白頭翁湯對(duì)結(jié)直腸癌小鼠腸道菌群、炎癥因子及HER－2表達(dá)的影響

宋聚才，鞏躍生，劉全林

（鄭州市大腸肛門(mén)病醫(yī)院，河南中醫(yī)藥大學(xué)附屬鄭州市大腸肛門(mén)病醫(yī)院，河南省肛腸病醫(yī)療中心，河南 鄭州 450004）

結(jié)直腸癌（CRC）是臨床上常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，也是導(dǎo)致死亡的主要癌癥因素之一。近年來(lái)，隨著我國(guó)人民生活水平的提高及飲食結(jié)構(gòu)的改變，CRC的發(fā)病率明顯升高［1－2］。手術(shù)是早期治療CRC 最好的選擇，也是唯一能根治CRC 的方法，但對(duì)于中、晚期CRC 的治療，臨床上只能采取放化療或靶向治療等方法緩解患者病情［3］。目前對(duì)于各個(gè)時(shí)期的結(jié)直腸癌，中醫(yī)均有著積極的治療作用，尤其對(duì)于長(zhǎng)期接受放化療的患者而言，中醫(yī)藥治療可減輕放化療的副作用，增強(qiáng)其療效［4］。本研究通過(guò)觀(guān)察白頭翁湯對(duì)結(jié)直腸癌小鼠腫瘤生長(zhǎng)情況、腸道菌群及血清炎癥因子與人表皮生長(zhǎng)因子受體2（HER－2）表達(dá)的影響，以期為白頭翁湯對(duì)CRC的臨床治療提供一定理論與實(shí)驗(yàn)支持。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用6～8周齡，體質(zhì)量（20.0±2.0）g，SPF級(jí)人源化Balb/c 雌性小鼠［動(dòng)物批準(zhǔn)號(hào)：SYXK（粵）2021－0009］40 只為研究對(duì)象。常規(guī)飼養(yǎng)于清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)室中，溫度（22 ± 2）℃、濕度（50 ± 10）%、10 h/14 h 晝夜交替。

1.2 主要藥品及試劑

順鉑（齊魯制藥廠(chǎng)，國(guó)藥準(zhǔn)字：H37021356）；MMP－9、VEGF、IL－10 及TNF－α 酶聯(lián)免疫試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司，批號(hào)：20200315）；白頭翁湯組方：白頭翁15 g，黃柏、秦皮各12 g，黃連6 g，將上述藥材水煎、過(guò)濾、濃縮成含生藥1.0 g/mL 濃度藥液，高壓滅菌后－4 ℃保存待用，所有中藥藥材均來(lái)源于鄭州市大腸肛門(mén)病醫(yī)院中藥房。

1.3 主要儀器

離心機(jī)（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）；切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；顯微鏡（日本Olympus）；全自動(dòng)酶標(biāo)儀（上海閃譜生物科技有限公司）；全自動(dòng)顯微照相系統(tǒng)（日本Olympus）；電子天平（美國(guó)奧豪斯公司）。

1.4 造模、分組及給藥方法

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞株（CT 26，四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保種）接種于小鼠左側(cè)腋前皮下，細(xì)胞接種量為2 × 105個(gè)/0.2 mL。接種4 d后見(jiàn)腫瘤長(zhǎng)出，即視為造模成功。依據(jù)隨機(jī)數(shù)字法將小鼠分為對(duì)照組和研究組，每組各20 只。對(duì)照組小鼠給予順鉑0.1 mL 尾靜脈注射治療，每周1 次，共治療6 周。研究組在對(duì)照組基礎(chǔ)上給予白頭翁湯灌胃，劑量為25 mg/（kg·d），每治療6 d后休息1 d，共治療6周。于第6周給藥結(jié)束后采用斷頸法處死小鼠。

1.5 觀(guān)察指標(biāo)

1.5.1 腫瘤生長(zhǎng)情況

于治療期間每周采用游標(biāo)卡尺測(cè)量1 次腫瘤長(zhǎng)短徑情況，并做好記錄。比較兩組小鼠給藥前后結(jié)直腸腫瘤生長(zhǎng)情況，并繪制腫瘤體積生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.5.2 腸道菌群

