量，g。

1.6 單因素試驗(yàn)

以花椒葉多酚提取率為因變量，分別以料液比、提取溫度、提取時(shí)間作為考察因素，探究各單因素對(duì)花椒葉多酚提取率的影響。

1.6.1 不同提取溫度對(duì)花椒葉多酚提取率的影響

準(zhǔn)確稱量1.0 g花椒葉粉末6份分別置于6個(gè)錐形瓶?jī)?nèi)，并加入50 mL體積分?jǐn)?shù)65%的正丁醇，分別在 40、50、60、70、80、90 ℃下恒溫水浴提取 1 h，抽濾收集提取液并定容至50 mL，測(cè)量多酚含量，計(jì)算多酚提取率。

1.6.2 不同料液比對(duì)花椒葉多酚提取率的影響

準(zhǔn)確稱量1.0g花椒葉粉末6份分別置于6個(gè)錐形瓶?jī)?nèi)，分別以料液比 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）于80℃水浴提取1h，抽濾收集提取液并定容至50mL，測(cè)量多酚含量，計(jì)算多酚提取率。

1.6.3 不同提取時(shí)間對(duì)花椒葉多酚提取率的影響

準(zhǔn)確稱量1.0 g花椒葉粉末6份分別置于6個(gè)錐形瓶?jī)?nèi)，并加入50 mL體積分?jǐn)?shù)為65%的正丁醇，在50℃條件下對(duì) 6 份樣品分別提取 20、40、60、80、100、120 min，抽濾收集提取液并定容至50 mL，測(cè)量多酚含量，計(jì)算多酚提取率。

1.7 花椒葉多酚提取工藝響應(yīng)面優(yōu)化方法

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，以花椒葉多酚提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，因素與水平見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of test

1.8 抗氧化活性測(cè)定

1.8.1 DPPH自由基清除能力測(cè)定

參考王萍等[18]的方法并作修改，稱取250 mg的DPPH溶于乙醇，置于250mL容量瓶定容，搖勻靜置得到濃度為1 mg/mL的DPPH溶液。取3 mL提取液和3 mL DPPH溶液置于同一比色管混勻，避光靜置30 min，以70%乙醇溶液為空白樣，在波長(zhǎng)517 nm處測(cè)得吸光度A1；再分別取3 mL提取液和3 mL 70%乙醇溶液、3 mL DPPH溶液和3 mL 70%乙醇溶液混勻，避光靜置30 min，在波長(zhǎng)517 nm處分別測(cè)得吸光度A2、A3，用下式計(jì)算DPPH自由基清除率。

DPPH 自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A3]×100

1.8.2 羥自由基清除能力測(cè)定

參考趙楠楠等[19]的方法并作改進(jìn)，取2 mL提取液于試管中，向試管中加入2 mL FeSO4溶液和2 mL H2O2溶液后振蕩搖勻靜置10 min，再加入2 mL水楊酸（以50%乙醇溶液為溶劑），靜置0.5 h，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度，記為A1；并用等體積水代替多酚樣液作空白試驗(yàn)測(cè)吸光度，記為A2；用等體積水代替水楊酸作對(duì)照組測(cè)吸光度，記為A3。試驗(yàn)進(jìn)行3次取平均值，羥自由基清除率計(jì)算公式如下。

羥自由基清除率/%=[1-（A1-A3）/A2]×100

1.8.3 ABTS+自由基清除能力測(cè)定

參考顏征等[20]的方法，首先配制ABTS溶液，使用7 mmol/L ABTS溶液和4.9 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液以體積比1∶1混勻，避光靜置12 h即得ABTS儲(chǔ)備液，取提取液各2 mL加入4 mL的ABTS溶液振蕩搖勻，25℃條件下避光充分反應(yīng)5 min，在734 nm處測(cè)樣液吸光度，記為A1；取2 mL 95%乙醇和4 mL ABTS溶液在734nm處測(cè)對(duì)照組溶液吸光度，記為A2；標(biāo)準(zhǔn)管取2mL多酚樣液加入4 mL 95%乙醇溶液，波長(zhǎng)734 nm處測(cè)吸光度，記為A3。試驗(yàn)進(jìn)行3次取平均值，用下式計(jì)算ABTS+自由基清除率。

