表面活性劑輔助提取魚腥草黃酮及其動(dòng)力學(xué)研究

麥馨允，劉彩華，韋蘭潔，?？?，賴桂珍

（1.百色學(xué)院農(nóng)業(yè)與食品工程學(xué)院，廣西 百色 533000；2.百色學(xué)院亞熱帶特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)學(xué)院，廣西 百色 533000）

魚腥草是中國(guó)藥典收錄的草藥，為三白草科蕺菜屬蕺菜Houttuynia cordata Thunb.的全株；辛，微寒，歸肺經(jīng)；具有清熱解毒、消癰排膿、利尿通淋等功效[1]。魚腥草的藥理功效源自于其組織內(nèi)所含的化學(xué)活性成分。現(xiàn)代研究表明，魚腥草活性成分主要有揮發(fā)油、黃酮、生物堿、多糖、有機(jī)酸等[2-4]。黃酮作為魚腥草的主要活性成分之一，含量較為豐富，并具有很強(qiáng)的抗氧化能力，采用亞鐵還原能力法測(cè)定魚腥草抗氧化能力時(shí)發(fā)現(xiàn)，黃酮含量與抗氧化能力之間具有極顯著（P＜0.01）的正相關(guān)[5]；魚腥草黃酮可通過阻斷病毒膜融合而滅活單純皰疹病毒1型（HSV-1）[6]，還可促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的凋亡[7]。除以上功能外，魚腥草黃酮還具有抗腫瘤、抗輻射、抗疲勞、抗過敏、抑菌等藥理作用[8]。因此，研究魚腥草黃酮提取具有較大價(jià)值。

魚腥草黃酮提取方法有溶劑提取法、酶輔助提取法、微波輔助提取法、超聲輔助提取法及雙水相萃取法等[8]。鮮有關(guān)于表面活性劑輔助提取魚腥草黃酮的研究。表面活性劑輔助提取是一種新型提取技術(shù)，表面活性劑可以降低溶劑與物料之間的界面張力，使得物料更易浸潤(rùn)，溶劑易于滲透植物細(xì)胞中，而一些微溶或不溶的物質(zhì)可借助表面活性劑得到溶解，從而提高提取得率[9-10]。因此，本研究采用表面活性劑輔助提取魚腥草黃酮，通過單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化魚腥草黃酮的提取工藝，并對(duì)黃酮提取過程的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行研究，建立魚腥草黃酮提取動(dòng)力學(xué)模型，為表面活性劑提取魚腥草黃酮的工藝優(yōu)化和工程放大提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚腥草鮮樣：市售。

魚腥草粉末的制備：從魚腥草鮮樣中挑選生長(zhǎng)狀態(tài)好、無機(jī)械損傷的魚腥草地下莖，清洗干凈，60℃烘干，粉碎過60目篩（粒徑250μm），密封放入干燥器中備用。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)樣品（HPLC≥98%）：南寧云櫸生物科技有限公司；蔗糖脂肪酸酯（純度≥98%）：合肥巴斯夫生物科技有限公司；吐溫20、吐溫60、吐溫80（分析純）：無錫市亞泰聯(lián)合化工有限公司；吐溫40（分析純）：上海展云化工有限公司；硬脂酰乳酸鈉（純度≥99%）：酷爾化學(xué)科技（北京）有限公司；亞硝酸鈉（分析純）：天津博迪化工有限公司；硝酸鋁、氫氧化鈉（分析純）：天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1800型紫外可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)儀器有限公司；GZX-9240MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HH-4數(shù)顯電子恒溫水浴鍋：常州國(guó)華電器有限公司；DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；FA1204B型電子天平：上海市安亭電子儀器廠；ZN-02L小型高速粉碎機(jī)：中科耐馳技術(shù)（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 魚腥草黃酮提取方法及黃酮得率的計(jì)算

稱取一定質(zhì)量的魚腥草粉末置于錐形瓶中，然后加入一定濃度的表面活性劑、按照一定料液比加入一定濃度的乙醇溶液在一定水浴溫度下提取一定時(shí)間，取上清液測(cè)算其黃酮得率。黃酮含量測(cè)定方法參考Jia等[11]，并做調(diào)整。取魚腥草提取上清液1.0 mL置于10 mL的容量瓶中，加入0.3 mL 5%的NaNO2溶液，搖勻，放置6 min后加入0.3 mL 10%的Al（NO3）3溶液，搖勻，放置6 min，加入4.0 mL 4%的NaOH溶液，最后用75%的乙醇定容至刻度，搖勻，靜置12 min，在510 nm處測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算提取液中黃酮的質(zhì)量，并按式（1）計(jì)算黃酮得率。

