結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)miRNAs的初步研究

傅天豪，廖錫文，周鑫，王向坤，劉峻奇，韋仲柳，朱廣志，龔藝貞，彭濤△

1 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科 廣西南寧 530021

2 桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院循證醫(yī)學(xué)教研室 廣西桂林 541001

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界范圍內(nèi)最常見的癌癥之一，根據(jù)2020年全球癌癥數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果，CRC在全球新發(fā)癌癥及因癌癥而死亡的人數(shù)中分別居第三位和第二位[1]。結(jié)直腸癌的主要死亡原因是腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，約20%的患者在初次診斷時(shí)已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。在結(jié)直腸癌患者中，腫瘤轉(zhuǎn)移主要累及肝和肺[2]，其中大部分患者死于腫瘤的肝轉(zhuǎn)移[3]。目前認(rèn)為手術(shù)切除是治療結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移最有效的方法，可提高患者的五年生存率，但是只有25%左右的患者具備手術(shù)切除指征[4]。結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌治療的重點(diǎn)和難點(diǎn)之一，因腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的、連續(xù)的和多因素綜合作用的過程。研究結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制，探索其潛在的診療靶點(diǎn)，將有助于尋找治療結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的新療法。目前臨床上已有較多關(guān)于結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移潛在機(jī)制的研究[5-8]，包括：TGF-β在基因重組結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移中驅(qū)動(dòng)免疫逃逸；PRRX2通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路而導(dǎo)致其失活，抑制結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移等。但是上述方法目前特異度和靈敏度均不高，臨床應(yīng)用價(jià)值較為有限。因此，尋找新的結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移診療標(biāo)志物具有重要的臨床意義。

本研究基于GEO數(shù)據(jù)庫中的結(jié)腸癌原發(fā)灶組織和肝轉(zhuǎn)移灶組織的miRNAs數(shù)據(jù)集進(jìn)行差異分析，篩選出可能影響結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的差異表達(dá)的miRNAs（differentially expressed miRNAs，DEMs），隨后利用TCGA數(shù)據(jù)庫中的結(jié)腸癌（colon adenocarcinoma，COAD）的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行生存分析，評(píng)估DEMs對(duì)患者生存預(yù)后的影響，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 倫理認(rèn)可

本次研究中所有的數(shù)據(jù)均來源于GEO和TCGA公共數(shù)據(jù)庫，納入的GEO和TCGA數(shù)據(jù)庫中的所有數(shù)據(jù)均已開源共享，且本研究不涉及任何動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及人體試驗(yàn)。

1.2 數(shù)據(jù)集的下載和預(yù)處理

（1）從GEO數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/；訪問日期：2021年4月22日）中下載結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的miRNAs表達(dá)數(shù)據(jù)，以miRNAs，colon cancer and liver metastasis為檢索式，檢索到符合分析要求的包含結(jié)腸癌原發(fā)灶組織、癌旁正常組織和肝轉(zhuǎn)移灶組織的miRNAs芯片數(shù)據(jù)集。GSE98406數(shù)據(jù) 集 （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE98406）被挑選出來。該數(shù)據(jù)集包括14個(gè)結(jié)腸癌原發(fā)灶組織、7個(gè)癌旁正常組織、7個(gè)正常肝組織和14個(gè)肝轉(zhuǎn)移灶組織的25 533個(gè)RNA，去除包括莖環(huán)RNA在內(nèi)的其余23 800個(gè)非miRNAs，最終納入1 733個(gè)miRNAs用于后續(xù)分析。

（2）從TCGA數(shù)據(jù)庫下載465個(gè)結(jié)腸癌（COAD）的miRNAs樣本和對(duì)應(yīng)的臨床信息。去除其中的癌旁正常組織、重復(fù)標(biāo)本及無臨床信息樣本，最終納入442例COAD患者的臨床信息用于后續(xù)的生存分析。

1.3 miRNAs的生物信息學(xué)分析

使用R軟件包limma對(duì)GEO數(shù)據(jù)庫中納入的miRNAs按照結(jié)腸癌原發(fā)灶組織與肝轉(zhuǎn)移灶組織分組進(jìn)行差異分析篩選，設(shè)差異倍數(shù)|LogFC|>0.5，顯著性閾值P<0.05。隨后按照miRNAs在結(jié)腸癌原發(fā)灶組織及肝轉(zhuǎn)移灶組織的表達(dá)量，在R平臺(tái)上通過pheat?map包繪制表達(dá)譜熱圖。TCGA數(shù)據(jù)庫中的miRNAs測(cè)序數(shù)據(jù)集歸一化采用edgeR包在R平臺(tái)中進(jìn)行處理。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Log-rank檢驗(yàn)對(duì)所篩選出的DEMs進(jìn)行生存分析，對(duì)與生存預(yù)后相關(guān)的DEMs進(jìn)一步使用Graph?Pad Prism 8.0繪制Kaplan-Meier生存曲線。miRNAs表達(dá)水平高于平均數(shù)（取COAD的miRNAs表達(dá)量平均數(shù)）的患者歸為高表達(dá)組，剩余患者歸為低表達(dá)組。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DEMs的篩選

