一株南方紅壤區(qū)杉木根際高效解鉀菌的篩選、鑒定及其培養(yǎng)條件優(yōu)化

趙 君，饒惠玲，馮清玉，黃 偉，吳承禎，李 鍵＊

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院,福建 福州 350002；2.武夷學(xué)院生態(tài)與資源工程學(xué)院,福建 南平 354300；3.福建省高校森林生態(tài)系統(tǒng)過程與經(jīng)營重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福建 福州 350002)

氮、磷、鉀三大營養(yǎng)元素在植物的生長發(fā)育過程中起著不可或缺的作用，而鉀元素在提高關(guān)鍵光合酶活性、提高葉綠素含量、維持細(xì)胞電荷平衡[1]等方面的作用尤為突出。我國南方紅壤區(qū)92%～98%的鉀元素以礦物質(zhì)的形式存在[2]，不易被植物吸收利用，進(jìn)而影響植物的生長、產(chǎn)量、品質(zhì)等。目前，優(yōu)化提升土壤鉀素含量多以施用鉀肥為主，但我國鉀肥儲(chǔ)量并不富余，需以進(jìn)口手段滿足需求[3]，且隨著鉀肥頻繁使用，土壤污染加重。因此，如何高效轉(zhuǎn)化土壤中的緩效鉀元素，從而低成本高效的促進(jìn)植物的吸收利用和生長發(fā)育，是近來土壤和植物營養(yǎng)學(xué)界關(guān)注的熱點(diǎn)之一。

土壤微生物組通過自身代謝參與植物養(yǎng)分元素循環(huán)[4]、通過競爭或合作關(guān)系等促進(jìn)根際微環(huán)境穩(wěn)定[5]，對(duì)植物的生長和健康有明顯增益作用。解鉀菌作為土壤微生物的重要組成部分，對(duì)含鉀硅酸鹽礦物具有分解作用，是將土壤中的緩效鉀轉(zhuǎn)化為速效鉀的有效綠色微生物肥料[6]。在探索利用解鉀菌改善農(nóng)作物低鉀脅迫方面，前人已有諸多嘗試[7-9]，但微生物肥料種類繁多并具專一性，不同作物根際篩選出的解鉀菌能力各不相同，只有以土壤環(huán)境、植物種類等為選擇依據(jù)，施用最適解鉀菌才能產(chǎn)生最大效益[10]。

我國南方紅壤區(qū)主要造林樹種杉木（Cunninghamia lanceolata(Lamb.) Hook.）具有經(jīng)濟(jì)、速生、豐產(chǎn)的特點(diǎn)，在提供生產(chǎn)用材、建筑用材、水土保持等方面具有較高的經(jīng)濟(jì)、生態(tài)價(jià)值。杉木多采用實(shí)生苗進(jìn)行造林[11]，在育苗和造林初期往往存在立地困難，諸如幼苗需水量大、固碳能力不完善等[12]，而鉀素在調(diào)節(jié)其細(xì)胞吸水[13]、加速植物木質(zhì)化速率[14]、促進(jìn)根系生長發(fā)育[15]等方面發(fā)揮著不可或缺的作用，能夠顯著提升杉木幼苗抗性和存活率。近年來，微生物組技術(shù)在解決農(nóng)田養(yǎng)分匱乏、提高植物抗性、緩解農(nóng)業(yè)廢棄物污染等方面已有了大量探索和初步成效[16]，這為利用林木生物工程菌種解決鉀素匱乏問題提供了全新的思路，因此，本研究以南方紅壤區(qū)杉木人工林下根際土壤為研究對(duì)象，分離篩選高效解鉀菌并分析其解鉀能力，經(jīng)16S rDNA 鑒定確定其屬，通過單因素實(shí)驗(yàn)與正交試驗(yàn)來優(yōu)化高效解鉀菌的生長條件，以期獲得高效解鉀菌的最佳培養(yǎng)量，為解鉀工程菌的開發(fā)奠定研究基礎(chǔ)，亦為改善南方紅壤區(qū)杉木人工林下根際土壤營養(yǎng)元素環(huán)境提供新的路徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)土壤樣品采集于福建省南平市建陽區(qū)小湖鎮(zhèn)溪東國有林場，26°40′～27°20′ N，118°08′～120°31′ E，位于武夷山脈南側(cè)。為中亞熱帶季風(fēng)氣候，季風(fēng)氣候顯著，春暖秋涼，夏季高溫多雨，冬季溫和少雨。實(shí)驗(yàn)地土壤為花崗巖發(fā)育的暗紅壤，土層厚度在90 cm 以上，海拔高度350 m 左右，坡度范圍20°～35°。相關(guān)研究表明，杉木人工林幼齡到中齡的全鉀含量增加[17]，即幼齡階段杉木低鉀脅迫更為嚴(yán)峻，因此本研究選取南方紅壤區(qū)不同林齡（2，4，10，15 a）杉木人工林下根際土壤作為實(shí)驗(yàn)樣品，以便更為全面的篩選高效解鉀菌株。

