水曲柳CUC1 基因克隆及瞬時(shí)表達(dá)分析

崔靖弘，于 磊，梁楠松，宋婷婷，呂義品，紀(jì)欣童，徐 亮，趙福江，詹亞光＊

(1.東北林業(yè)大學(xué)東北鹽堿植被恢復(fù)與重建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省頭雁創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)計(jì)劃（林木遺傳育種創(chuàng)新研究團(tuán)隊(duì)），黑龍江 哈爾濱 150040；3.吉林省臨江林業(yè)局，吉林 臨江 134600)

CUCs（CUP-SHAPED COTYLEDONs）基 因在調(diào)控植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)中發(fā)揮著核心作用，如參與植物頂端分生組織建成[1]；與生長(zhǎng)素、miRNA 等相互調(diào)控影響葉邊緣形態(tài)[2]；通過調(diào)控下游LAS（LATERALSUPRESSOR）基因促進(jìn)腋生分生組織起始，進(jìn)而影響側(cè)枝發(fā)育[3]；在擬南芥根外植體培養(yǎng)中，CUC1和CUC2基因表達(dá)量可與根形成不定芽的能力成正相關(guān)，可見，CUC基因可作為一個(gè)預(yù)測(cè)性標(biāo)志基因，篩選根形成芽的最佳組培條件[4]。CUC1屬于植物特有的NAC 家族NAM 超家族成員[5]，具有NAC 家族典型的N 端高度保守NAC-domain 和C 端高度多變序列，NACdomain 是一個(gè)包含約150 至160 個(gè)氨基酸[6]，分為5 個(gè)亞結(jié)構(gòu)域（A-E），其中，A、C、D 保守性高，B、E 保守性低，且D、E 是DNA 結(jié)合所必需的亞結(jié)構(gòu)域[7]。CUC1基因在愈傷組織再生出芽中發(fā)揮著重要作用，Daimon 等[8]在愈傷組織中過表達(dá)CUC1基因，可促使芽的再生率從30%提高到80%。進(jìn)一步研究表明，通過對(duì)CUC亞家族和ATAF1亞家族NAC-domain 互換實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，ATAF1的NAC-domain 不能誘導(dǎo)愈傷組織再生出芽，這是由于其自身特異的NAC-domain 所決定的[9]。Aida等[10]研究中發(fā)現(xiàn)，CUC1和CUC2基因雙突變體植株可呈現(xiàn)雄蕊、萼片和子葉愈合，很難產(chǎn)生SAM（頂端分生組織）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，CUC1和CUC2可通過調(diào)控STM（SHOOT MERISTEMLESS對(duì)于分生組織起始和維持SAM 中心區(qū)的未分化細(xì)胞是必需的）的表達(dá)來決定分生組織中心的建立[11]。如STM首先在CUC基因表達(dá)原基的細(xì)胞環(huán)中表達(dá)，當(dāng)SAM 形成時(shí)，STM將CUC基因的表達(dá)限制在SAM 的外周區(qū)，進(jìn)而形成反饋調(diào)節(jié)環(huán)[12]。此外，CUC1基因的表達(dá)受到其他轉(zhuǎn)錄因子和表觀遺傳修飾調(diào)控，如PLT3（PLETHORA3）、PLT5、PLT7可以促進(jìn)CUC1的表達(dá)[13]，ESR1（ENHANCER OF SHOOT REGENERATION1）也可以促進(jìn)CUC1的表達(dá)[14]；在離體器官再生過程中，CUC1基因表達(dá)與其啟動(dòng)子區(qū)和3′端的DNA 甲基化修飾水平呈明顯負(fù)相關(guān)性[15]，且CUC1的表達(dá)也受到了H3K4 乙?；秸{(diào)控[16]。目前，CUC1基因的研究大多集中于擬南芥等模式植物，而在木本植物中鮮有研究。

