靶向HDGF-siRNA轉(zhuǎn)染對小鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的影響

楊榮嬌 廖劍敏

【摘要】 目的：探討肝癌衍生生長因子（HDGF）的小分子干擾RNA（siRNA）對BALB/c小鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的影響。方法：選擇78只SPF級BALB/c雄性小鼠，應(yīng)用盲腸造疝原位接種瘤塊法建立小鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移模型。將成功建模的小鼠隨機(jī)分為3組，即HDGF-siRNA組、NS-siRNA組與生理鹽水（NS）組。根據(jù)分組情況，分別于腫瘤原位注射HDGF-siRNA、非特異性siRNA（NS-siRNA）及生理鹽水，劑量均為0.15 ng/kg，連續(xù)治療30 d。分時(shí)間點(diǎn)記錄各組小鼠體質(zhì)量的變化。治療結(jié)束3 d后處死小鼠，肉眼及肝臟切片蘇木素-伊紅（HE）染色觀察各組結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果：治療5、10、15、20、25和30 d后，HDGF-siRNA組的體質(zhì)量均明顯高于NS-siRNA組與NS組，NS-siRNA組的體質(zhì)量均明顯高于NS組（P<0.05）。HDGF-siRNA組的肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)明顯少于NS-siRNA組及NS組，肝轉(zhuǎn)移率明顯低于NS-siRNA組及NS組（P<0.05）。NS-siRNA組的肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)明顯少于NS組（P<0.05），NS-siRNA組與NS組的肝轉(zhuǎn)移率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論：HDGF-siRNA可靶向抑制HDGF，從而降低小鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生，HDGF在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中可能起了重要作用。

【關(guān)鍵詞】 肝癌衍生生長因子 小分子干擾RNA 結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移 HDGF-siRNA BALB/c小鼠

Effect of Targeting HDGF-siRNA Transfection on Liver Metastasis of Colorectal Cancer in Mice/YANG Rongjiao， LIAO Jianmin. //Medical Innovation of China， 2022， 19（02）： 0-031

[Abstract] Objective： To investigate the effect of small interfering RNA （siRNA） of hepatoma-derived growth factor （HDGF） on liver metastasis of colorectal carcinoma in BALB/c mice. Method： A total of 78 SPF BALB/c

male mice were used to establish the model of hepatic metastasis of colorectal cancer. The tumor-bearing mice were randomly divided into three groups， namely HDGF-siRNA group， NS-siRNA group and normal saline （NS） group. According to the grouping， HDGF-siRNA， normal saline nonspecific siRNA （NS-siRNA） and normal saline were injected into the tumor in situ at the dose of 0.15 ng/kg for 30 d. The changes of body weight of each group were recorded at time points. The mice were killed 3 d after treatment. The liver metastasis of colorectal cancer in each group was observed by naked eye and hematoxylin-eosin （HE） staining. Result： After treatment for 5， 10， 15， 20， 25 and 30 d， the body weights of HDGF-siRNA group were significantly higher than those of NS-siRNA group and NS group （P<0.05）. The number of liver metastasis nodules in HDGF-siRNA group was significantly less than those in NS-siRNA group and NS group， and the liver metastasis rate was significantly less than those in NS-siRNA group and NS group （P<0.05）. The number of hepatic metastatic nodules in NS-siRNA group was significantly less than that in NS group （P<0.05）， there was no significant difference in liver metastasis rate between NS-siRNA group and NS group （P>0.05）. Conclusion： HDGF-siRNA can inhibit HDGF and reduce the occurrence of liver metastasis of colorectal cancer in mice， HDGF-siRNA may play an important role in liver metastasis of colorectal cancer.

[Key words] Liver cancer derived growth factor Small interfering RNA Liver metastasis of colorectal cancer HDGF-siRNA BALB/c mice

First-author’s address： The People’s Hospital of Qingyuan City， Guangdong Province， Qingyuan 511518， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2022.02.007

隨著我國人們膳食結(jié)構(gòu)改變及老齡化形勢日益加重，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率越來越高[1]。同時(shí)，結(jié)直腸癌患者較易發(fā)生肝臟侵襲，而肝轉(zhuǎn)移也是結(jié)直腸癌患者的主要死亡原因[2-3]。雖然，近年來結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移臨床治療技術(shù)均有較大提升，如手術(shù)、放化療等，但臨床效果不太理想，患者預(yù)后差[4]。RNA干擾技術(shù)是快速高效關(guān)閉基因的分子生物學(xué)方法，可使目的基因表達(dá)被有效阻斷。研究顯示，肝癌衍生生長因子（HDGF）可通過誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）產(chǎn)生，促進(jìn)血管生成和腫瘤生長[5-6]，與胃癌、膽囊癌、胰腺癌、食管癌、腎癌、肺癌等多種惡性腫瘤的生長進(jìn)展相關(guān)[7-12]。本研究擬以HDGF為靶點(diǎn)，在體內(nèi)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移動(dòng)物模型基礎(chǔ)上，探討靶向HDGF-siRNA轉(zhuǎn)染對小鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的影響。

