cfr基因介導(dǎo)的耐利奈唑胺頭狀葡萄球菌及其同源性研究

房鈺良，李宜雷，劉真真，劉艷飛，朱元祺1,*

(1.青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部 檢驗系，山東 青島266071；2.青島大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 青島266003；3.山東省日照市人民醫(yī)院，山東 日照276826)

頭狀葡萄球菌屬于條件致病菌，在自然界中分布廣泛，可引起皮膚軟組織、心內(nèi)膜炎和血流等感染[1-2]。利奈唑胺為惡唑烷酮類抗菌藥物，自2000年上市以來，國內(nèi)外陸續(xù)報道以凝固酶陰性葡萄球菌為主的利奈唑胺耐藥株[3-4]。頭狀葡萄球菌對利奈唑胺的耐藥機(jī)制有多種。其中，cfr基因(chloramphenicol-florfenicolresistance,氯霉素-氟甲砜霉素耐藥基因)編碼的甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的耐藥越來越引起臨床的重視，因為該基因常常位于可移動質(zhì)粒上，從而使頭狀葡萄球菌通過接受外來的耐藥質(zhì)粒而獲得耐藥性[5]。此外，另一個位于質(zhì)粒上的耐藥optrA基因(編碼ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)也介導(dǎo)利奈唑胺耐藥[3]。到目前為止，關(guān)于ICU患者分離的耐利奈唑胺的頭狀葡萄球菌的報道相對較少。因此，本文對2018年6月-2019年10月分離自某醫(yī)院ICU患者血液標(biāo)本的耐利奈唑胺頭狀葡萄球菌進(jìn)行cfr基因和optrA基因檢測，并對這些菌株之間的同源性進(jìn)行研究，現(xiàn)報告如下。

1 材料和方法

1.1 實驗菌株收集的利奈唑胺耐藥頭狀葡萄球菌是2018年6月-2019年10月分離自某醫(yī)院ICU患者的血液標(biāo)本，共9株，分離自9位患者。沙門菌H9812作為脈沖場電泳分子量標(biāo)記菌，金黃色葡萄球菌ATCC29213為儀器藥敏質(zhì)控菌株，均為本實驗室保存。cfr和optrA基因陽性對照的松鼠葡萄球菌由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)樊老師惠贈。

1.2 儀器與試劑VITEK 2 Compact 全自動細(xì)菌鑒定及藥敏分析系統(tǒng)(生物梅里埃公司)。藥敏卡為GP67(梅里埃)，結(jié)果判定依據(jù)CLSI-2019標(biāo)準(zhǔn)[6]。脈沖場電泳系統(tǒng)CHEF-DR II和凝膠成像ChemiDoc XRS(美國BIO-RAD公司)。其他試劑為寶生物(Takara)公司。

1.3cfr和optrA基因的擴(kuò)增和測序cfr基因(編碼甲基轉(zhuǎn)移酶)和optrA基因(編碼ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)的擴(kuò)增依據(jù)參考文獻(xiàn)進(jìn)行[5，7]。目的基因的PCR引物合成及擴(kuò)增產(chǎn)物片段的測序為生工(上海)生物工程有限公司。

1.4 菌株的Sma I酶切頭狀葡萄球菌基因組脈沖場凝膠電泳脈沖場凝膠電泳具體操作參照文獻(xiàn)改良[8]。電泳參數(shù)：電壓6 V/cm,夾角120°，轉(zhuǎn)角時間，初始轉(zhuǎn)角4 s，終末轉(zhuǎn)角40 s，電泳時間19 h。結(jié)果判定依據(jù)Tenover規(guī)則[9]。

1.5 菌株的高通量測序基于二代Illumina和三代Nanopore測序平臺對代表性頭狀葡萄球菌QD40株進(jìn)行測序。然后，對獲得的細(xì)菌基因組和質(zhì)粒序列利用ResFinder等一系列軟件分析菌株的生物信息。

2 結(jié)果

2.1 菌株的藥敏和耐藥基因的擴(kuò)增和測序結(jié)果

9株頭狀葡萄球菌分離株(QD31-QD37,QD40和QD41)的頭孢西丁篩選實驗都是陽性，并對青霉素、苯唑西林、紅霉素、克林霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、莫西沙星和利奈唑胺耐藥，但對萬古霉素、替加環(huán)素和利福平敏感，詳見表1。

PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物測序顯示這9株頭狀葡萄球菌都攜帶cfr基因，但未檢測到optrA基因。cfr基因的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果見圖1。

表1 頭狀葡萄球菌臨床株的藥敏結(jié)果(μg/mL)