根據(jù)差異倍數(shù)（|LogFC|>0.5）和顯著性閾值（P<0.05），對(duì)GSE98406數(shù)據(jù)集中的1 733個(gè)miRNAs進(jìn)行差異分析，在結(jié)腸癌原發(fā)灶組織與肝轉(zhuǎn)移灶組織之間共篩選出13個(gè)DEMs，提示這些DEMs可能與結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)。見表1。

表1 DEMs的篩選結(jié)果

2.2 DEMs的表達(dá)情況

針對(duì)13個(gè)DEMs繪制表達(dá)譜熱圖分析其表達(dá)情況，結(jié)果顯示miR-122在肝轉(zhuǎn)移灶組織中高表達(dá)，其余DEMs均在結(jié)腸癌原發(fā)灶組織中高表達(dá)。見圖1。

圖1 DEMs表達(dá)譜熱圖

2.3 生存分析

利用TCGA數(shù)據(jù)庫中的信息，采用單因素生存分析探討13個(gè)DEMs對(duì)患者生存預(yù)后的影響，結(jié)果顯示只有miR-497與患者的生存預(yù)后相關(guān)（P<0.05）。隨后進(jìn)一步繪制miR-497的生存曲線，結(jié)果顯示miR-497低表達(dá)者的生存時(shí)間更長（P<0.05）。由此推測(cè)miR-497對(duì)結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移可能起促進(jìn)作用，其高表達(dá)可能與患者的不良預(yù)后相關(guān)。見圖2。

圖2 miR--497的生存曲線

3 討論

microRNA（miRNA）是由21～23個(gè)核苷酸組成的單鏈非編碼RNA，通常被認(rèn)為是mRNA的負(fù)調(diào)控因子[9]。一個(gè)miRNA可以靶向數(shù)百個(gè)mRNA，參與細(xì)胞周期的調(diào)控[10]。miRNAs在腫瘤中具有促進(jìn)腫瘤發(fā)展和抑制腫瘤發(fā)展的兩種不同的作用。腫瘤組織中特異性miRNAs的鑒定有助于腫瘤治療靶點(diǎn)的開發(fā)。目前臨床上已有較多關(guān)于miRNAs與腫瘤之間關(guān)系的研究，如：Bersimbaev等[11]發(fā)現(xiàn)，長期氡暴露可以導(dǎo)致肺內(nèi)大量miRNAs表達(dá)失調(diào)，并與功能肺損傷相關(guān)，可能誘發(fā)肺癌。Que等[12]的研究表明，miR-9501在乳腺癌組織和細(xì)胞株中表達(dá)水平明顯降低，可能通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制乳腺癌的進(jìn)展。Wei等[13]發(fā)現(xiàn)，miRNAs與轉(zhuǎn)錄因子（TFs）可以協(xié)同調(diào)控腫瘤發(fā)生。大量研究表明，miRNAs也可能與體內(nèi)免疫系統(tǒng)相互作用調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[14-18]。

此外，某些特異性miRNAs的異常表達(dá)會(huì)影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[19]。例如，miR-20a-5p通過靶向抑制Smad4的表達(dá)，促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲[20]。在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中，miR-21通過靶向Toll樣受體7使巨噬細(xì)胞極化，釋放更多的白細(xì)胞介素6，白細(xì)胞介素6參與了適合轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞定植的肝臟炎癥微環(huán)境的組成[21]。PMEPA1已被證實(shí)通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子-β信號(hào)通路誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 （epithelial-mesenchymal transition，EMT），從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)移的發(fā)生[22]。然而，miR-378可以靶向和調(diào)控PMEPA1，降低其表達(dá)水平，從而抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長和侵襲[23]。在結(jié)直腸癌患者的腫瘤組織中過表達(dá)的miR-454-3p可通過促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲和肝轉(zhuǎn)移，參與結(jié)直腸癌的進(jìn)展[24]。此外，過表達(dá)的miR-298通過靶向磷酸酶和張力蛋白同源物促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[25]。而miR-519c-3p通過靶向BTG3促進(jìn)肝細(xì)胞癌的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[26]，miR-1251-5p通過靶向AKAP12促進(jìn)肝細(xì)胞癌的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[27]。類似的，miR-572可通過靶向CDH1促進(jìn)腎母細(xì)胞瘤的轉(zhuǎn)移[28]。前述研究表明，miRNAs在促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移方面具有重要的作用，是研究腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的重要靶點(diǎn)。

