麗江山荊子表兒茶素的分離純化及其抗氧化活性

任麗蓉，楊艷，付曉萍，李澤林，沈曉靜，范江平*

（1.云南農業(yè)大學 食品科學技術學院，云南 昆明 650000；2.德宏州科學技術創(chuàng)新中心，云南 德宏 678400）

山荊子，又稱山丁子、林荊子，屬薔薇科落葉禾木，其廣泛分布于內蒙古、東北、山西等地區(qū)[1-2]，它生長迅速，抗凍能力很強，能抵御-40℃的低溫[3]。成熟的山荊子果顏色鮮紅，具有誘人的外觀和獨特的風味[2]。山荊子用途廣泛，在蘋果生產(chǎn)、園林園藝、抗性砧木選擇等方面都有很好的價值，是很珍貴的蘋果野生種[4]。山荊子果實含有萜類、酯類、烯烴類、黃酮類、多酚類等物質，還含有許多微量元素、營養(yǎng)價值很高[5]。兒茶素屬多酚類物質，表兒茶素為兒茶素立體異構體中的一種物質[6]。表兒茶素具有抗氧化、保肝、抗癌、降血脂、抑菌、止血、保護神經(jīng)元細胞[7-12]等功效。目前鮮有對麗江山荊子表兒茶素抗氧化活性的報道，本試驗首先對麗江山荊子進行一系列的分離提純，得到純度較高的表兒茶素，再研究其體外抗氧化活性，以提高麗江山荊子生物利用率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山荊子：2015年9月在云南省麗江市玉龍縣拉市鄉(xiāng)采摘，經(jīng)鑒定為麗江山荊子果實，采摘后于-20℃冰箱保存。

甲醇（分析純）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radicals，DPPH）（分析純）：天津市風船化學試劑科技有限公司；2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽[2，2-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]：東京化成工業(yè)株式會社；維生素C（分析純）：上海申博化工有限公司；乙腈（色譜純）：廣東光華科技股份有限公司；過硫酸鉀（分析純）：江蘇強盛化工有限公司；硫酸亞鐵（分析純）、過氧化氫（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent-1200高效液相色譜：安捷倫科技有限公司；BSA124S-CW電子天平：賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；DW-YW508Y（-20℃）低溫冰箱：中科美菱低溫科技有限責任公司；SHZ-D真空泵：鞏義市予華儀器有限責任公司；hh-4恒溫水浴鍋：金壇市杰瑞爾電器有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計、BRUKER Advance600核磁共振儀、VGAutospec3000質譜儀：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 表兒茶素單體圖譜及標準曲線制作

分別用 0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 表兒茶素單體進行高效液相色譜分析。采用的色譜柱為ODS-80Ts QA柱（4.5 mm×150 mm），流動相A 相：0.05 mol/L磷酸∶乙腈∶水（體積比 5∶5∶90）；B 相：0.05 mol/L 磷酸∶乙腈∶水（體積比 5∶80∶15），設置柱溫：40 ℃；流速：0.8 mL/min；進樣量：10 μL；在280 nm波長下檢測，得出其出峰時間，制得標準曲線。

1.3.2 麗江山荊子的分離純化

首先采用甲醇超聲輔助提取，設置超聲頻率為40 kHz，功率120 W，超聲溫度60℃、超聲時間34 min。取2 kg麗江山荊子果實用20 L 60%甲醇溶液浸提，浸提3次，合并3次浸提液，濃縮至500 mL浸膏狀態(tài)，采用反向層析法將浸膏進行分離。將浸膏依次過MCICHP 20P柱層析，ODS柱層析和Sephadex柱層析。

1.3.2.1 MCI-CHP 20P柱層析分離純化

把MCI填充至柱子中，洗脫完成后每次加入50mL麗江山荊子浸膏，以每梯度300 mL的量依次加入100%蒸餾水、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的甲醇溶液進行梯度洗脫，每150 mL收集一次。將收集的樣品按照接取先后順序排列。

1.3.2.2 ODS柱層析分離純化

把ODS填充至柱子中，洗脫完成后每次加入20mL麗江山荊子浸膏，以每梯度200 mL的量依次加入100%蒸餾水、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40% 、45% 、50% 、55% 、60% 、65% 、70% 、75% 、80% 、100%的甲醇溶液進行梯度洗脫，每100 mL收集一次，將收集的樣品按照先后順序排列接取。