水曲柳（Fraxinus mandshuricaRupr.）系木犀科（Oleaceae）白蠟樹屬，是東北地區(qū)重要的珍貴用材樹種，由于地域特征水曲柳能夠耐寒、耐旱、耐鹽堿，且木材優(yōu)良，用途廣泛，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[17-19]。其作為黑龍江省主要的造林樹種，再生困難造成遺傳轉(zhuǎn)化效率低的現(xiàn)象一直困擾著育種工作者，而瞬時(shí)轉(zhuǎn)化是一種快速有效的遺傳轉(zhuǎn)化方法，對(duì)研究植物基因功能具有重要意義，如鄒全程等[20]利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)剛毛柳（Tamarix hispida）ThCBL4基因瞬時(shí)過表達(dá)可提高轉(zhuǎn)基因植株耐鹽性；Wu 等[21]證實(shí)，在桑葉中瞬時(shí)過表達(dá)MaFT基因可能促使桑樹（Morus albaL.）早熟開花等。因此，為了提高水曲柳遺傳轉(zhuǎn)化效率，解決再生難等問題，可見從分子水平研究再生相關(guān)的基因是必要的。本研究從水曲柳中克隆獲得了FmCUC1基因，對(duì)其分子特征、組織特異性、亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析，測(cè)定其在不同激素信號(hào)下的基因表達(dá)情況，同時(shí)構(gòu)建了FmCUC1基因表達(dá)載體（pNC-Cam1304-SubC-FmCUC1），利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)水曲柳FmCUC1基因瞬時(shí)過表達(dá)72 h 后，分析比較其通路相關(guān)基因表達(dá)情況以初步鑒定FmCUC1基因功能。該研究將有助于為水曲柳轉(zhuǎn)基因工作提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用材料均為水曲柳種子種植。將水曲柳種子接種于WPM 固體培養(yǎng)基中（pH5.8～6.0），培養(yǎng)于人工氣候室（濕度為60%～80%，溫度為22 ±2℃，光照15 h）。以生長(zhǎng)30 d，長(zhǎng)勢(shì)均一的實(shí)生幼苗為實(shí)驗(yàn)材料。根、莖、葉取自30 d 組培苗，頂芽取自3 年生盆栽苗。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因克隆 根據(jù)水曲柳CUC1基因的編碼區(qū)（CDS）設(shè)計(jì)引物（表1），以生長(zhǎng)30 d 的水曲柳組培苗cDNA 為模板進(jìn)行FmCUC1基因的PCR 擴(kuò)增（反應(yīng)體系：上下游引物各1.0 μL，cDNA 模板1.0 μL，2 × Es MasterMix 10 μL，ddH2O 7.0 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性3 min；94℃變性35 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸2 min，4℃保存）。將目的片段回收純化，連接至pEASY-T5-Zero 載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，將陽(yáng)性克隆送至擎科生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.2FmCUC1基因生物信息學(xué)分析 根據(jù)FmCUC1基因序列分析其理化性質(zhì)、親疏水性、保守結(jié)構(gòu)域及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，具體操作步驟參考郭依萍等[22]。

1.2.3FmCUC1基因表達(dá)載體構(gòu)建及亞細(xì)胞定位

根據(jù)FmCUC1基因CDS 序列設(shè)計(jì)引物（表1），以陽(yáng)性克隆質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后使用Nimble Cloning MIX 試劑將其連接至pNC-Green-SubC 表達(dá)載體中，構(gòu)建植物表達(dá)載體pNC-Green-SubC-FmCUC1，將陽(yáng)性菌液送至擎科生物科技有限公司測(cè)序。將檢測(cè)正確的pNC-Green-SubC-FmCUC1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別將pNC-Green-SubC-FmCUC1和空載pNC-Green-SubC 轉(zhuǎn)入到洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞中，使用熒光共聚焦顯微鏡觀察并照相。

表1 引物序列及用途Table 1 Primer sequence and Application

1.2.4FmCUC1基因組特異性表達(dá) 分別以水曲柳根、莖、葉、頂芽組織為cDNA 模板，以水曲柳微管蛋白FmTU[23]為內(nèi)參基因?qū)mCUC1基因表達(dá)進(jìn)行熒光定量PCR。

1.2.5FmCUC1基因在下胚軸芽再生與種子萌發(fā)過程中的差異表達(dá) 以水曲柳下胚軸和種子為實(shí)驗(yàn)材料，分別在培養(yǎng)6、12、18、24、30、36 d 與接種0、3、4、5、7、8、10、14、18、21 d 進(jìn)行取樣，待取樣完畢后，使用Tris-CTAB 法提取RNA，反轉(zhuǎn)錄，對(duì)水曲柳下胚軸芽再生與種子萌發(fā)過程中FmCUC1基因表達(dá)進(jìn)行熒光定量PCR。