1 材料與方法

1.1 基因序列的設(shè)計(jì) 通過進(jìn)入National center for biotechnology數(shù)據(jù)庫中，找到HDGF cDNA的全長堿基序列，利用廣州道森生物科技有限公司的“siRNA Target Finder and Design Tools”軟件設(shè)計(jì)HDGF-siRNA序列，最終設(shè)計(jì)出3條針對HDGF-siRNA正反義鏈序列：（1）siRNA1，CAACAAAUACCAAGUCUUU dTdT，dTdT GUUGUUUAUGGUUCAGAAA;（2）siRNA2，CAAGGAGAAGAACGAGAAA dTdT，dTdT GUUCCUCUUCUUGCUCUUU;（3）siRNA3，CUACCAAGGAAGAUGCUGA dTdT，dTdT GAUGGUUCCUUCUACGACU）。陰性對照siRNA（NS-siRNA）自行設(shè)計(jì)，以上設(shè)計(jì)好后均交由廣州道森生物科技有限公司合成。

1.2 小鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移模型的建

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇78只SPF級BALB/c小鼠[購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，生產(chǎn)許可編號：SXCK（粵）2018-0002]，周齡為6～8周，均為雄性，體質(zhì)量為17～22 g。飼養(yǎng)條件：自然采光，溫度和為濕度分別調(diào)節(jié)為18～25 ℃和60%～70%，喂養(yǎng)給予普通飼料和自由飲水。

1.2.2 CT26細(xì)胞懸液的制備 將小鼠結(jié)腸腺癌細(xì)胞（CT26細(xì)胞）置于RPMI-1640培養(yǎng)液（含10%胎牛血清）中，培養(yǎng)條件為5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱和37 ℃，應(yīng)用0.25%胰蛋白酶消化法對指數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行處理，并經(jīng)機(jī)械吹打，制成細(xì)胞懸液，并離心5 min（轉(zhuǎn)速1 000 r/min），棄去上清液，加入生理鹽水配制成濃度為1×106/mL，應(yīng)用臺盼藍(lán)染色法檢測細(xì)胞活力>95%。

1.2.3 實(shí)體瘤的獲得 隨機(jī)抓取2只小鼠，于項(xiàng)背部皮下注射0.4 mL的CT26細(xì)胞懸液，10 d后可見有腫塊（直徑約1 cm）形成，對其進(jìn)行組織取樣，經(jīng)病理檢查確診為癌組織。

1.2.4 盲腸造疝原位接種瘤塊術(shù) 對小鼠進(jìn)行全身麻醉，使用50 mg/mL的舒泰50進(jìn)行肌肉注射，劑量為0.01 mL/10 g。然后取仰臥位，固定其四肢，對腹部術(shù)野使用75%酒精進(jìn)行消毒，對左下腹皮膚做直徑約2 cm的縱向切口，稍微游離切口右側(cè)皮膚及皮下組織，進(jìn)腹，將盲腸拖出體外，并刮破其拖出段的中央位置的漿膜，再將瘤塊（直徑約2 mm）置入漿膜刮破處，采取荷包縫合包埋術(shù)，再將盲腸拖出段埋回腹腔，并進(jìn)行腹壁縫合[13-14]。術(shù)后小鼠在SPF條件下飼養(yǎng)。

1.3 動(dòng)物模型分組與治療 成功建模后，隨機(jī)將78只小鼠分為3組，各26只，分別為HDGF-siRNA組、NS-siRNA組與NS組，于腫瘤原位分別注射靶向HDGF-siRNA、非特異性siRNA（NS-siRNA）及生理鹽水（NS），劑量均為0.15 ng/kg，每周2次，連續(xù)治療30 d。治療結(jié)束3 d后，對小鼠進(jìn)行CO2吸入法處死。

1.4 觀察指標(biāo) 成功建模后，分別于治療前及治療1、5、10、15、20、25、30 d后記錄小鼠的體質(zhì)量。對小鼠進(jìn)行剖腹手術(shù)，摘取肝臟，并稱重標(biāo)記大小。（1）光鏡觀察：使用10%甲醛對肝臟組織進(jìn)行固定，石蠟包埋，切片（4 μm），行蘇木素-伊紅（HE）染色，并行光鏡下觀察。（2）顯微鏡觀察：取相距為2 mm的肝臟冠狀切面組織共5個(gè)，以最大冠狀切面為中心，并行顯微鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)。肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)=肉眼下計(jì)數(shù)+顯微鏡下計(jì)數(shù)。若同一肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)在不同切面出現(xiàn)應(yīng)視為1個(gè)肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。以肉眼及顯微鏡下未見轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)的視為無肝轉(zhuǎn)移發(fā)生，反之出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，比較各組轉(zhuǎn)移率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件，計(jì)量數(shù)據(jù)以（x±s）表示，三組間比較行F檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)以率（%）表示，比較行字2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組肝轉(zhuǎn)移模型小鼠體質(zhì)量變化比較 治療前和治療1 d后，三組體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;治療5、10、15、20、25和30 d后，HDGF-siRNA組的體質(zhì)量均明顯高于NS-siRNA組與NS組，NS-siRNA組的體質(zhì)量均明顯高于NS組（P<0.05）。見表1。