1.3.2 表面活性劑種類的篩選

稱取1 g魚腥草粉末，分別加入4 g/L的蔗糖脂肪酸酯、吐溫20、吐溫40、吐溫60、吐溫80及硬脂酰乳酸鈉等表面活性劑，按料液比為1∶30 g/mL加入60%乙醇溶液，在50℃下水浴提取1.5 h，以黃酮得率為指標(biāo)，選出最佳的表面活性劑。每個(gè)水平設(shè)3次重復(fù)。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

稱取1g魚腥草粉末，按1.3.2的結(jié)果固定最佳表面活性劑種類為吐溫 20，選取吐溫 20 添加量 0、2、4、6、8g/L[提取溫度 50℃、乙醇濃度 60%、料液比 1∶30（g/mL）、提取時(shí)間 1.5 h]，提取溫度 30、55、80、100 ℃ [吐溫 20 添加量 2 g/L、乙醇濃度 60%、料液比 1∶30（g/mL）、提取時(shí)間 1.5 h]，乙醇濃度 20%、40%、60%、80%、100%[吐溫20 添加量 2 g/L、提取溫度 80 ℃、料液比 1∶30（g/mL）、提取時(shí)間 1.5h]，料液比 1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50（g/mL）（吐溫20添加量2 g/L、提取溫度80℃、乙醇濃度40%、提取時(shí)間 1.5 h），提取時(shí)間 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h[吐溫20添加量2 g/L、提取溫度80℃、乙醇濃度40%、料液比1∶40（g/mL）]分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各個(gè)因素不同水平對(duì)黃酮得率的影響。每個(gè)水平設(shè)3次重復(fù)。

1.3.4 正交設(shè)計(jì)

根據(jù)1.3.3單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取吐溫20添加量、提取溫度、乙醇濃度、料液比進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，優(yōu)化魚腥草黃酮提取工藝，各因素水平見表1。

表1 正交設(shè)計(jì)因素水平Table 1 The factors and levels of orthogonal design

1.4 提取動(dòng)力學(xué)

1.4.1 提取動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)

在魚腥草黃酮提取正交試驗(yàn)和驗(yàn)證試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選取最優(yōu)組合條件下，分別在50、65、80、95℃下提取，在提取 0、5、10、15、20、25、30、40、50、60 min 時(shí)吸取1 mL的提取液測(cè)定黃酮含量（以下簡(jiǎn)稱最優(yōu)組），探究魚腥草黃酮提取的動(dòng)力學(xué)。每個(gè)水平設(shè)3次重復(fù)。除此之外，需進(jìn)行對(duì)照試驗(yàn)，對(duì)照試驗(yàn)不添加表面活性劑，其他條件與最優(yōu)組條件一致，步驟同上（以下簡(jiǎn)稱對(duì)照組）。

在提取的過程中，由于每次吸取1 mL提取液從而導(dǎo)致提取液體積的變化。因此，對(duì)于提取液中黃酮濃度需按照式（2）對(duì)濃度進(jìn)行校正[12]。

式中：Cn為第n次取樣質(zhì)量濃度修正值，mg/mL；C'n為第n次取樣質(zhì)量濃度測(cè)定值，mg/mL；V為溶劑體積，mL；n為取樣次數(shù)。

1.4.2 提取動(dòng)力學(xué)模型

利用Fick第二定律對(duì)黃酮進(jìn)行固液提取動(dòng)力學(xué)過程的擬合，其提取動(dòng)力學(xué)過程表達(dá)式如式（3）所示[13]，反映了魚腥草顆粒半徑、提取時(shí)間、溫度和魚腥草黃酮濃度之間的關(guān)系。

式中：C∞為提取平衡時(shí)刻魚腥草黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；C為t時(shí)刻魚腥草中黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；C0為魚腥草中黃酮的初始質(zhì)量濃度，mg/mL；Ds為表面擴(kuò)散系數(shù)，cm2/min；R為假設(shè)魚腥草粉末顆粒為球形的半徑，cm。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用PASW Statistics 18.0進(jìn)行方差分析，多重比較分析采用Tukey法。

2 結(jié)果與分析

2.1 表面活性劑的篩選

表面活性劑的種類對(duì)魚腥草黃酮得率的影響如圖1所示。

圖1 表面活性劑種類對(duì)魚腥草黃酮得率的影響Fig.1 Effects of surfactant type on yield of flavonoid from H.cordata Thunb.