于給藥3、6周后分別抽取各組小鼠糞便（0.1 g）作為樣本，并將其放置于9 mL 的無(wú)菌生理鹽水中攪拌稀釋?zhuān)ㄏ♂屩?06倍），制成混懸液，取0.1 mL 混懸液在培養(yǎng)基上涂抹，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h 左右。對(duì)細(xì)菌菌落形態(tài)進(jìn)行觀(guān)察，并計(jì)數(shù)。

1.5.3 血清炎癥因子水平

分別于給藥前及給藥3、6 周后采集小鼠血液1 mL，以2 500 r/min的離心速度離心10 min后，收集血清，－80 ℃超低溫冰箱保存。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)小鼠血清中基質(zhì)金屬蛋白酶－9（MMP－9）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、白細(xì)胞介素－10（IL－10）、腫瘤壞死因子－α（TNF－α）表達(dá)水平，并嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.5.4 腫瘤組織中HER-2表達(dá)

采用免疫組織化學(xué)方法觀(guān)測(cè)腫瘤組織標(biāo)本中HER－2 的表達(dá)。將各組小鼠的病灶處組織進(jìn)行石蠟包埋，將石蠟包埋組織切片（厚度4 μm），常規(guī)脫蠟，60 ℃下烤片過(guò)夜，置入50 μL 3%過(guò)氧化氫溶液中，常溫下孵育10 min，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，PBS沖洗3 次，加入50 μL 的一抗，4 ℃下過(guò)夜后，加入二抗，20 ℃孵育10 min，DBA試劑盒顯色，顯微鏡觀(guān)察，顯色后蒸餾水洗掉，終止顯色，蘇木素復(fù)染2 min，中性樹(shù)膠封片。每張切片隨機(jī)抽取4 個(gè)高倍鏡視野（400×），以細(xì)胞呈棕黃色染色情況判斷，超過(guò)10%的腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)微弱、不完整的細(xì)胞膜著色則為陽(yáng)性表達(dá)，反之則為陰性表達(dá)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 軟件處理，本研究中計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或方差分析和配對(duì)t檢驗(yàn)。以P<0.05 代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠給藥前后結(jié)直腸腫瘤生長(zhǎng)情況比較

給藥第4、5、6 周時(shí)，研究組結(jié)直腸腫瘤體積均明顯小于對(duì)照組（P<0.05）。給藥6周后，研究組小鼠結(jié)直腸腫瘤質(zhì)量為（0.32±0.09）g，顯著低于對(duì)照組的結(jié)直腸腫瘤質(zhì)量（0.65 ± 0.12）g（t= 9.839，P< 0.001）。見(jiàn)表1和圖1。

表1 兩組小鼠給藥后直腸腫瘤體積比較（±s，mm3）

表1 兩組小鼠給藥后直腸腫瘤體積比較（±s，mm3）

組別研究組對(duì)照組t值P值n 20 20給藥4周后205.38±14.64 352.14±28.73 20.345<0.001給藥5周后228.16±19.57 439.56±33.25 24.504<0.001給藥6周后298.75±24.57 574.73±42.25 25.253<0.001

圖1 兩組小鼠直腸腫瘤生長(zhǎng)曲線(xiàn)

2.2 兩組小鼠腸道菌群情況比較

給藥前，兩組大鼠厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、梭桿菌門(mén)及擬桿菌門(mén)菌落數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。給藥3、6 周后，研究組梭桿菌門(mén)、擬桿菌門(mén)菌落數(shù)較對(duì)照組降低，厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)菌落數(shù)較對(duì)照組上升（P<0.05）。見(jiàn)表2。