1.2.6FmCUC1基因在激素信號(hào)下的差異表達(dá) 分別對(duì)長(zhǎng)勢(shì)均一的組培苗噴施6-BA（100 μmol·L-1）、BR（1 μmol·L-1）、IAA（100 μmol·L-1）激素處理，每個(gè)處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)，每重復(fù)5 株水曲柳苗，于0 h、10 min、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h進(jìn)行整株取樣。對(duì)8 個(gè)取樣點(diǎn)FmCUC1表達(dá)進(jìn)行熒光定量PCR。

1.2.7FmCUC1基因表達(dá)載體構(gòu)建、瞬時(shí)侵染水曲柳及相關(guān)基因表達(dá) 以陽(yáng)性克隆質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化后使用Nimble Cloning MIX 試劑[24]將其連接至pNC-Cam1304-SubC 表達(dá)載體中，構(gòu)建植物表達(dá)載體pNCCam1304-SubC-FmCUC1，將陽(yáng)性菌液送至擎科生物科技有限公司測(cè)序。將檢測(cè)正確的pNC-Cam1304-SubC-FmCUC1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101 感受態(tài)細(xì)胞，保存菌種備用。

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法，方法參照楊少彤等[25]；將pNC-Cam1304-SubC-FmCUC1-GV3101和轉(zhuǎn)化液（對(duì)照）分別對(duì)生長(zhǎng)30 d 的整株水曲柳組培苗進(jìn)行瞬時(shí)侵染。為了檢驗(yàn)FmCUC1基因及其通路 的ESR1（ENHANCER OF SHOOT REGENERATION1）、PLT3（PLETHORA3 ）、PLT5（PLETHORA5）、B型ARR12（ARABIDOPSIS RESPONSE REGULATOR12）、STM（SHOOT MERISTEMLESS）基因表達(dá)情況，提取72 h 的FmCUC1瞬時(shí)過表達(dá)植株的總RNA，進(jìn)行熒光定量PCR。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理與分析 每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少3 次生物學(xué)重復(fù)；基因相對(duì)表達(dá)量使用7 500 Software v 2.0.6 軟件獲取，按照基因相對(duì)定量法（2-ΔΔCt）對(duì)基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算；利用SPSS version 22.0軟件采用Duncan’s 多重比較法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 FmCUC1 基因克隆及基因結(jié)構(gòu)分析

由圖1A 可知：PCR 擴(kuò)增獲得1 條約800 bp的目的基因條帶，經(jīng)測(cè)序，證實(shí)得到目的基因即為FmCUC1基因（登錄號(hào)：MH060997.1），其CDS 序列為807 bp，編碼269 個(gè)氨基酸（圖1B）。

圖1 FmCUC1 基因克隆Fig.1 Cloning of FmCUC1 gene

使用ProtParam 預(yù)測(cè)FmCUC1 蛋白脂肪系數(shù)為32.71，不穩(wěn)定系數(shù)值為35.02，屬于穩(wěn)定蛋白。進(jìn)一步使用TMHMM 對(duì)FmCUC1 蛋白的親/疏水性分析可知：該蛋白的最大親水性為-0.663、最大疏水性為2.189，有 43 個(gè)氨基酸親水?dāng)?shù)峰在0 以下，有438 個(gè)氨基酸疏水?dāng)?shù)峰在0 以上，親水性氨基酸數(shù)目明顯少于疏水性氨基酸，為疏水蛋白。通過CD-Search 對(duì)FmCUC1 蛋白保守結(jié)構(gòu)域和功能域預(yù)測(cè)可知：FmCUC1 蛋白近N 端的第49-423 位氨基酸為典型的NAC-domain 結(jié)構(gòu)域。

2.2 FmCUC1 編碼蛋白的同源性分析

使用NCBI 中的Blastp 對(duì)FmCUC1氨基酸進(jìn)行同源序列比對(duì)表明：水曲柳CUC1（NAC92）氨基酸序列與同科的木犀欖CUC1（NAC92）氨基酸序列相似度較高，為86.17%；同時(shí)對(duì)水曲柳、木犀欖、擬南芥、水稻等16 個(gè)物種的CUC1 蛋白氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），結(jié)果顯示進(jìn)化樹聚為2 類，其中，水曲柳與木犀欖位于同一進(jìn)化分支上，說明目前水曲柳CUC1與木犀欖CUC1 親緣關(guān)系較近。

圖2 FmCUC1 與其他物種的CUC1 蛋白進(jìn)化分析Fig.2 Evolutionary analysis of FmCUC1 and CUC1 proteins in other species