1.3.2.3 Sephadex柱層析分離純化

把Sephadex填充至柱子中，按照1.3.2.2中ODS分離純化方法進行收集。

1.3.2.4 高效液相色譜分析

對提取出來的物質進行高效液相色譜分析，用以檢查經(jīng)MCI-CHP 20P柱層析、ODS柱層析、Sephadex柱層析分離純化后的表兒茶素高效液相色譜出峰情況。

1.3.3 核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）鑒定和電噴霧電離-串聯(lián)質譜法（electrospray ionization tandem mass spectrometry，ESI-MS）鑒定

稱取10 mg干燥的單體，使用核磁甲醇溶液溶解，轉入NMR樣品管中（約2 cm），避光保存，以備NMR分析使用。對獲得的樣品進行1H-NMR、13C-NMR核磁共振分析，并對表兒茶素標品進行1H-NMR核磁共振分析。將樣品用精確度為萬分之一的電子天平各稱取1 mg，用2 mL氘代甲醇試劑溶解于樣品瓶中，以備質譜分析使用。

1.3.4 表兒茶素的體外抗氧化研究

采用化學顯色法及分光光度法進行抗氧化分析，明確其抗氧化活性。

1.3.4.1 表兒茶素的DPPH自由基清除能力

以甲醇作為溶劑配制0.1 mmol/L的DPPH溶液，分別吸取0.8 mL待測物和4 mL 0.1 mmol/L的DPPH溶液于10 mL離心管中搖勻，暗處放置30 min并不斷振蕩，以甲醇作為空白溶液進行調零，在517 nm條件下進行吸光度測定[13-15]。同時以1 mg/mL VC做陽性對照組，評估表兒茶素對DPPH自由基的清除效果，每個樣品測試3次。DPPH自由基清除率計算公式如下。

DPPH自由基清除率/%=[（A0-A）/A0]×100

式中：A0為未加樣的DPPH溶液（2 mL濃度為50%乙醇溶液+2 mL 0.1 mmol/L DPPH溶液）的吸光度；A為樣品與DPPH溶液反應后的吸光度。

1.3.4.2 表兒茶素的ABTS+自由基清除能力

將1.7 mmoL/mL ABTS溶液和2.45 mmoL/mL過硫酸鉀溶液等體積混合后，在暗處0℃～4℃下放置16 h，得ABTS工作液。用甲醇稀釋ABTS工作液到吸光度為0.7±0.05，之后加100 μL樣品于試管中，再加入3.8 mL稀釋后的ABTS工作液，室溫（25℃）下放置6 min后在波長為734 nm下測定吸光度，同時以1 mg/mL VC做為陽性對照組，評估表兒茶素對ABTS+自由基的清除效果[16]。每個樣品3次重復。ABTS+自由基清除率計算公式如下。

ABTS+自由基清除率/%=（1-A1/A0）×100

式中：A1為100 μL樣品溶液+ABTS工作液的吸光度；A0為3.8 mL稀釋后的ABTS工作液的吸光度。

1.3.4.3 表兒茶素對羥基自由基清除

配制0.15 mol/L FeSO4和2 mmol/L水楊酸鈉溶液，再別取1 mL均勻混合，再將1 mL樣品加入其中，最后加入6 mL 6 mmol/L H2O2啟動反應，在37℃條件下使其反應1 h，以超純水作為空白組在510 nm處測定吸光值，同時以1 mg/mL VC做為陽性對照組，用以評估表兒茶素對羥基自由基的清除效果[17-18]。每個樣測3次。羥自由基清除率計算公式如下。

羥基自由基清除率/%=[1-（A1-A2）/A0]×100

式中：A0為空白組的吸光度；A1為加羥基自由基的吸光度；A2為加樣品的吸光度。

1.3.4.4 表兒茶素還原能力測定

取1.0 mL樣品溶液于10 mL離心管中，加2.5 mL的磷酸鹽緩沖溶液和1%鐵氰化鉀溶液，混合均勻后在50℃水浴鍋中水浴20 min，再加2.5 mL 10%三氯乙酸溶液，在4 000 r/min條件下離心10 min得上清液，取1.0 mL上清液加到準備好的2.5 mL超純水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液中[19]。以超純水作為空白調零，在700 nm處測定吸光值，同時以1 mg/mL VC做為陽性對照組，用以評估表兒茶素的還原能力。

