藥桑葉中金絲桃苷及其異構體分離鑒定

◎ 張貴會，劉佳潔，趙金梅

（1.扎魯特旗市場檢驗檢測中心，內(nèi)蒙古 通遼 029100；2.扎魯特旗伊和學校，內(nèi)蒙古 通遼 029100；3.通遼市科爾沁左翼中旗門達中心校，內(nèi)蒙古 通遼 029100）

藥桑在植物分類學上屬?？疲∕oraceac）、桑屬（MorusL.）、黑桑種（Morus nigraL.），是我國國內(nèi)唯一具有22倍花性染色體的桑品種，是新疆目前桑品種分類鑒定中唯一黑桑種[1]。藥桑葉是維吾爾族民間藥材，可治療多種疾病[2]。桑葉含多種化學成分，其中黃酮類成分具有抗結腸癌[3]、保肝、心腦血管保護、神經(jīng)系統(tǒng)保護、抗氧化和清除人體自由基等多種功能，因此受到人們越來越多的關注和研究[4]。桑葉黃酮類化合物含量占桑葉干重的2.53%，是所有植物莖葉中黃酮類化合物含量較高的一種[5]。金絲桃苷廣泛存在于各種植物體內(nèi)，通常與其眾多的結構類似物并存，給化合物的純化帶來一定困難。目前，分離純化常采用的方法有溶劑萃取法、聚酰胺樹脂、大孔樹脂、葡聚糖凝膠柱層析和高速逆流色譜，這些方法得率較低。本研究將萃取、大孔樹脂、中壓柱色譜、制備液相色譜法相結合，較簡便地分離得到高純度槲皮素-3-O-葡萄糖苷及其異構體金絲桃苷。該方法可為制備高純度槲皮素-3-O-葡萄糖苷及金絲桃苷對照品提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藥桑葉，2021年8月采集，采自新疆和田，經(jīng)扎魯特旗市場檢驗檢測中心孟凡林中藥師鑒定為藥桑葉；D-101型大孔吸附樹脂；乙腈、甲醇、甲酸，均為進口色譜純；95%乙醇、石油醚、氯仿和乙酸乙酯，均為市售分析純。

1.2 儀器與設備

Thermo TSQ Quantum三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀（美國賽默飛世爾有限公司）；2767 waters制備液相色譜（美國waters公司）；e2695高效液相色譜儀（沃特世科技有限公司）；C-605中壓柱色譜系統(tǒng)（瑞士步琪有限公司）；旋轉蒸發(fā)儀RE-5299（上海亞榮生化儀器廠）；電子天平MS105DU（梅特勒-托利多儀器有限公司）；AV 600超導核磁共振波譜儀（瑞士Bruker公司）；真空干燥箱DEF-6020（上海鴻都電子科技有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 黃酮提取分離

取藥桑葉粉末10.00 kg，用體積分數(shù)95%的乙醇與藥桑葉粉末25∶1（L∶kg）混勻，在常溫下浸泡96 h，重復浸提3次，過濾、合并濾液減壓濃縮，濃縮至無醇味得到粗提物，將粗提物用水分散，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，回收得各萃取部分質(zhì)量分別為45.28 g、38.45 g、35.58 g，稱取230 g大孔吸附樹脂用95%乙醇浸泡48 h，用蒸餾水洗滌至無醇味。采用濕法裝柱（120 cm×3.6 cm，柱體積500 mL），待柱平衡后，對上述乙酸乙酯萃取物進行純化，用蒸餾 水-95%乙 醇（90∶10、80∶20、60∶40、40∶60、20∶80，V/V）洗脫，流速為1.00 mL·min-1，經(jīng)薄層層析分析，合并相同餾分，極性從大到小分為五部分（Ⅰ～Ⅴ）。用高效液相色譜儀進行檢測，第Ⅳ部分成分較少，對第Ⅳ部分使用C18粉末拌樣，經(jīng)中壓柱色譜，用水-甲醇（85∶15、50∶50、40∶60，V/V）梯度洗脫，流速為25 mL·min-1，合并相同餾分，得到A、B、C 3段餾分。

1.3.2 液相色譜分離條件

（1）高效液相色譜分離條件。色譜柱：Waters-Tnature（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長285.0 nm；進樣濃度2.0 g·L-1；進樣量10 μL；流動相：乙腈-水（含0.1%甲酸）。本實驗考察了流動相比例[40%乙腈-60%水（含0.1%甲酸）、60%乙腈-40%水（含0.1%甲酸）、90%乙腈-10%水（含0.1%甲酸）、95%乙腈-5%水（含0.1%甲酸）]、柱溫箱溫度（25.0 ℃、35.0 ℃、40.0 ℃、45.0 ℃）、流動相流速（0.4 mL·min-1、0.6 mL·min-1、0.8 mL·min-1、1.0 mL·min-1）對分析效果的影響。