2.3 FmCUC1 基因表達(dá)載體構(gòu)建、亞細(xì)胞定位

以SFmCUC1-F 和SFmCUC1-R 為引物，測(cè)序正確的FmCUC1基因陽(yáng)性克隆質(zhì)粒為模板，成功構(gòu)建植物表達(dá)載體pNC-Green-SubC-FmCUC1（圖3）。

圖3 pNC-Green-SubC-FmCUC1 表達(dá)載體結(jié)構(gòu)圖Fig.3 Structure of pNC-Green-SubC-FmCUC1 expression vector

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法分別將pNC-Green-SubCFmCUC1-GV3101 和空載pNC-Green-SubC-GV3101轉(zhuǎn)入到洋蔥內(nèi)表皮細(xì)胞中，使用熒光共聚焦顯微鏡觀察侵染后得到的洋蔥內(nèi)表達(dá)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4）表明：對(duì)照組在細(xì)胞核與細(xì)胞膜中均發(fā)現(xiàn)綠色熒光，F(xiàn)mCUC1-EGFP 融合蛋白只在細(xì)胞核中有明顯的綠色熒光，且與DAPI 核染色位置一致，表明FmCUC1基因定位于細(xì)胞核中。

圖4 FmCUC1 蛋白亞細(xì)胞定位Fig.4 Subcellular localization of FmCUC1 protein

2.4 FmCUC1 基因組織特異性表達(dá)分析

采用熒光定量PCR 技術(shù)對(duì)水曲柳FmCUC1基因在根、莖、葉、頂芽中的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明：該基因在根、莖、葉、頂芽中均有表達(dá)，以根表達(dá)量作為參考，莖表達(dá)量低于根組織，為根表達(dá)量的75%，葉片的表達(dá)量高于根，為根表達(dá)量的3.27 倍，頂芽的表達(dá)量最高，為根表達(dá)量的6.43 倍（圖5）。以上結(jié)果表明，F(xiàn)mCUC1基因在水曲柳頂芽中表達(dá)量最高。

圖5 FmCUC1 基因在根、莖、葉、頂芽中的表達(dá)差異Fig.5 Expression difference of FmCUC1 gene in roots,stems,leaf and apical bud

2.5 FmCUC1 基因在下胚軸芽再生與種子萌發(fā)過程中的差異表達(dá)分析

在水曲柳下胚軸芽再生過程中發(fā)現(xiàn)：FmCUC1基因在6～36 d 均有表達(dá)，以第6 天表達(dá)量作為參考，培養(yǎng)6 d 時(shí)可發(fā)現(xiàn)下胚軸端部開始膨大（圖6C），生長(zhǎng)12 d 時(shí)可以發(fā)現(xiàn)有芽點(diǎn)產(chǎn)生（圖6D），此時(shí)FmCUC1基因表達(dá)量為對(duì)照的1.98 倍（圖6A）；進(jìn)一步觀察可發(fā)現(xiàn)12～36 d 為叢枝形成期，待生長(zhǎng)至36 d 時(shí)FmCUC1基因表達(dá)量達(dá)到峰值，為對(duì)照的11.33 倍（圖6A）。以上結(jié)果表明：FmCUC1基因參與水曲柳下胚軸芽再生過程，并促進(jìn)不定芽的分化。同樣，在種子萌發(fā)過程中，通過定量分析得出：FmCUC1基因在第4 天和第8 天分別達(dá)到2 個(gè)峰值，分別為0 d 的8.56 倍和8.46 倍（圖6B）。結(jié)果表明，這2 個(gè)峰值與水曲柳種子芽的發(fā)生階段及伸長(zhǎng)階段相互對(duì)應(yīng)。上述結(jié)果均可推測(cè)，F(xiàn)mCUC1基因在水曲柳芽再生過程具有重要作用。

圖6 FmCUC1 基因在下胚軸芽再生與種子萌發(fā)過程中的表達(dá)分析Fig.6 Expression analysis of FmCUC1 gene during hypocotyl bud regeneration and seed germination