ABTS+自由基清除率/%=[1-（A1-A3）/A2]×100

1.9 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并用Origin 2017軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 花椒葉多酚提取的單因素試驗(yàn)

2.1.1 不同提取溫度對(duì)花椒葉多酚提取率的影響

提取溫度對(duì)花椒葉多酚提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 提取溫度對(duì)花椒葉多酚提取率的影響Fig.1 Effect of extraction temperature on the yield of polyphenols from Zanthoxylum bungeanum leaf

如圖1所示，花椒葉多酚的提取率隨著提取溫度的升高而逐漸增大，在90℃時(shí)提取率達(dá)到最大，為4.5%，可能是較高的提取溫度促使分子運(yùn)動(dòng)速率加快，利于多酚物質(zhì)溶出。在40℃～80℃溫度范圍內(nèi)，花椒葉多酚提取率隨提取溫度升高呈顯著上升趨勢(shì)；80、90℃時(shí)多酚提取率沒(méi)有顯著性差異。綜上，選擇提取溫度為70、80、90℃進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.2 不同料液比對(duì)花椒葉多酚提取率的影響

料液比對(duì)花椒葉多酚提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 料液比對(duì)花椒葉多酚提取率的影響Fig.2 Effect of material-to-liquid ratio on the yield of polyphenols from Zanthoxylum bungeanum leaf

由圖2可看出，花椒葉多酚提取率隨著溶劑體積的增加而逐漸增大，在料液比為1∶60（g/mL）時(shí)，多酚提取率達(dá)到最大值（4.2%）。料液比在 1∶10（g/mL）～1∶50（g/mL）時(shí)，隨著溶劑體積增大多酚提取率顯著上升，料液比為 1∶50、1∶60（g/mL）時(shí)多酚提取率沒(méi)有顯著性差異。綜上，選擇料液比為 1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)。

2.1.3 不同提取時(shí)間對(duì)花椒葉多酚提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)花椒葉多酚提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 提取時(shí)間對(duì)花椒葉多酚提取率的影響Fig.3 Effect of extraction time on the yield of polyphenols from Zanthoxylum bungeanum leaf

由圖3可知，花椒葉多酚提取率隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先顯著增大后緩慢減小的趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間為100 min時(shí)多酚提取率最大，為4.4%，提取時(shí)間超過(guò)100 min后多酚的提取率變化不顯著。因此選擇提取時(shí)間80、100、120 min進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

2.2.1 回歸方程的建立及方差分析

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface methodology

使用Design-Expert 8.0軟件對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合得到花椒葉多酚提取率（Y）與料液比（X1）、提取溫度（X2）、提取時(shí)間（X3）之間的回歸方程為Y=4.67+0.039X1+0.023X2+0.024X3-0.015X1X2-0.012X1X3+0.015X2X3-0.050X12-0.087X22-0.020X32。

模型方差分析結(jié)果如表3所示。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

模型F值57.57，P<0.000 1達(dá)到了極顯著水平，說(shuō)明該模型具有極顯著性；失擬項(xiàng)P=0.144 4>0.05，不顯著，表明模型擬合度良好，誤差較小。模型相關(guān)系數(shù)R2=0.986 7，R2Adj=0.969 5，表明使用該模型所得預(yù)測(cè)值與實(shí)際測(cè)得值相關(guān)性良好，可對(duì)花椒葉多酚提取率進(jìn)行預(yù)測(cè)。由F值和P值可發(fā)現(xiàn)料液比、提取溫度、提取時(shí)間均對(duì)多酚提取率有極顯著影響，影響大小依次是料液比>提取時(shí)間>提取溫度。

2.2.2 各因素交互作用

各因素交互作用的響應(yīng)面圖見(jiàn)圖4。

圖4 各因素交互作用Fig.4 Interactive effects of various parameters

曲面圖可直觀反映各因素對(duì)多酚提取率的影響程度，曲面圖越陡峭說(shuō)明影響越大，相反，越平緩說(shuō)明影響越弱。由圖4可以看出，料液比與提取溫度、提取溫度和提取時(shí)間之間的響應(yīng)面較陡峭，等高線呈橢圓形，交互作用顯著，與表3方差分析結(jié)果一致。