1.1.1 土壤樣品采集及理化性質(zhì)測定 采用五點(diǎn)取樣法選取取樣點(diǎn)，采用分層取樣法[18]以及抖落法[19]采集根際土壤，采用四分法去除多余土樣，新鮮根際土樣置于冰箱（4℃）保存以備菌株的篩選，非根際土樣待風(fēng)干后測定土壤理化性質(zhì)。其中，分別采用鉬銻抗比色法、鹽酸-硫酸浸提法測定全磷、有效磷，采用重鉻酸鉀-外加熱法測定有機(jī)質(zhì)，分別采用半微量凱氏法、堿解-擴(kuò)散法測定全氮、水解氮，分別采用堿熔-火焰光度法、乙酸銨浸提-火焰光度法測定全鉀、速效鉀，采用電位法測定pH[20]。

1.1.2 培養(yǎng)基 解鉀菌的初篩采用亞歷山大硅酸鹽初篩培養(yǎng)基[21]：蔗糖5.0 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸氫二鈉2.0 g，碳酸鈣0.1 g，三氯化鐵0.005 g，鉀長石粉1.0 g，瓊脂18.0 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0～7.5。

培養(yǎng)初篩得到的解鉀菌采用種子液培養(yǎng)基[22]：蔗糖10.0 g，硫酸鎂0.5 g，碳酸鈣1.0 g，硫酸銨1.0 g，氯化鈉0.l g，酵母膏0.5 g，磷酸氫二鉀2.0 g，pH 7.2～7.4，去離子水1 000 mL。

解鉀菌的復(fù)篩采用搖瓶復(fù)篩培養(yǎng)基[23]：蔗糖10.0 g，硫酸鎂0.5 g，碳酸鈣1.0 g，硫酸銨1.0 g，氯化鈉 0.l g，酵母膏0.5 g，磷酸氫二鈉2.0 g，鉀長石粉10.0 g，pH 7.2～7.4，去離子水1 000 mL。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基采用LB 培養(yǎng)基[24]：胰蛋白胨10.0 g，酵母浸出粉5.0 g，葡萄糖0.5 g，氯化鈉 0.5 g，pH 7.0～7.2。

1.2 解鉀菌的篩選、鑒定及培養(yǎng)條件優(yōu)化

1.2.1 解鉀菌分離與純化 菌株分離：配置一定濃度（10-3、10-4、10-5）的土壤懸液，將其涂于亞歷山大硅酸鹽培養(yǎng)基平板中央，將涂布后的平板倒置并轉(zhuǎn)移至恒溫培養(yǎng)箱（30℃，4 d）培養(yǎng)。每個(gè)梯度設(shè)3 個(gè)重復(fù)并編號(hào)，培養(yǎng)過程中觀察菌落形態(tài)，以菌落形態(tài)呈圓形、透明、凸起較高、表面濕潤粘稠且富有彈性為篩選指標(biāo)挑取菌落。