2.2 肉眼觀察各組小鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移情況 肉眼觀察，HDGF-siRNA組可見肝臟質(zhì)軟，呈紅褐色，形態(tài)相對正常，表面光滑，可見少量轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，NS-siRNA組和NS組均可見肝臟解剖結(jié)構(gòu)異常，呈暗紅色，表面可見較多轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)。見圖1、2、3。HDGF-siRNA組、NS-siRNA組和NS組肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)分別為（1.67±0.52）、（4.17±0.98）、（10.50±1.28）個(gè)，HDGF-siRNA組肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)明顯少于NS-siRNA組及NS組（P<0.05），而NS-siRNA組肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)明顯少于NS組（P<0.05）。

2.3 肝臟切片HE染色觀察各組結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移情況 肝臟組織切片在光鏡下可見腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)巢狀聚集，異型性大，分化程度差，并且發(fā)生細(xì)胞核固縮、核碎裂及小片狀壞死，則為肝轉(zhuǎn)移。在光鏡下，HDGF-siRNA組有2例發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，肝轉(zhuǎn)移率為7.69%。見圖4。NS-siRNA組有14例發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，肝轉(zhuǎn)移率為53.85%。見圖5。NS組有19例發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，肝轉(zhuǎn)移率為73.08%。見圖6。HDGF-siRNA組的肝轉(zhuǎn)移率明顯低于NS-siRNA組及NS組（字2=13.000、23.084，P<0.05），NS-siRNA組的結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移率與NS組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（字2=2.073，P>0.05）。

3 討論

結(jié)直腸癌為臨床上常見的一種消化系統(tǒng)惡性腫瘤，呈逐年上升趨勢。2015年我國結(jié)直腸癌新發(fā)病例數(shù)為38.8萬人，在全部惡性腫瘤中位居第3位[4];結(jié)直腸癌死亡患者18.7萬人，死亡率居第5位[3]。因早期結(jié)直腸癌缺乏典型臨床癥狀，絕大多數(shù)患者診斷時(shí)已處于中晚期，且已出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，其中最常見的為肝轉(zhuǎn)移。

HDGF為肝癌衍生生長因子，近年來大量研究證實(shí)其在多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，并參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞凋亡、生長、分化和遷移等生物學(xué)過程，與腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的臨床病理學(xué)特征顯著相關(guān)。文獻(xiàn)[15-16]研究發(fā)現(xiàn)，HDGF-siRNA不僅有效阻斷HDGF在結(jié)直腸癌lovo細(xì)胞的表達(dá)，而且明顯抑制其增殖，從而在體外可有效誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡。劉展等[17]研究發(fā)現(xiàn)，慢病毒RNAi載體可使HDGF表達(dá)明顯下調(diào)，有效抑制體外結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖。周南翔[18]和周艷艷等[19]研究顯示，HDGF在肝癌組織和HepG2細(xì)胞中高表達(dá)，是肝癌獨(dú)立的預(yù)后預(yù)測因子，而siRNA可對其表達(dá)進(jìn)行靶向抑制，從而影響肝癌細(xì)胞功能、增殖和侵襲力，而HDGF可能會(huì)成為良好的結(jié)直腸癌基因治療分子靶點(diǎn)。郭忠聰?shù)萚20]研究顯示，抗癌防移片可能通過抑制結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移模型BALB/c小鼠HDGF和血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)，抑制血管新生，從而抑制結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，治療1 d后，三組小鼠萎靡少動(dòng)，進(jìn)食和飲水量減少，體質(zhì)量均有下降，考慮為麻醉及手術(shù)刺激所致。治療5 d后，HDGF-siRNA組小鼠體質(zhì)量恢復(fù)至術(shù)前，至第30天取材前體質(zhì)量較治療前稍有增加。NS-siRNA組小鼠體質(zhì)量在治療20 d后漸恢復(fù)至治療前。NS組小鼠體質(zhì)量仍呈進(jìn)行性下降。治療5、10、15、20、25和30 d后，HDGF-siRNA組的體質(zhì)量均明顯高于NS-siRNA組與NS組，NS-siRNA組的體質(zhì)量明顯高于NS組（P<0.05）。且HDGF-siRNA組的肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)均明顯少于NS-siRNA組及NS組，肝轉(zhuǎn)移率明顯低于NS-siRNA組及NS組，NS-siRNA組的肝轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)明顯少于NS組（P<;0.05）。

綜上所述，HDGF-siRNA靶向抑制HDGF可降低小鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生，HDGF在腫瘤轉(zhuǎn)移中可能起了重要作用。本研究結(jié)果可能會(huì)為治療結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移提供一個(gè)新的思路和方法，有望以HDGF為靶點(diǎn)開發(fā)新藥物用于結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的防治。

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（收稿日期：2021-11-25） （本文編輯：占匯娟）