目前已有研究將miRNAs納入結(jié)直腸癌的臨床診治療應(yīng)用中。例如，Wang等[29]的研究報(bào)道由6個(gè)miRNAs （miR-21、 let-7g、 miR-31、 miR-92a、miR-181b和miR-203）組成的一組生物標(biāo)志物可用于結(jié)直腸癌的診斷，其敏感度和特異度均高于CEA和CA19-9。Oshima等[30]的研究報(bào)道m(xù)iR-655-3p和奧沙利鉑可以通過納米級(jí)配位聚合物直接作用于結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移瘤，從而抑制癌細(xì)胞的生長，提示抑制性miRNA與傳統(tǒng)化療結(jié)合治療轉(zhuǎn)移性腫瘤是有可能實(shí)現(xiàn)的。

本研究通過生物信息學(xué)技術(shù)篩選出了13個(gè)與結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)的DEMs，其中miR-122在肝轉(zhuǎn)移灶組織中高表達(dá)，其余DEMs均在結(jié)腸癌原發(fā)灶組織中高表達(dá)。隨后研究進(jìn)一步通過單因素生存分析發(fā)現(xiàn)miR-497與患者的生存預(yù)后相關(guān)，miR-497低表達(dá)者的生存時(shí)間更長，提示miR-497有望成為結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移診療靶點(diǎn)。

miR-497由位于人類染色體17p13.1上的MIR497HG基因的第一個(gè)內(nèi)含子編碼[31]，屬于miR-15/16/195/424/497家族，具有相同的3’-非翻譯區(qū)（UTR）結(jié)合種子序列（AGCAGCA）[32]。尸檢發(fā)現(xiàn)miR-497在多種正常組織中的表達(dá)水平相似，包括大腦皮層、丘腦、心臟、肺、肝、腎、脾、胃和骨骼肌等[33]。然而，miR-497表達(dá)失衡與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，已成為多種癌癥的熱門研究靶點(diǎn)。Hu等[34]的研究表明，miR-497-5p可通過靶向CDCA4抑制肺鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展。Chen等[35]的研究表明，miR-497在肝細(xì)胞癌（HCC）中的潛在靶基因包括ARL2、UBE2Q1、PHF19、APLN、CHEK1、CASK、SUCO、CCNE1和KIF23，miR-497可能分別通過調(diào)控前述靶基因參與HCC的進(jìn)展，可作為HCC的生物標(biāo)志物。Huang等[36]在研究甲狀腺乳頭狀癌時(shí)發(fā)現(xiàn)，DLG1-AS1-miR-497-YAP1軸通過形成ceRNA網(wǎng)絡(luò)促進(jìn)甲狀腺乳頭狀癌的生長和轉(zhuǎn)移。Wei等[37]在探討miR-497在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中的可能作用及機(jī)制時(shí)發(fā)現(xiàn)，miR-497通過FAM114A2調(diào)控細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)皮膚鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展。miR-497在調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移方面的機(jī)制也有報(bào)道。例如，miR-497-5p通過靶向胰島素樣生長因子1抑制肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[38]，miR-497通過抑制SMAD7促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移[39]。而目前尚無miR-497在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的研究報(bào)道，因此，本研究結(jié)果可為miR-497作為未來研究結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的潛在靶點(diǎn)提供思路，有待后續(xù)的研究進(jìn)一步探索及驗(yàn)證miR-497在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移診療方面的作用與價(jià)值。

本研究的優(yōu)勢(shì)在于利用生物信息學(xué)技術(shù)篩選出與結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNAs，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究奠定了一定的基礎(chǔ)。而局限性在于：第一，納入的樣本量較少；第二，數(shù)據(jù)庫的來源較為單一，缺乏實(shí)驗(yàn)的論證。盡管存在以上局限，但是本研究仍然對(duì)研究結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制有一定的指導(dǎo)意義。

綜上所述，本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)及單因素生存分析，對(duì)與結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移相關(guān)的DEMs進(jìn)行了初步的探索，結(jié)果提示miR-497與結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移及患者生存預(yù)后相關(guān)。

利益沖突聲明 全體作者均聲明不存在與本文相關(guān)的利益沖突。