2 結果與分析

2.1 表兒茶素單體液相色譜分析

表兒茶素單體液相色譜圖見圖1。

圖1 0.2 mg/mL表兒茶素單體圖譜Fig.1 Monomer map of 0.2 mg/mL epigallocatechin

從圖1可以看出，表兒茶素的出峰時間為8.661min～8.666 min。在 0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 范圍內，根據(jù)表兒茶素單體的液相色譜圖得到表兒茶素的標準曲線：Y=9 074.9X-451.43，R2＝0.999，表明具有良好的線性關系。

2.2 Sephadex柱純化后表兒茶素高效液相色譜分析

經(jīng)Sephadex填充柱后表兒茶素的高效液相色譜圖見圖2。

圖2 經(jīng)Sephadex填充柱后表兒茶素的高效液相色譜圖Fig.2 High performance liquid chromatogram of epigallocatechin after Sephadex packed column

由圖2可知，麗江山荊子浸膏中表兒茶素的出峰時間為8.689，峰面積為729.780 09，即表兒茶素的純度達到了98%。把最終獲得的溶液經(jīng)旋轉蒸發(fā)濃縮后進行冷凍干燥，最終獲得121.4 mg粉末，含量為60.7 mg/kg。

2.3NMR和ESI-MS結果

表兒茶素單體化合物的1H-NMR分析見圖3，麗江山荊子果實純化產(chǎn)物的1H-NMR分析見圖4，麗江山荊子果實純化產(chǎn)物的13C-NMR分析見圖5，麗江山荊子果實純化產(chǎn)物的ESI質譜分析見圖6。

圖3 表兒茶素單體化合物的1H-NMR分析Fig.3 1H-NMR analysis of epigallocatechin monomer compound

圖4 麗江山荊子果實純化產(chǎn)物的1H-NMR分析Fig.4 1H-NMR analysis of the purified product of Malus rockii Rehd.

圖5 麗江山荊子果實純化產(chǎn)物的13C-NMR分析Fig.5 13C-NMR analysis of the purified product of Malus rockii Rehd.

圖6 麗江山荊子果實純化產(chǎn)物的ESI質譜分析Fig.6 ESI mass spectrometry analysis of the purified products of Malus rockii Rehd.

用MestReNova-5.3.1分析軟件分析處理化學成分單體核磁共振獲得的1H-NMR、13C-NMR圖譜，確定化學成分為表兒茶素。

甲醇中表兒茶素的1H和13C-NMR的光譜數(shù)據(jù)見表1。

表1 甲醇中表兒茶素的1H-NMR和13C-NMR的光譜數(shù)據(jù)Table 1 1H-NMR and13C-NMR spectral data of epigallocatechin in methanol

從表1可以看出，麗江山荊子純化產(chǎn)物1H-NMR結果與表兒茶素標準樣品相似；化合物的1H-NMR結果，質子 δH4.81（H-2，s）、δH4.17（H-3，s），δH2.85（H-4α，dd）和 δH2.73（H-4b，dd）及偶合的芳族質子信號δH5.93（H-6，d）和 δH5.90（H-8，d）存在黃烷-3-醇骨架。ABX 型芳香族信號存在 δH6.96（H-2'，d），δH6.75（H-5'，d）和 δH6.79（H-6'，dd），從而推測其基本結構為 3，3'，4'，5，7-七羥基黃烷。樣品13C-NMR 圖譜顯示分子中有 15 個碳信號，即 δC79.9（C-2），67.5（C-3），29.2（C-4），157.9（C-5），96.3（C-6），158.0（C-7），96.1（C-8），157.4（C-9），100.1（C-10），132.3（C-1'），115.3（C-2'），145.8 （C-3'），145.9 （C-4'），115.9 （C-5'）和119.4（C-6'）?；衔锏?ESI-MS分析結果（圖 6）顯示，[M-H]-在m/z 289處有最強峰值。上述1H-NMR和13C-NMR結果與現(xiàn)有研究報道結果基本一致[20-24]，故推斷為（-）-表兒茶素。