菌株純化：采用劃線法純化分離篩選后的解鉀菌并于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～7 d，反復(fù)純化2～3 次，于電子顯微鏡下觀察菌落形態(tài)。將純化后的解鉀菌轉(zhuǎn)移至LB 培養(yǎng)基，保存于冰箱（4℃）備用[25]。

1.2.2 解鉀菌篩選 將上述挑選好的解鉀菌進(jìn)行搖瓶液體培養(yǎng)釋鉀實(shí)驗(yàn)以測定其解鉀能力。各取10 mL 解鉀菌培養(yǎng)液經(jīng)離心處理（4℃，6 000 r·min-1，10 min）后取上清液，加入5 mL 濃硫酸與2 mL 30%過氧化氫溶液消煮，并反復(fù)加30%過氧化氫溶液數(shù)次至粘性物質(zhì)完全消化后，定容至50 mL后用火焰原子吸收分光光度法測定菌株培養(yǎng)液中可溶性鉀的含量[26]。

R為解鉀率（%），K為接種發(fā)酵液中的鉀含量（μg·mL-1），CK為未接種解鉀菌培養(yǎng)液的鉀含量（μg·mL-1）。

1.2.3 菌株16S rDNA 鑒定 利用天根細(xì)菌基因組提取試劑盒（DP302-02）提取菌株的總DNA 并進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將產(chǎn)物經(jīng)2% 瓊脂糖凝膠電泳，割取目的條帶，按照天根回收試劑盒（DP214-03）純化回收，送往上海邁浦生物科技有限公司進(jìn)行測序。將測序結(jié)果提交至RDP 及NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列比對(duì)分析，選取與Genbank 中同源性最高的序列，確定菌株類型。

1.2.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化 培養(yǎng)基組分優(yōu)化：將基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源分別用葡萄糖、蔗糖、乳糖、可溶性淀粉、麥芽糖、甘露醇代替，依據(jù)菌液OD600確定最佳碳源。選用最佳碳源設(shè)置濃度梯度（0.5%、1.0%、1.5%）并根據(jù)菌液OD600值確定最適濃度。利用硫酸銨、氯化銨、硝酸鉀、蛋白胨、酵母粉、尿素替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源以確定最佳氮源，改變最佳氮源濃度（0.5%、0.8%、1.0%、1.3%、1.5%）確定其最適濃度。

培養(yǎng)條件優(yōu)化：基礎(chǔ)培養(yǎng)基組分保持不變，分別對(duì)菌株發(fā)酵液培養(yǎng)條件進(jìn)行梯度設(shè)置（pH 為5.0、6.0、6.5、7.0、7.2、7.5、8.0、9.0；裝液量為10、20、30、40、60 mL；接種量為1%、3%、5%、7%、9%；培養(yǎng)溫度為20℃、25℃、28℃、30℃、35℃、40℃），記錄各組處理菌液OD600值，確定最適培養(yǎng)條件。

正交試驗(yàn)：根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)L9（34）四因素（A：初始pH；B：裝液量；C：接種量；D：培養(yǎng)溫度）三水平正交試驗(yàn)，每組處理設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與方法

采用Exce1 2010 進(jìn)行原始數(shù)據(jù)的整理與分析，運(yùn)用SPSS 19.0 進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA）比較不同菌株解鉀量的差異進(jìn)行方差分析，正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用正交設(shè)計(jì)助手ⅡV3.1。采用Pearson 相關(guān)系數(shù)法確定pH 與溶磷量之間相關(guān)關(guān)系，采用最小顯著差異法（LSD 法）進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和多重比較，顯著性水平0.05。

2 結(jié)果與分析

根據(jù)1.1.1，得出研究區(qū)土壤基本理化性質(zhì)（表1）。

表1 杉木人工林土壤基本理化性質(zhì)Table 1 Basic physiochemical properties of Chinese fir plantation soil