表2 兩組小鼠給藥前及給藥3、6周后腸道菌群菌落數(shù)情況比較（±s，個(gè)）

表2 兩組小鼠給藥前及給藥3、6周后腸道菌群菌落數(shù)情況比較（±s，個(gè)）

注：與對(duì)照組給藥3周后比較，aP<0.05；與對(duì)照組給藥6周后比較，bP<0.05；與同組給藥前比較，cP<0.05。

擬桿菌門(mén)43.32±3.46 36.63±3.37ac 34.89±3.48bc 43.25±3.24 40.36±3.27c 37.48±3.15c組別研究組n 20對(duì)照組20時(shí)間給藥前給藥3周后給藥6周后給藥前給藥3周后給藥6周后厚壁菌門(mén)29.18±3.42 33.24±3.37ac 36.35±3.48bc 28.57±3.38 30.46±3.46c 33.18±3.37c變形菌門(mén)10.21±1.34 13.75±1.46ac 15.08±1.43bc 10.03±1.37 11.85±1.46c 13.23±1.54c梭桿菌門(mén)13.79±2.23 7.04±1.13ac 3.45±0.89bc 13.86±2.13 9.73±1.17c 7.82±1.05c

2.3 兩組小鼠給藥前及給藥3、6 周后血清炎癥因子水平變化情況比較

與給藥前比較，兩組小鼠給藥3 周、6 周后血清MMP－9、VEGF、IL－10 及TNF－α 濃度均明顯降低（P<0.05）；給藥3周、6周后研究組小鼠血清MMP－9、VEGF、IL－10及TNF－α濃度均低于對(duì)照組（P<0.05）。見(jiàn)表3。

表3 兩組小鼠給藥前及給藥3、6周后血清炎癥因子水平比較（±s）

表3 兩組小鼠給藥前及給藥3、6周后血清炎癥因子水平比較（±s）

注：與對(duì)照組給藥3周后比較，aP<0.05；與對(duì)照組給藥6周后比較，bP<0.05；與同組給藥前比較，cP<0.05。

TNF－α（ng/mL）15.02±3.31 9.67±2.34ac 5.11±1.98bc 14.87±3.24 12.28±2.67c 7.98±2.13c組別研究組n 20對(duì)照組20時(shí)間給藥前給藥3周后給藥6周后給藥前給藥3周后給藥6周后MMP－9（mg/L）389.58±33.62 330.21±25.17ac 308.37±20.42bc 387.24±32.47 350.74±26.48c 332.23±24.13c VEGF（pg/mL）10.92±2.24 6.78±1.55ac 5.07±1.13bc 10.78±2.19 8.52±2.07c 6.38±1.24c IL－10（mg/L）180.57±33.53 132.34±24.55ac 108.33±18.19bc 177.64±31.27 152.85±26.17c 117.93±22.42c

2.4 兩組小鼠腫瘤組織中HER－2表達(dá)情況比較

給藥6周后，各組小鼠腫瘤組織中HER－2陽(yáng)性產(chǎn)物定位于細(xì)胞膜中。研究組小鼠腫瘤組織中HER－2陽(yáng)性表達(dá)率為20%（4/20），明顯低于對(duì)照組的HER－2陽(yáng)性表達(dá)率60%（12/20），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 HER－2在結(jié)直腸癌組織細(xì)胞膜中的陽(yáng)性表達(dá)（DBA染色，×400）

3 討論

CRC 是臨床常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，其發(fā)病原因目前尚未完全清楚，通常認(rèn)為良性腺瘤（乳頭狀腺瘤、家族性多發(fā)性結(jié)腸息肉）惡性變、高脂肪膳食、低渣飲食等是CRC 的主要誘發(fā)因素［5－6］。臨床研究表明，CRC 的發(fā)病機(jī)制與自身免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)，有大量炎癥因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)通過(guò)調(diào)節(jié)機(jī)體各種免疫細(xì)胞的增殖、分化及免疫功能激活等過(guò)程參與到CRC 的生理及病理反應(yīng)過(guò)程中［7－8］。近年來(lái)，對(duì)于中、晚期結(jié)直腸癌的臨床治療雖然取得了較大的進(jìn)步，但常用針對(duì)性及敏感性高的化療藥物，如順鉑類(lèi)、氟尿嘧啶及伊立替康等，不良反應(yīng)明顯，且近10年來(lái)，臨床上尚未有新的化療藥物上市［9］。中醫(yī)學(xué)將本病歸為“積聚”“腸積”“癥瘕”范疇，認(rèn)為其發(fā)病機(jī)制為邪毒入侵、飲食失節(jié)、情志不調(diào)及舊疾等因素影響，導(dǎo)致脾胃受損，氣血不暢，濕濁內(nèi)生，日久濁毒瘀積而形成腫瘤，因此中醫(yī)治療常以祛瘀散結(jié)解毒為主［10］。