2.2.3 響應(yīng)面最優(yōu)條件驗(yàn)證

通過(guò)Design-Expert 8.0軟件得出花椒葉多酚最佳提取工藝條件為料液比1∶56.08（g/mL）、提取溫度80.85℃、提取時(shí)間106.96 min，預(yù)測(cè)多酚提取率為4.68%。為了驗(yàn)證模型的可靠性，采用優(yōu)化的最佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，考慮到實(shí)際操作可行性，將工藝參數(shù)調(diào)整為料液比1∶56（g/mL）、提取溫度81℃、提取時(shí)間107 min。重復(fù)3次取平均值，得到花椒葉多酚提取率為4.63%，這與模型預(yù)測(cè)的理論值接近。因此，響應(yīng)面法得到的花椒葉多酚提取工藝參數(shù)真實(shí)可靠，該模型具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.3 花椒葉多酚抗氧化活性分析

2.3.1 DPPH自由基清除能力

花椒葉多酚和VC對(duì)DPPH自由基清除率的影響如圖5所示。

圖5 花椒葉多酚和VC對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.5 DPPH free radical scavenging capacity of polyphenols from Zanthoxylum bungeanum leaf and VC

由圖5可知，隨著多酚濃度的升高其對(duì)DPPH自由基的清除能力逐漸增強(qiáng)，當(dāng)多酚濃度為1.0 mg/mL時(shí)DPPH自由基清除率可高達(dá)93.27%，與1.0 mg/mL VC對(duì)DPPH自由基的清除能力相當(dāng)，說(shuō)明花椒葉多酚對(duì)DPPH自由基有較好的清除能力。

2.3.2 羥自由基的清除能力

花椒葉多酚對(duì)羥自由基清除率的影響如圖6所示。

由圖6可以看出，與同濃度的VC相比，花椒葉多酚對(duì)羥自由基清除能力較弱，但其仍有一定的清除能力?；ń啡~多酚對(duì)羥自由基的清除能力隨著多酚濃度的升高呈現(xiàn)增高的趨勢(shì)，在濃度為1.0 mg/mL時(shí)羥自由基清除率達(dá)到最高值（82.22%）。濃度高于0.6 mg/mL后，花椒葉多酚的羥自由基清除率隨多酚濃度變化趨于平緩。

圖6 花椒葉多酚和VC對(duì)羥自由基的清除能力Fig.6 Hydroxy free radical scavenging capacity of polyphenols from Zanthoxylum bungeanum leaf and VC

2.3.3 ABTS+自由基清除能力

花椒葉多酚和VC對(duì)ABTS+自由基清除率的影響如圖7所示。

圖7 花椒葉多酚和VC對(duì)ABTS+自由基的清除能力Fig.7 ABTS+free radical scavenging capacity of polyphenols from Zanthoxylum bungeanum leaf and VC

由圖7可知，與同濃度的VC相比，花椒葉多酚對(duì)ABTS+自由基清除能力較弱，但其仍有一定的清除能力。隨著多酚濃度升高，花椒葉多酚對(duì)ABTS+自由基清除率也相應(yīng)升高，多酚濃度低于0.8 mg/mL時(shí)ABTS+自由基清除率隨濃度升高呈快速增大的趨勢(shì)?；ń啡~多酚對(duì)ABTS+自由基的清除作用間接表明花椒葉多酚具有良好的抗氧化功效。

3 結(jié)論

本研究分別考察了料液比、提取溫度、提取時(shí)間3個(gè)因素對(duì)花椒葉多酚提取率的影響，并通過(guò)響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化最終確定花椒葉多酚提取的最佳工藝條件為提取時(shí)間 107 min、提取溫度 81 ℃、料液比 1∶56（g/mL）。在最優(yōu)的工藝條件下，花椒葉多酚提取率為4.63%?？寡趸芯拷Y(jié)果顯示花椒葉多酚對(duì)DPPH自由基、羥自由基和ABTS+自由基均具有良好的清除能力。