2.4 抗氧化試驗結果

2.4.1 清除DPPH自由基

表兒茶素對DPPH自由基的清除率如圖7所示。

由圖7可知，1.0mg/mL的維生素C的DPPH自由基清除率達（95.66±0.06）%，IC50為（0.1030±0.000 5）mg/mL。隨著表兒茶素濃度的升高，其清除DPPH自由基的效果不斷增強，且濃度到達0.055、0.065mg/mL和0.075mg/mL時與1mg/mL的維生素C相比已不存在顯著性。當濃度達到0.045mg/mL時DPPH自由基清除率超過了90%，0.075mg/mL時清除率為（95.81±0.58）%，IC50為（0.0197±0.000 9）mg/mL，說明0.075 mg/mL表兒茶素對DPPH自由基的清除率與1 mg/mL維生素C清除率相當，表明表兒茶素具有較好的DPPH自由基清除效果。

圖7 表兒茶素對DPPH自由基的清除率Fig.7 The scavenging rate of epigallocatechin on DPPH free radicals

2.4.2 清除ABTS+自由基

表兒茶素對ABTS+自由基的清除率如圖8所示。

圖8 表兒茶素對ABTS+自由基的清除率Fig.8 The scavenging rate of epigallocatechin on ABTS+free radicals

從圖8可以看出，1.0mg/mL的VC的ABTS+自由基清除率為（97.46±0.12）%，IC50為（0.104 0±0.001 5）mg/mL。隨著表兒茶素濃度的升高，其清除ABTS+自由基的效果不斷增強，當表兒茶素濃度為0.0750 mg/mL時對ABTS+自由基清除率為（98.05±1.92）%，IC50為（0.038 0±0.000 5）mg/mL，表明表兒茶素能夠有效地清除ABTS+自由基。

2.4.3 清除羥自由基

表兒茶素對羥自由基的清除率如圖9所示。

圖9 表兒茶素對羥自由基的清除率Fig.9 The scavenging rate of epigallocatechin on hydroxyl free radicals

從圖9可以看出，1.0 mg/mL的維生素C能夠清除（97.40±0.050 0）%的羥基自由基，IC50值為（0.102 0±0.0010）mg/mL。表兒茶素在0.0250mg/mL到0.0750mg/mL清除羥自由基率呈增長趨勢。在0.075 0 mg/mL時對羥自由基清除率為（48.13±3.580 0）%，IC50值為（0.077 0±0.004 5）mg/mL，表明表兒茶素具有一定的清除羥自由基效果，但效果不如1.0 mg/mL的維生素C效果明顯。

2.4.4 還原能力測定

表兒茶素還原能力如圖10所示。

圖10 表兒茶素還原能力Fig.10 Epigallocatechin reduction ability

從圖10可以看出，1.0 mg/mL的維生素C的還原能力為0.400 0±0.002 5。表兒茶素在0.025 0 mg/mL到0.075 0 mg/mL還原力呈增長趨勢。在0.075 0 mg/mL時的還原力為0.253 0±0.020 5，表明表兒茶素具備一定的還原能力。

3 結論

在對麗江山荊子的提取中，首先采用甲醇超聲波輔助提取法得到粗提取物浸膏，再將浸膏依次經(jīng)過MCI-CHP 20P柱層析，ODS柱層析和Sephadex柱層析進行一系列分離純化，經(jīng)高效液相色譜分析發(fā)現(xiàn)其純度達到了98%，具有很高的純度，再采用NMR和ESIMS分析所得樣品的化學結構，確定為表兒茶素，計算得表兒茶素的最終含量為60.7 mg/kg。

在體外抗氧化試驗中，麗江山荊子對幾種自由基都表現(xiàn)出較強的清除作用，也具有一定的還原能力，在試驗濃度范圍內，其清除效果隨著劑量增加而逐漸增強。在清除DPPH自由基中，表兒茶素濃度在0.075 mg/mL 時清除率為（95.81±0.580 0）%，IC50為（0.0197±0.0009）mg/mL；在清除 ABTS+自由基中，表兒茶素濃度在0.0750mg/mL時清除率為（98.05±1.920 0）%，IC50為（0.0380±0.0005）mg/mL；在清除羥自由基中，表兒茶素濃度在0.0750mg/mL時清除率為（48.13±3.5800）%，IC50為（0.077 0±0.004 5）mg/mL；表兒茶素還原能力較清除自由基能力較弱，在0.075 0 mg/mL時還原力為0.253 0±0.020 5。本研究以期為麗江山荊子的進一步開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。