由圖1可知，不同表面活性劑對(duì)魚腥草黃酮得率有較大影響，其提取能力由大到小排列：吐溫20>硬脂酰乳酸鈉>吐溫80>蔗糖脂肪酸酯>吐溫40>吐溫60。吐溫系列表面活性劑中，吐溫20提取能力最強(qiáng)，這是由于吐溫20的親水程度較其他大，且低分子量表面活性劑具有更高的表面活性[14]。因此選擇吐溫20作為下一步研究的表面活性劑。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 吐溫20添加量對(duì)魚腥草黃酮得率的影響

吐溫20添加量對(duì)魚腥草黃酮得率的影響如圖2所示。

圖2 吐溫20添加量對(duì)魚腥草黃酮得率的影響Fig.2 Effects of tween-20 addition on yield of flavonoid from H.cordata Thunb.

由圖2可知，不同吐溫20添加量對(duì)魚腥草黃酮得率有較大影響。隨著吐溫20添加量的增加，黃酮得率呈先上升后下降趨勢(shì)，且添加量為2 g/L時(shí)黃酮得率最高。黃酮得率隨吐溫20添加量增加而上升，這可能是因?yàn)橥聹?0在臨界膠束濃度下開始從單體形成聚集體，膠束聚集體具有非均相環(huán)境，為溶質(zhì)提供多個(gè)相互作用位點(diǎn)，從而提高疏水物質(zhì)在水溶液中的溶解度[15]，形成膠束數(shù)量不斷增加，從而增加黃酮的溶出度，總黃酮得率增加；但當(dāng)吐溫20的濃度達(dá)到臨界膠束濃度后，形成膠束數(shù)量不再增加，并與黃酮處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，表面活性劑體積分?jǐn)?shù)增大的同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致體系的黏度增大，阻礙溶質(zhì)分子的熱運(yùn)動(dòng)，使得黃酮得率不再增加或降低[16-17]。因而選擇表面活性劑最佳的添加量為2 g/L。

2.2.2 提取溫度對(duì)魚腥草黃酮得率的影響

提取溫度對(duì)魚腥草黃酮得率的影響如圖3所示。

圖3 提取溫度對(duì)魚腥草黃酮得率的影響Fig.3 Effects of extraction temperature on yield of flavonoid from H.cordata Thunb.

由圖3可知，不同的提取溫度對(duì)魚腥草黃酮得率的影響較大。隨著溫度的升高，黃酮得率先上升后下降，在80℃的時(shí)候黃酮得率達(dá)到最高。黃酮得率先上升的原因是提取溫度增大，熱運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)，從而促進(jìn)黃酮的溶出。隨后下降是因?yàn)楦邷厥沟命S酮降解從而得率下降，同時(shí)過高的提取溫度會(huì)使乙醇揮發(fā)影響其溶解度[18]。因而選擇最佳的提取溫度為80℃。

2.2.3 乙醇濃度對(duì)魚腥草黃酮得率的影響

乙醇濃度對(duì)魚腥草黃酮得率的影響如圖4所示。

由圖4可知，魚腥草黃酮得率隨著乙醇濃度的增加先上升后下降，乙醇濃度對(duì)魚腥草黃酮提取有顯著影響（P<0.05）。在乙醇濃度為40%時(shí)，魚腥草黃酮得率最高，但隨著乙醇濃度繼續(xù)增大，魚腥草黃酮逐步降低，說明40%的乙醇濃度可以將魚腥草中水溶性和脂溶性的黃酮提取出來，當(dāng)乙醇濃度繼續(xù)增加，水溶性黃酮的溶解度變小，從而使得黃酮得率下降[19]。因此選擇乙醇濃度40%為最佳的乙醇濃度。

圖4 乙醇濃度對(duì)魚腥草黃酮得率的影響Fig.4 Effects of ethanol concentration on yield of flavonoid from H.cordata Thunb.