2.6 FmCUC1 基因在激素信號(hào)下的表達(dá)模式

水曲柳在激素信號(hào)處理下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)生了明顯的表達(dá)變化（圖7），其中，在IAA 與BR 處理后，F(xiàn)mCUC1呈現(xiàn)升-降-升的表達(dá)模式；在處理1 h 與10 min 時(shí)顯著上調(diào)，分別為對(duì)照的27.65 倍和11.38 倍，隨后表達(dá)量逐漸下降；處理72 h 后表達(dá)量均達(dá)到峰值，分別為對(duì)照的45.72 倍和20.36 倍。在6-BA 處理后，F(xiàn)mCUC1的表達(dá)量亦呈現(xiàn)升-降-升的趨勢(shì)，其中，在處理48 h 后達(dá)到最高值，為對(duì)照的59.40 倍。以上結(jié)果說明FmCUC1基因響應(yīng)了IAA、6-BA、BR 的信號(hào)刺激。

圖7 FmCUC1 基因在不同激素處理下的表達(dá)情況Fig.7 Expression of FmCUC1 gene under different hormone treatments

2.7 FmCUC1 基因表達(dá)載體構(gòu)建、瞬時(shí)侵染水曲柳及相關(guān)基因表達(dá)情況分析

以SFmCUC1-F 和SFmCUC1-R 為引物，以測(cè)序正確的FmCUC1基因陽(yáng)性克隆質(zhì)粒為模板，成功構(gòu)建植物表達(dá)載體pNC-Cam1304-SubC-FmCUC1（圖8）。

圖8 pNC-Cam1304-SubC-FmCUC1 表達(dá)載體結(jié)構(gòu)圖Fig.8 Structure of pNC-Cam1304-SubC-FmCUC1 expression vector

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化法，能夠快速鑒定基因功能。FmCUC1瞬時(shí)過表達(dá)72 h 后（圖9），基因表達(dá)量明顯高于對(duì)照（FmCUC1基因相對(duì)表達(dá)量 ＞ 1），F(xiàn)mCUC1的過表達(dá)顯著上調(diào)了細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵基因STM與B 型ARR12的表達(dá)分別為對(duì)照的2.82 倍和1.42 倍，而ESR1則下調(diào)表達(dá)；相反生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)鍵基因PLT3、PLT5基因均下調(diào)表達(dá)，可能是因?yàn)樯L(zhǎng)素與細(xì)胞分類素在植物體內(nèi)的微變化才更有利于芽的分化。進(jìn)一步驗(yàn)證了CUC1基因通過調(diào)控下游STM基因的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)頂端分生組織的建立。

圖9 CUC1 基因通路相關(guān)基因表達(dá)情況Fig.9 Expression of genes related to CUC1 gene pathway

3 討論

近年來，由于分子技術(shù)的發(fā)展使人們對(duì)植物再生的基本過程有了新的認(rèn)識(shí)，再生相關(guān)基因功能已在模式植物中逐漸被驗(yàn)證[26]。本研究從水曲柳中克隆獲得FmCUC1基因，該基因與同科植物木犀欖親緣關(guān)系較近。蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)mCUC1基因含有保守的NAC-domain 蛋白結(jié)構(gòu)域與以往研究結(jié)果類似[11]，這表明FmCUC1屬于NAC 基因家族。已有研究報(bào)道，擬南芥AtCUC1定位于細(xì)胞核[9]，亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示，F(xiàn)mCUC1基因定位于細(xì)胞核中，與上訴研究結(jié)果一致，表明FmCUC1可作為轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核中行使功能。FmCUC1基因在水曲柳3 年生盆栽苗的芽中表達(dá)量最高，這與劉超逸[27]研究結(jié)果類似；在水曲柳下胚軸芽再生過程中，進(jìn)一步探究FmCUC1基因的表達(dá)模式，結(jié)果（圖6A）顯示其在芽點(diǎn)產(chǎn)生與叢枝形成期均上調(diào)表達(dá)。張佳薇等[23]關(guān)于水曲柳FmPHV基因克隆及在形成層愈傷組織中的表達(dá)分析研究中可知，芽再生過程中關(guān)鍵基因會(huì)出現(xiàn)2 次表達(dá)峰值的現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)mCUC1基因在種子萌發(fā)的第4 天和第8 天分別達(dá)到2 個(gè)峰值，分別為第0 天的8.56 倍和8.46 倍，與上述結(jié)果類似。因此，推測(cè)FmCUC1基因在芽再生過程中發(fā)揮著重要作用。

