HPLC 法測定康骨寧顆粒中芍藥苷的含量*

黃學(xué)娣 唐莉華 彭天忠 熊 躍※ 黃 寬 李 凡

（1.江西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥劑科，江西 南昌 330003；2.南昌市洪都中醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科，江西 南昌 330008）

康骨寧顆粒是江西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院正在研發(fā)的一個具有活血化瘀、行氣止痛、續(xù)筋接骨之功效，用于骨折初期的醫(yī)療機(jī)構(gòu)傳統(tǒng)中藥制劑。該方由龍血竭、乳香、沒藥、當(dāng)歸、赤芍、川芎等13 味藥組成。該制劑為傳統(tǒng)工藝配制的中藥，因此制備工藝必須遵循水煎煮[1]的原則，而方中君藥龍血竭及乳香、沒藥等均為脂溶性樹脂成分，故將難以測出；而方中當(dāng)歸所含的阿魏酸與處方中的川芎中的阿魏酸有陰性干擾，故選擇赤芍中含量較高的有效成分芍藥苷作為含量測定指標(biāo)。

1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

安捷倫1260 型高效液相色譜儀；十萬分之一電子分析天平（METTLER TOLEDO）；冠博仕超聲波清洗機(jī)；康骨寧顆粒（自制，批號20200701-20200710 共10 批）；康骨寧缺赤芍陰性樣品（自制）；芍藥苷（購自中國食品藥品檢定研究院，批號110736-202044）；乙腈、甲醇為色譜純，磷酸為分析純；娃哈哈純凈水等。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 依據(jù)查閱文獻(xiàn)[2-8]及預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，確定色譜條件如下。色譜柱：C18柱，5 μm×4.6 mm×250 mm；流動相：以乙腈為流動相A，以水（用磷酸調(diào)pH 值為3）為流動相B，按下表進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長：230 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃。見表1。

表1 流動相梯度洗脫情況表

2.2 對照品溶液的制備 取芍藥苷對照品適量，精密稱定，加甲醇超聲溶解，定容至刻度，制成每1 mL 含30 μg的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取批號為20200701 康骨寧顆粒樣品，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率300 W；頻率40 kHz）30 min，取出，放冷，再稱定，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 缺赤芍陰性溶液的制備 取缺赤芍陰性樣品適量，照“2.3 項(xiàng)”方法制備，即得。

2.5 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液及缺赤芍陰性溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖。見圖1～圖3。

圖1 芍藥苷對照品溶液色譜圖

圖2 供試品溶液色譜圖

圖3 缺赤芍陰性溶液色譜圖

結(jié)果表明：本品系統(tǒng)適應(yīng)性良好。芍藥苷保留時間約在9 min，與其他各峰達(dá)到基線分離，且陰性無干擾，理論塔板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)達(dá)3000 以上，符合要求。

2.6 線性關(guān)系考察 按2.1 項(xiàng)色譜條件，分別吸取對照品溶液（芍藥苷濃度為30.32 μg/mL）2 μL、5 μL、8 μL、10 μL、15 μL、20 μL 進(jìn)樣，記錄色譜圖，以峰面積為縱坐標(biāo)，芍藥苷進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：y=1.6262x-14.4976，R2=0.9990，線性范圍為60.64～606.40 ng。結(jié)果見表2、圖4。

表2 芍藥苷線性關(guān)系考察表

圖4 芍藥苷線性關(guān)系圖

結(jié)果：芍藥苷在60.64～606.40 ng 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.7 精密度試驗(yàn) 取芍藥苷對照品溶液，按2.1 項(xiàng)色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積。結(jié)果表明，本法精密度良好。見表3。

表3 精密度試驗(yàn)測定結(jié)果

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號20200701 康骨寧顆粒樣品6份，按2.1 項(xiàng)色譜條件，依法測定，計(jì)算含量，結(jié)果表明，本法重復(fù)性良好。見表4。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)測定結(jié)果

2.9 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下的色譜條件，分別在0、2、4、8、12、18、24 h 后依法測定，記錄峰面積。結(jié)果表明，供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。見表5。

表5 溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.10 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量的康骨寧顆粒（批號：20200701，每1 g 含芍藥苷1.54 mg）6 份，各0.50 g，精密稱定，分別精密加入芍藥苷對照品溶液1 mL（每mL含芍藥苷0.8344 mg），揮干，按供試品溶液的制備方法制備加樣回收樣品溶液，依法測定，計(jì)算回收率。結(jié)果表明，本法回收率良好。見表6。

表6 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.11 樣品含量測定 測定10 批樣品的含量，結(jié)果見表7。

表7 10 批樣品含量測定結(jié)果

3 討論

供試品提取方法參照《中華人民共和國藥典》[2]2015年版一部芍藥苷的含量測定中供試品的提取方法，制備供試品溶液?！吨腥A人民共和國藥典》2015 年版一部芍藥苷的含量測定中供試品溶液的制備均為超聲處理，僅是超聲處理時間不一，故采用超聲處理的方法，考察了0.25、0.5、1.0 和1.5 h 超聲時間的提取效率，發(fā)現(xiàn)0.5 h 即可提取完全；關(guān)于提取溶劑，芍藥苷的提取多為稀乙醇和50%甲醇溶液，二者提取效率和分離效果相當(dāng)，為與對照品溶液溶劑保持一致，因此選擇50%甲醇溶液。

《中華人民共和國藥典》2015 年版一部赤芍飲片項(xiàng)下規(guī)定：含芍藥苷（C23H28O11）不得少于1.5%。本品每1 袋中含赤芍1.44 g，前期工藝篩選中測定芍藥苷的轉(zhuǎn)移率約為67%?？紤]到大生產(chǎn)環(huán)節(jié)中的損耗等因素，以60%轉(zhuǎn)移率計(jì)算，本品每袋含芍藥苷為13.0 mg。故擬將本制劑含量限度定為：本品每袋含赤芍以芍藥苷（C23H28O11）計(jì)，不得少于13.0 mg。

通過方法學(xué)各項(xiàng)指標(biāo)考察，均符合中藥指導(dǎo)原則的要求，說明本方法可操作性強(qiáng)，專屬性好，準(zhǔn)確度、精密度都高，穩(wěn)定性亦可靠，可以作為康骨寧顆粒中芍藥苷定量測定方法。