2.2.4 料液比對(duì)魚腥草黃酮得率的影響

料液比對(duì)魚腥草黃酮得率的影響如圖5所示。

不同字母表示組間差異顯著，P<0.05。

由圖5可知，魚腥草黃酮得率隨料液比的不同而表現(xiàn)出較大的差異。隨著溶劑添加量的增大，魚腥草黃酮得率也逐步增大，料液比為1∶40（g/mL）時(shí)黃酮得率達(dá)到最大值，再增大溶劑添加量，得率反而下降。原因是溶劑量增大，可溶出的其他物質(zhì)較多，在乙醇-水體系中，其他物質(zhì)或者與黃酮形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，相互爭(zhēng)奪與乙醇-水分子相結(jié)合[18]，或者能影響黃酮含量的測(cè)定[19]，從而導(dǎo)致黃酮得率下降。因此選擇最佳的料液比為 1∶40（g/mL）。

2.2.5 提取時(shí)間對(duì)魚腥草黃酮得率的影響

提取時(shí)間對(duì)魚腥草黃酮得率的影響如圖6所示。由圖6可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，魚腥草黃酮得率逐漸增加，但1.0 h后增加的趨勢(shì)不明顯，可能是因?yàn)樘崛∫欢〞r(shí)間后，黃酮成分已基本溶出[18]，此時(shí)黃酮的擴(kuò)散是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡過程。結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果以及提取時(shí)長(zhǎng)，選擇最佳提取時(shí)間為1.0 h。因?yàn)樘崛r(shí)間對(duì)魚腥草黃酮得率影響差異不顯著（P≥0.05），所以提取時(shí)間未作為正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)的因素之一。

圖6 提取時(shí)間對(duì)魚腥草黃酮得率的影響Fig.6 Effects of extraction time on yield of flavonoid from H.cordata Thunb.

2.3 魚腥草黃酮得率的正交試驗(yàn)結(jié)果

魚腥草黃酮得率正交試驗(yàn)的極差分析、方差分析、多重比較結(jié)果見表2～表4。

表2 魚腥草黃酮得率的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test on yield of flavonoid from H.cordata Thunb.

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonal test results

表4 多重比較結(jié)果Table 4 Results of multiple comparison

由表2的極差分析可知，影響魚腥草黃酮得率的因素順序?yàn)樘崛囟?乙醇濃度＞吐溫20添加量＞料液比。極差分析后得出的最佳試驗(yàn)組合為A1B2C3D2。

由表3正交試驗(yàn)方差分析可知，吐溫20添加量、提取溫度、乙醇濃度以及料液比對(duì)提取魚腥草黃酮影響的顯著性均小于0.05，表明這些因素對(duì)提取魚腥草黃酮有顯著性影響（P＜0.05）；均方越大，說明該因素對(duì)黃酮提取的影響就越大，因此，提取溫度＞乙醇濃度＞吐溫20添加量＞料液比。由表4多重比較的結(jié)果可知，從成本方面考慮，得到試驗(yàn)組合為A1B1C3D2。

極差分析結(jié)果（A1B2C3D2）、多重比較結(jié)果（A1B1C3D2）的試驗(yàn)組合均未出現(xiàn)在正交設(shè)計(jì)組合中，而正交設(shè)計(jì)組合序號(hào)7（A3B1C3D2）得率為2.38%，為這9個(gè)處理中的最高值，因此需進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見圖7。

圖7 不同試驗(yàn)組合對(duì)魚腥草黃酮得率的影響Fig.7 Effects of different test combinations on yield of flavonoid from H.cordata Thunb.

由圖7可知，當(dāng)工藝條件為A1B2C3D2時(shí)魚腥草黃酮得率最高，為最優(yōu)組合，即吐溫20添加量為1 g/L、提取溫度為80℃、乙醇濃度為50%、料液比為1∶40 g/mL。

2.4 提取動(dòng)力學(xué)分析

不同溫度下，添加表面活性劑吐溫20（最優(yōu)組）和未添加表面活性（對(duì)照組）對(duì)魚腥草黃酮提取液濃度的影響結(jié)果分別如圖8-a、8-b所示。

圖8 不同溫度對(duì)魚腥草黃酮濃度的影響Fig.8 Effects of different temperature on flavonoid concentration from H.cordata Thunb.