植物的再生機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，往往依賴植物激素間的相互作用[28]。研究表明[29]，生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素可直接或者間接地加速植物再生過程。因此，探究了FmCUC1基因?qū)ιL(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的響應(yīng)模式，結(jié)果顯示，在IAA 處理后，F(xiàn)mCUC1的表達(dá)水平與對(duì)照相比明顯升高。研究表明[27,30]，CUC1基因表達(dá)受PIN1（生長(zhǎng)素輸出運(yùn)輸?shù)鞍祝┗蛘{(diào)控，促進(jìn)SAM 的起始，參與其形態(tài)建成，可推測(cè)FmCUC1同樣響應(yīng)生長(zhǎng)素信號(hào)，這與惠麥俠[6]在白菜中的研究結(jié)果一致。外源施加生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素可協(xié)同增強(qiáng)ESR1[31]（芽再生中關(guān)鍵基因）表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)其下游基因CUC1的表達(dá)，促進(jìn)芽再生[13]。本課題組發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)mCUC1基因同樣響應(yīng)了6-BA 信號(hào)，推測(cè)在外源施加細(xì)胞分裂素同樣可促進(jìn)芽再生。此外，已有研究表明[32]，低濃度BR 可誘導(dǎo)SAM 中CUC基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)芽再生。本研究發(fā)現(xiàn)，在1 μmol·L-1BR 處理后，與對(duì)照相比FmCUC1的表達(dá)水平明顯升高，與上述研究結(jié)果一致?？赏茰y(cè)在水曲柳芽再生過程中添加少量BR，有利于莖端分生組織形成，提高不定芽分化。

CUC1基因受生長(zhǎng)素、細(xì)胞分裂素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中多個(gè)關(guān)鍵基因調(diào)控[29]，共同促進(jìn)植物的芽再生能力。生長(zhǎng)素通路中的PLT3、PLT5和PLT7三個(gè)轉(zhuǎn)錄因子可激活下游芽再生特征因子CUC1和CUC2的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)植物具有再生出芽能力[13]。WUS突變體可使植物喪失芽再生能力，表明WUS同樣是芽再生的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，而WUS的表達(dá)又受細(xì)胞分裂素信號(hào)途徑關(guān)鍵因子B 型ARR的調(diào)控，ARR基因可直接結(jié)合到WUS啟動(dòng)子區(qū)域激活其表達(dá)，進(jìn)而影響植物的芽再生能力[33-35]，隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)WUS與STM基因的缺失均會(huì)影響SAM的形成[34]。在擬南芥中，CUC1和CUC2基因在SAM 形成過程中冗余地發(fā)揮作用，CUC1與CUC2基因雙突變體才會(huì)導(dǎo)致幼苗缺失SAM，進(jìn)而表現(xiàn)出杯狀子葉[11]。Wang 等[7]關(guān)于水稻CUC1基因研究表明，OsCUC1與OsCUC3基因?qū)τ诰S持SAM活性起到關(guān)鍵作用，當(dāng)OsCUC1與OsCUC3基因功能缺失時(shí)，會(huì)導(dǎo)致水稻停止生長(zhǎng)最終在苗期死亡。STM基因在SAM 表達(dá)較高，可調(diào)控SAM 中的干細(xì)胞活性[28]，激活細(xì)胞分裂素途徑相關(guān)基因表達(dá)，進(jìn)而影響植物生長(zhǎng)[36]。研究表明[6]，CUC1可促進(jìn)下游STM基因在SAM 中表達(dá)，起始SAM。本研究發(fā)現(xiàn)，在水曲柳中過表達(dá)CUC1基因，其下游STM的表達(dá)上調(diào)，說明FmCUC1基因可能通過調(diào)控下游STM基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)頂端分生組織的建立，影響芽再生能力。因此，可能正是由于生長(zhǎng)素與細(xì)胞分類素在植物體內(nèi)的這種微變化才會(huì)更有利于芽的分化。

4 結(jié)論

綜上所訴，F(xiàn)mCUC1基因?qū)儆贜AC 家族轉(zhuǎn)錄因子，參與水曲柳芽再生過程，響應(yīng)了IAA、6-BA、BR 植物激素信號(hào)誘導(dǎo)，在水曲柳植株中過表達(dá)FmCUC1能促進(jìn)其下游STM基因的表達(dá)顯著上調(diào)，進(jìn)而促進(jìn)芽再生。本研究可為進(jìn)一步研究CUC1基因在水曲柳芽再生過程中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)，但其具體分子機(jī)制及調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有待進(jìn)一步深入分析。