白頭翁湯最早記載于《傷寒論》，由白頭翁、黃柏、秦皮、黃連組成，其中白頭翁具有涼血止痢、清熱解毒的功效；黃柏具有瀉火補(bǔ)水、清熱燥濕的功效；秦皮可起到收澀止痢、清熱燥濕的作用；黃連具有瀉火解毒、清熱燥濕的功效。以上諸藥共用可涼肝益腎、清熱解毒［11－12］。本研究將其應(yīng)用于CRC 小鼠的治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給藥6周后，研究組小鼠CRC腫瘤體積及質(zhì)量均明顯小于對(duì)照組，表明白頭翁湯對(duì)小鼠CRC 腫瘤的生長(zhǎng)起到了明顯的抑制作用。

CRC 臨床表現(xiàn)為身熱、膿血便、腹瀉、肛門(mén)灼熱及小便短黃等癥狀，這是濕熱內(nèi)蘊(yùn)的表現(xiàn)，這些癥狀均與炎癥反應(yīng)有著密切關(guān)系［13］。IL－10作為一種免疫抑制因子，可通過(guò)多種途徑抑制免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，從而有利于腫瘤的增殖和進(jìn)展［14］。TNF－α是最常見(jiàn)的炎癥因子，在CRC 炎癥反應(yīng)中起到重要作用［15］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究認(rèn)為［16］，白頭翁的有效成分具有較強(qiáng)的抗炎、抗菌作用。黃柏的有效成分對(duì)大腸桿菌、葡萄球菌等菌類(lèi)產(chǎn)生明顯的抑制作用，并具有較強(qiáng)的抗炎效果。秦皮中的有效成分具有明顯的抗炎鎮(zhèn)痛作用。MMP－9 是MMP 家族成員之一，可影響機(jī)體免疫，促進(jìn)腫瘤血管生成，從而加速腫瘤的增殖和生長(zhǎng)過(guò)程，MMP－9 在惡性癌組織及血清中均呈現(xiàn)出較高水平的表達(dá)，與腫瘤進(jìn)展程度密切相關(guān)［17］。VEGF 為臨床公認(rèn)的促血管生成因子，可通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞旁途徑，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移及腫瘤新生血管生成，是影響腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要炎癥因子［18］。HER－2是HER 家族成員之一，主要存在于細(xì)胞膜上，當(dāng)HER 被激活后可加速腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移，此外，HER 還可通過(guò)抑制體內(nèi)免疫系統(tǒng)的修改能力，加速VEGF 因子的表達(dá)，最終起到促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲的作用［19］。HER－2 受體基因可通過(guò)細(xì)胞生長(zhǎng)因子信號(hào)傳導(dǎo)通路，對(duì)正常細(xì)胞的生長(zhǎng)與分裂起作用［20］。本研究結(jié)果顯示，給藥3、6 周后研究組小鼠血清MMP－9、VEGF、IL－10 及TNF－α 濃度均低于對(duì)照組，提示白頭翁湯可有效降低CRC 小鼠血清MMP－9、VEGF、IL－10 和TNF－α 的表達(dá)水平。給藥6 周后，研究組HER－2 陽(yáng)性表達(dá)低于對(duì)照組，這也可能是研究組給藥后腫瘤體積及腫瘤質(zhì)量均更低的重要原因。

綜上所述，白頭翁湯可有效改善結(jié)直腸癌小鼠紊亂的腸道菌群，有效降低結(jié)直腸癌小鼠血清炎癥因子及HER 的表達(dá)，抑制腫瘤增大和生長(zhǎng)，臨床治療效果滿(mǎn)意，但其抗腫瘤機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。