（2）制備液相色譜分離條件。色譜柱：Waters Xbridge（300 mm×21 mm，10 μm）；95%乙腈-5%水（含0.1%甲酸）等度洗脫30 min；上樣量100 mg；流速15 mL·min-1；柱溫40 ℃；檢測波長285 nm。

2 結果與分析

2.1 餾分B高效液相色譜（HPLC）分析

由圖1可知，餾分B在流動相為100%乙腈、流速1 mL·min-1、檢測波長285.0 nm、柱溫箱溫度為35.0 ℃的條件下進行液相色譜分析，兩種物質(zhì)分離度低，表明它們的結構相似，有一定的分離難度。對高效液相色譜分離條件進行優(yōu)化，當流動相為95%乙腈-5%水（含0.1%甲酸）、柱溫箱溫度40 ℃、流速0.8 mL·min-1時，餾分B中兩種物質(zhì)分離效果比較好，見圖2。圖2中峰1物質(zhì)的出峰時間為13.80 min，峰2物質(zhì)的出峰時間為17.98 min，兩物質(zhì)實現(xiàn)了基線分離，能得到較高純度的單體化合物。

2.2 高效制備液相色譜分離餾分B

如圖3所示，通過高效制備液相可將兩種物質(zhì)完全分離，收集分離組分，真空干燥濃縮，采用HPLC峰面積計算兩種物質(zhì)的純度。結果顯示，峰1物質(zhì)的純度可達98.7%、峰2物質(zhì)純度可達97.8%。

圖1 餾分B液相色譜圖

圖2 餾分B兩種物質(zhì)實現(xiàn)分離的液相色譜圖

圖3 兩種物質(zhì)的制備液相色譜圖

2.3 結構鑒定

將純化后的兩種成分進行質(zhì)譜及核磁共振鑒定。

C21H20O12，電噴霧電離質(zhì)譜m/z：465.2 [M＋H]＋；1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）δ：12.50（1H，s，5-OH）、6.15（1H，d，J=1.2 Hz，H-6）、6.37（1H，d，J=1.2 Hz，H-8）、7.58（1 H，d，J=1.8 Hz，H-2′）、6.90（1H，d，J=7.8 Hz，H-5′）、7.59（1H，dd，J=1.8、7.8 Hz，H-6′）、5.44（1H，d，J=7.2 Hz，H-1″）。13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz）δ：156.55（C-2）、133.88（C-3）、177.78 （C-4）、161.65（C-5）、102.37（C-6）、165.52（C-7）、94.08（C-8）、156.84（C-9）、104.03（C-10）、121.47（C-1′）、115.64（C-2′）、145.35（C-3′）、149.08（C-4′）、116.33（C-5′）、122.42（C-6′）、99.39（C-1″）、76.29（C-2″）、73.68（C-3″）、71.68（C-4″）、68.37（C-5″）、60.58（C-6″）。該數(shù)據(jù)與文獻[6-7]一致。確定峰1物質(zhì)為金絲桃苷。

C21H20O12，電噴霧電離質(zhì)譜m/z：465.2 [M＋H]＋；1H-NMR（DMSO-d6，600 MHz）δ：12.55（1H，s，5-OH）、6.11（1H，d，J=1.2 Hz，H-6）、6.23（1H，d，J=1.2 Hz，H-8）、7.55（1H，d，J=1.2 Hz，H-2′）、6.90（1H，d，J=7.8 Hz，H-5′）、7.65（1H，dd，J=1.8，7.8 Hz，H-6′）、5.40（1H，d，J=7.2 Hz，H-1″）。13C-NMR（DMSO-d6，150 MHz）δ：156.92（C-2）、133.69（C-3）、177.75（C-4）、161.55（C-5）、99.48（C-6）、164.75（C-7）、94.12（C-8）、156.45（C-9）、104.13（C-10）、122.10（C-1′）、115.74（C-2′）、145.44（C-3′）、149.14（C-4′）、116.55（C-5′）、121.48（C-6′）、101.35（C-1″）、74.40（C-2″）、76.89（C-3″）、70.12（C-4″）、78.12（C-5″）、61.24（C-6″）。該數(shù)據(jù)與文獻[8]一致，確定峰2物質(zhì)為槲皮素-3-O-葡萄糖苷。

3 結論

本研究采用傳統(tǒng)分離法和中壓柱色譜法從藥桑葉乙酸乙酯萃取物中得到金絲桃苷及其異構體的混合物，在分離條件為色譜柱Waters Xbridge（300 mm×21 mm，10 μm），流動相為95%乙腈-5%水（含0.1%甲酸）等度洗脫30 min，上樣量100 mg，流速15 mL·min-1；柱溫40 ℃；檢測波長285 nm條件下混合物得到分離，經(jīng)高效液相純度檢測，金絲桃苷的純度為98.7%、槲皮素-3-O-葡萄糖苷純度為97.8%。本方法為金絲桃苷、槲皮素-3-O-葡萄糖苷兩種同分異構體的分離提供方法參考。