2.1 解鉀菌的分離與形態(tài)學(xué)特征

從不同林齡杉木人工林下根際土壤中共分離出79 株解鉀菌，根據(jù)分離純化過程中菌株的形狀、顏色、大小、生長速度快慢等特征[11]，挑選出20 株優(yōu)勢(shì)菌株（編號(hào)JK1-JK20）用于搖瓶液體培養(yǎng)，測定其解可溶性鉀含量并計(jì)算解鉀率以篩選高效解鉀菌。本次實(shí)驗(yàn)篩選出的解鉀菌都為細(xì)菌，絕大多數(shù)菌株的菌落形態(tài)呈現(xiàn)圓形、透明、凸起、邊緣整齊、表面濕潤粘稠且富有彈性，亦存在顏色為淡紅色、乳白色半透明的情況；菌體形態(tài)多為長桿狀，兩端鈍圓，常成對(duì)狀、鏈狀排列；絕大多數(shù)菌株具備芽孢，芽孢呈橢圓或卵圓狀，并有肥厚莢膜存在。

2.2 解鉀菌的解鉀能力測定與篩選

測定不同菌株發(fā)酵液的可溶性鉀含量（圖1），不同菌株解鉀量存在差異。各菌株發(fā)酵液的可溶性鉀含量范圍為38.29～81.06 μg·mL-1。整體來看，20 株菌株中共有13 株解鉀量顯著高于CK，占比65%，可溶性鉀含量較CK 增加量的范圍為1.66～30.55 μg·mL-1，分解鉀長石礦能力明顯。JK13 解鉀量 為81.06 μg·mL-1，為CK 的1.6 倍，顯著高于其他菌株（P＜ 0.05），其次為JK2、JK16。以上13 株菌株中，解鉀率高于20%的菌株共計(jì)7 株，占比53.85%，解鉀率低于10%的菌株共計(jì)3 株，占比23.08%（圖2）。

圖1 不同解鉀菌解鉀量Fig.1 The amount of potassium in different solutions

不同菌株解鉀率（圖2）存在顯著差異（P＜0.05），大部分菌株解鉀率為正。綜合解鉀率與解鉀量二者來看，JK13 解鉀率最高，為60.49%，其次JK2 和JK16 的解鉀率為46.37%、39.33%。此外，菌株JK1、JK3、JK6、JK8、JK10、JK18、JK19 這7 株菌的培養(yǎng)液可溶性鉀含量低于CK，說明這7 株菌株不具備解鉀能力，原因可能是這些菌株本身在成長繁殖過程中需要吸收一定量的鉀素[27]。另外，前期處理過程中的H2O2灰化處理并不能使菌株體內(nèi)的鉀完全釋放，也可能在轉(zhuǎn)移過程中有部分速效鉀被破壞導(dǎo)致流失。

圖2 不同解鉀菌解鉀率Fig.2 The potassium solvability of different potassium-solubilizing bacteria

對(duì)上述20 株菌株發(fā)酵液進(jìn)行pH 測定，發(fā)現(xiàn)各菌株pH 值顯著低于CK（P＜ 0.05），解鉀菌在代謝過程中會(huì)產(chǎn)生酸性物質(zhì)，進(jìn)而提高對(duì)鉀長石礦中不可溶鉀向可溶性鉀轉(zhuǎn)化的效率，提高溶液鉀離子含量[28]。其中，JK15 的pH 值最低，為4.12，其解鉀率為22.93%，具有較好的解鉀能力，其次JK20 的pH 值為4.20，但其解鉀率為12.54%。對(duì)13 株有效解鉀菌的解鉀量與發(fā)酵液pH 值進(jìn)行相關(guān)性分析（圖3），得出二者之間不存在相關(guān)關(guān)系（R2=0.852，P＞ 0.05）。由此可見，雖然解鉀菌株在解鉀過程中都能分泌酸性物質(zhì)，但是菌株解鉀能力的強(qiáng)弱與發(fā)酵液pH 值大小并無直接相關(guān)關(guān)系。