由圖8a、圖8b可知，在0～20 min時(shí)，提取溫度越高，溶液中黃酮濃度就越大；在20 min后，提取溫度為50℃～80℃時(shí)，黃酮濃度整體上隨著提取時(shí)間的增加而增加，95℃下提取一段時(shí)間后，黃酮濃度整體上隨著時(shí)間的增加而減少，這是由于黃酮類化合物在溫度過高時(shí)，會(huì)改變黃酮結(jié)構(gòu)，從而發(fā)生熱降解，如蘆丁在70℃下加熱2.0 h后，蘆丁的消耗量不到10%，在90℃下加熱2.0 h，蘆丁含量損失達(dá)50%，熱降解程度會(huì)隨加熱溫度和時(shí)間的增加而增加[20]。魚腥草中的黃酮類化合物主要物質(zhì)是黃酮醇類化合物，主要有槲皮素及衍生物，含槲皮素、蘆丁、金絲桃苷[21]，對(duì)熱較為敏感。由此可知，在有效的溫度范圍內(nèi)，提高溫度能促進(jìn)魚腥草黃酮的浸出。最優(yōu)組（添加吐溫20）和對(duì)照組相比，在相同提取溫度時(shí)，最優(yōu)組的黃酮濃度都普遍高于對(duì)照組的黃酮濃度，且提取溫度低，差距明顯，溫度升高，差距逐漸縮小，說明吐溫20可以提高黃酮的浸出，且在低溫時(shí)對(duì)黃酮浸出的促進(jìn)作用較大。吐溫20可提高黃酮浸出率是由于其促溶作用，而高溫下雖然可以降低吐溫20的臨界膠束濃度[22]，但由于高溫增強(qiáng)了溶液中分子的碰撞，此時(shí)是熱運(yùn)動(dòng)加速黃酮浸出為主導(dǎo)，從而相對(duì)地削弱了吐溫20對(duì)黃酮浸出的促進(jìn)作用。

2.5 提取動(dòng)力學(xué)模型

采用式（3）對(duì)提取動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，擬合結(jié)果見表5。

由表5可知，最優(yōu)組中R2在50℃～80℃溫度范圍均大于0.9，說明模型擬合效果好，可為魚腥草黃酮提取過程的工程放大提供一定支持；而當(dāng)溫度為95℃時(shí)，R2低于0.9，說明模型擬合效果不好，這是由于高溫導(dǎo)致黃酮得率降低，而Fick模型只適用于未考慮到物質(zhì)降解的非穩(wěn)態(tài)擴(kuò)散過程。C∞為提取平衡時(shí)刻時(shí)魚腥草黃酮的質(zhì)量濃度。不管是最優(yōu)組還是對(duì)照組，在溫度為50℃～80℃范圍內(nèi)，C∞隨著溫度的升高而升高；在相同溫度下，最優(yōu)組的C∞都要比對(duì)照組的高；再次驗(yàn)證了吐溫20在同樣的提取溫度下，可以提高黃酮得率。而當(dāng)溫度為95℃時(shí)，C∞降低，這是因?yàn)楦邷貙?dǎo)致黃酮熱降解。

表5 動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合結(jié)果Table 5 Fitting results of kinetic experimental data

由于最優(yōu)組C∞、Ds隨溫度變化而變化，是溫度的函數(shù)，因此采用二項(xiàng)式對(duì)50℃～80℃的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，分別得到試驗(yàn)條件下最優(yōu)組的C∞、Ds隨溫度的變化規(guī)律，見式（4）、式（5）。

將式（4）、式（5）帶入到式（3），取 C0=0，最終得到吐溫20輔助提取魚腥草黃酮的動(dòng)力學(xué)模型，見式（6）。

3 結(jié)論

本法采用表面活性劑輔助提取魚腥草中的黃酮，通過單因素及正交試驗(yàn)確定最佳的提取工藝，結(jié)果表明：吐溫20添加量為1 g/L、提取溫度為80℃、乙醇濃度為50%、料液比為1∶40 g/mL的條件下提取60 min，黃酮提取率達(dá)到2.59%，該法操作簡(jiǎn)便，節(jié)約成本，得率較高。

在正交試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上對(duì)魚腥草黃酮進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究，提取溫度為50℃～80℃時(shí)，提高溫度能促進(jìn)黃酮的浸出，95℃時(shí)由于熱降解，黃酮濃度隨著時(shí)間的增加而減少。吐溫20的添加，能提高黃酮的浸出，但這種提高在高溫下會(huì)被削弱。利用Fick第二定律和二項(xiàng)式擬合，最終得到在50℃～80℃條件下，吐溫20輔助提取魚腥草黃酮的動(dòng)力學(xué)模型，該模型R2大于0.9，擬合效果較好。