圖3 溶解量與培養(yǎng)液pH 的關(guān)系Fig.3 Relationship between pH and potassium-solubilizing ability

2.3 菌株鑒定結(jié)果

經(jīng)鑒定，菌株JK13 屬芽孢桿菌屬（Bacillus altitudinis），且進(jìn)行比對(duì)的序列片段與高地芽孢桿菌（Bacillus altitudinis）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）相似性達(dá)到100%，與嗜氣芽孢桿菌（Bacillus aerophilus）、同溫層芽孢桿菌（Bacillus stratosphericus）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）及空氣芽孢桿菌（Bacillus aerius）4 個(gè)種的相似性達(dá)到99%（圖4）。

圖4 菌株JK13 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain JK13

2.4 解鉀菌培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.4.1 單因素篩選 不同培養(yǎng)條件下菌株JK13 生長量差異顯著（P＜ 0.05）（圖5）。碳源是微生物生長發(fā)育、新陳代謝的主要能量來源[29-30]，JK13 對(duì)葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、甘露醇均能吸收利用，但以0.5% 濃度的甘露醇為碳源時(shí)OD600值顯著高于其他碳源，菌株生長量最大（圖5a、b），生長情況最好；經(jīng)單因素方差分析和LSD 多重比較表明，0.5% 濃度的甘露醇與1.5%濃度之間存在顯著差異。氮源在微生物生長過程中也發(fā)揮著重要的作用[31]，經(jīng)單因素方差分析和LSD 多重比較表明，以酵母粉為氮源時(shí)JK13 菌液濃度顯著高于其余5 種氮源（P＜ 0.05）。對(duì)菌株JK13 而言，氯化銨、硝酸鉀、尿素3 個(gè)處理之間無顯著差異(P＞ 0.05)；而氯化銨處理同硫酸銨、硝酸鉀、尿素3 個(gè)處理間呈顯著差異，后三者之間則無顯著差異（圖5c）。菌株JK13 對(duì)1.0%濃度的酵母粉吸收利用效率更高，生長情況最好，而0.75%、1.0%、1.25%這3 種濃度處理之間差異不顯著（圖5d）。

初始pH 對(duì)菌株生長量影響差異性顯著（P＜0.05）（圖5e），菌株JK13 的最適pH 值為9.0，菌液OD600值隨pH 的增加呈上升趨勢(shì)；經(jīng)單因素方差分析和LSD 多重比較，pH 為9.0 的處理同其余處理呈顯著差異。不同菌株對(duì)氧氣的需求量存在差異，搖瓶環(huán)境中氧氣含量的多少是影響菌株生長速率的重要因素之一[32]。菌株JK13 生長量在30～40 mL 間無顯著差異；30 mL 裝液量與10 mL、60 mL 處理間的差異達(dá)到顯著水平（P＜ 0.05）（圖5f）。經(jīng)單因素方差分析和LSD 多重比較表明，JK13 的不同接種處理間差異并不顯著（圖5g）。JK13 的最適溫度范圍為28～35 ℃，但在35 ℃處理下的菌液OD600值顯著高于其他溫度處理（P＜ 0.05）（圖5h）。

圖5 不同培養(yǎng)條件對(duì)菌株生長量的影響Fig.5 The influence of different culture conditions on the growth of strains

2.4.2 正交試驗(yàn) 基于上述單因素實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)4 因素（初始pH、裝液量、接種量、培養(yǎng)溫度）3 水平正交試驗(yàn)（表2）。其中因素A 為初始pH 值（7.5、8.0、9.0），因素B 為裝液量（20 mL、30 mL、40 mL），因素C 為接種量（1%、3%、5%），因素D 為培養(yǎng)溫度（25℃、30℃、35℃）。極差分析結(jié)果為RA＞RD＞RB＞RC，表明對(duì)菌株JK13 的菌體生長程度影響最大的因素為初始pH 值，其次為培養(yǎng)溫度、裝液量、接種量。菌株JK13 的最佳培養(yǎng)條件優(yōu)化方案為A3B2C1D3，即初始pH 值為9.0，裝液量為30 mL·100 mL-1，接種量為1%，培養(yǎng)溫度為35℃。菌株JK13 在最佳優(yōu)化方案下的菌液OD600值為1.059，其在未優(yōu)化的普通培養(yǎng)條件下為0.672，增長幅度為57.56%。

表2 菌株JK13 培養(yǎng)條件的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The results of orthogonal test on culture condition for strain JK13

3 討論

現(xiàn)有研究表明，植物自身一般通過產(chǎn)生大量的ABA、水分再分配[33]、動(dòng)態(tài)改變根系內(nèi)部基因[34]等應(yīng)對(duì)不同的逆境脅迫，植物共生微生物則基于以上自我修復(fù)起到輔助和協(xié)同作用[35]，而微生物肥料的開發(fā)利用可以大大加速植物的逆境修復(fù)速度，為植物保持正常生理化學(xué)過程提供動(dòng)力，發(fā)揮外在推動(dòng)器的作用。

一般認(rèn)為，生物的豐富的遺傳多樣性會(huì)為種間及種內(nèi)個(gè)體間帶來遺傳分化與遺傳差異，進(jìn)而表現(xiàn)為生物培養(yǎng)特征的多樣性。本實(shí)驗(yàn)從南方紅壤區(qū)不同林齡杉木人工林下根際土壤篩選出的解鉀菌菌落顏色具有多樣性，呈現(xiàn)乳白色半透明、淡黃色，這與吳凡等[36]在桑樹根際篩選出具有乳白色、淡黃色等顏色特征的解鉀菌以及燕紅等[37]在農(nóng)田中篩選出呈乳白色的K-6-4 和呈淡黃色的K-1-1 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。但僅將菌落顏色作為解鉀菌篩選的判斷標(biāo)準(zhǔn)并不嚴(yán)謹(jǐn)，據(jù)此并不能十分準(zhǔn)確分離得到具備解鉀能力的菌株，如狄義寧[38]在甘蔗根部篩選出菌落顏色為黃白色的解鉀菌，姜霽航等[39]在蘋果根際篩選出的解鉀菌呈灰色、不透明。換而言之，種類各異的高效解鉀菌菌落顏色也各不相同，因此，利用菌落顏色特征篩選解鉀菌還需借助測定速效鉀含量來做進(jìn)一步判斷。

土壤空間異質(zhì)性為微生物多樣性提供了生境基礎(chǔ)，二者存在顯著正相關(guān)關(guān)系[40]。在不同類型土壤中生存的解鉀菌無論是在數(shù)量還在種類上均存在差異[41]，不同菌株的溶鉀效果也存在差異。本實(shí)驗(yàn)在20 株解鉀菌中篩選出13 株具解鉀能力的菌株，最高效解鉀菌JK13 發(fā)酵液可溶性鉀含量為81.06 μg·mL-1。呂睿等[8]在獼猴桃園農(nóng)田中篩選出高效解鉀菌株JK3 的解鉀量3.7 μg·mL-1，較空白對(duì)照組增加94.74%，解鉀量顯著低于本實(shí)驗(yàn)篩選出的JK13。閆雅楠等[9]在入侵植物加拿大一枝黃花(Solidago canadensisL.) 根際分離出的15 株菌株中，9 株具有解鉀能力，最優(yōu)解鉀菌株H2-20 的解鉀量為10.657 μg·mL-1，顯著低于JK13。陳易等[10]在紫色土樣中篩選出的XD-K-2 菌株發(fā)酵液可溶性鉀含量為23.2 μg·mL-1。對(duì)比上述研究，本實(shí)驗(yàn)篩選出的解鉀菌（81.06 μg·mL-1）具有顯著解鉀優(yōu)勢(shì)。此外，本實(shí)驗(yàn)所篩選出的不具備解鉀能力的菌株占35%，而李海龍等[42]實(shí)驗(yàn)中不具解鉀能力的菌株占70%，相關(guān)研究表明，微生物的解鉀能力受土壤類型、鉀礦類型及含量、土壤pH、土壤溫度、環(huán)境中鉀離子濃度、鉀礦粉粒徑大小等諸多因素的影響[43]，因此，進(jìn)一步分析以不同植物為研究對(duì)象篩選出的解鉀菌的解鉀能力差異的原因，對(duì)于今后工程菌的普適性具有重要的參考價(jià)值。

經(jīng)16S rDNA 鑒定（見附圖），JK13 為芽孢桿菌屬（Bacillus altitudinis），而李海龍等[42]在秦嶺山區(qū)篩選出的QL21、胡洲等[44]在不同作物根際篩選出的K1 和K3、任建國等[45]在太子參根際篩選出的ATS-2-5和KTS-2-4均亦屬芽孢桿菌屬，陳易等[10]在紫色土中篩選出的XD-K-2 為環(huán)狀芽孢桿菌屬（Bacillus circulanssp.），李新新等[46]篩選出的G4 為類芽孢桿菌屬（Paenibacillussp.），上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明芽孢桿菌屬微生物在硅酸鹽細(xì)菌中占據(jù)較大比例，同時(shí)其促生、增產(chǎn)作用效果具有顯著優(yōu)勢(shì)[44]。但隨著研究的深入與展開，解鉀菌大多局限于芽孢桿菌屬這一結(jié)論[47]被逐漸推翻，如張妙宜等[48]在蓖麻根際篩選出的MY-1 為嗜線蟲賽雷氏菌（Serratia nematodiphila），陳豐宇等[49]在香蕉根際篩選出的1 株具解鉀作用的放線菌為陜西鏈霉菌（Streptomyces shaanxiensis）。

現(xiàn)有研究認(rèn)為解鉀機(jī)制與產(chǎn)生有機(jī)酸、產(chǎn)胞外多糖、生物膜形成[50]以及低分子能量酸性物質(zhì)產(chǎn)生[51]有關(guān)，但本實(shí)驗(yàn)中各菌株培養(yǎng)液pH 值同可溶性鉀含量無顯著性相關(guān)關(guān)系，這與黨雯[52]得出的解鉀能力強(qiáng)弱與pH 相關(guān)性不顯著的結(jié)論一致，據(jù)此推測產(chǎn)酸并不是硅酸鹽細(xì)菌發(fā)揮解鉀效用的主要因素，菌株可能是以破壞鉀礦石晶體構(gòu)造、表面接觸發(fā)生交換作用等方式溶解無效鉀。谷付旗等[53]對(duì)菌株WS-FJ9 的研究則表明解鉀能力由多因素決定，解鉀菌通過分泌有機(jī)酸、氨基酸來溶解緩效鉀或利用氨基酸、有機(jī)酸、胞外的莢膜多糖三者絡(luò)合作用促使鉀源分解?；谝陨戏治觯緦?shí)驗(yàn)篩選出的高效解鉀菌JK13 的具體解鉀機(jī)制還有待結(jié)合苗期實(shí)驗(yàn)和分子手段進(jìn)一步研究與驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)基于亞歷山大培養(yǎng)基篩選得到的高效解鉀菌JK13 具有較強(qiáng)的的解鉀能力，經(jīng)16S rDNA鑒定為芽孢桿菌屬。采用單因素實(shí)驗(yàn)與正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化其培養(yǎng)基組分及培養(yǎng)條件，即0.5% 甘露醇、1.5% 酵母粉，初始pH 值為9，裝液量為30 mL·100 mL-1，接種量為1%，培養(yǎng)溫度為35℃。菌株的篩選和培養(yǎng)條件優(yōu)化豐富了解鉀微生物資源庫，亦為林木附生功能菌的開發(fā)和利用提供了研究基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持。

附錄

圖 附圖 JK13 菌株16S rDNA