圖1 PCR擴(kuò)增頭狀葡萄球菌cfr基因的產(chǎn)物電泳圖

2.2 Sma I酶切頭狀葡萄球菌基因組脈沖場凝膠電泳

Sma I酶切脈沖場凝膠電泳顯示9株頭狀葡萄球菌的電泳條帶位置大小和數(shù)目完全相同。依據(jù)Tenover規(guī)則[9]，這9株頭狀葡萄球菌屬于相同的基因型，是相同的菌株(Indistinguishable)，即暴發(fā)菌株，表明在ICU患者間存在同一克隆的流行播散。9株頭狀葡萄球菌的脈沖場凝膠電泳結(jié)果見圖2。

2.3 菌株的高通量測序結(jié)果

基于高通量測序平臺，獲得了頭狀葡萄球菌QD40株的染色質(zhì)(命名為QD40-chr)和攜帶的3個質(zhì)粒(分別命名為pQD40-1 ，pQD40-2和pQD40-3)的全序列。經(jīng)軟件分析顯示：染色質(zhì)QD40-chr攜帶了erm(A),aac(6′)-aph(2″),aadD,ant(9)-Ia和mecA耐藥基因；頭狀葡萄球菌QD40株攜帶3個質(zhì)粒，其中質(zhì)粒pQD40-3大小為39 504 bp，攜帶了cfr基因。菌株的高通量測序分析結(jié)果詳見表2。

3 討論

隨著利奈唑胺在臨床感染治療中的應(yīng)用，對利奈唑胺耐藥病原菌的報道越來越多，并以凝固酶陰性葡萄球菌為主[1,3]。對利奈唑胺耐藥的機(jī)制為：①23S rRNA V區(qū)基因突變；②核糖體蛋白L3和L4突變；③甲基轉(zhuǎn)移酶(由cfr基因編碼)介導(dǎo)的耐藥;④ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette transporter，ABC,由optrA基因編碼)介導(dǎo)的耐藥[10]。

圖2 Sma I酶切頭狀葡萄球菌基因組脈沖場凝膠電泳

表2 頭狀葡萄球菌QD40株的染色質(zhì)和攜帶質(zhì)粒的生物信息分析

本研究中，9株頭狀葡萄球菌經(jīng)PCR擴(kuò)增和產(chǎn)物測序顯示都攜帶cfr基因，而且高通量測序進(jìn)一步驗證在頭狀葡萄球菌QD40中，該基因位于大小為39 504bp的質(zhì)粒pQD40-3上，而且該質(zhì)粒同時攜帶aac(6′)-aph(2″)基因。另外，在頭狀葡萄球菌QD40中，染色質(zhì)QD40-chr上攜帶了erm(A)、 aac(6′)-aph(2″)、 aadD、ant(9)-Ia和mecA耐藥基因，而質(zhì)粒pQD40-1和pQD40-2分別攜帶qacA基因和blaZ基因。此外，這些菌株的藥敏實驗顯示頭孢西丁篩選實驗陽性，并對青霉素、苯唑西林、大環(huán)內(nèi)酯類和喹諾酮類耐藥。以上結(jié)果表明，這9株頭狀葡萄球菌的耐藥表型與基因型相一致，即菌株呈現(xiàn)的多重耐藥表型與其攜帶的耐藥基因相符合。

來自牛體內(nèi)的松鼠葡萄球菌分離株攜帶的cfr基因是2000年由Schwarz首先報道[11]。而位于腸球菌屬質(zhì)粒上的optrA基因最初是Wang等[7]于2015年報道。由于cfr基因和optrA基因常常位于質(zhì)粒上，使病原菌容易獲得性耐藥，并導(dǎo)致醫(yī)院感染的流行或暴發(fā)[10]。依據(jù)Tenover規(guī)則[9]，本研究的9株頭狀葡萄球菌有相同的PFGE圖，提示這些菌屬于相同的基因型，是相同的菌株(Indistinguishable)，即暴發(fā)菌株，這表明在ICU患者之間存在相同克隆的暴發(fā)流行。此外，不同種的葡萄球菌也可對利奈唑胺耐藥，也可引起醫(yī)院感染暴發(fā)。如，García報道了由利奈唑胺耐藥的金黃色葡萄球菌引起的ICU患者之間的醫(yī)院感染暴發(fā)流行[12]，而Kelly則報道由利奈唑胺耐藥的表皮葡萄球菌在ICU導(dǎo)致的克隆暴發(fā)[13]。因此，質(zhì)粒攜帶cfr基因的葡萄球菌容易在住院患者之間傳播，引起醫(yī)院感染暴發(fā)流行，這應(yīng)引起臨床重視。

有研究表明，細(xì)菌對利奈唑胺耐藥與長期使用該藥引發(fā)選擇性壓力下的耐藥有關(guān)[10]。通過回顧性分析9株頭狀葡萄球菌分離株來源患者的臨床資料，發(fā)現(xiàn)這些患者都曾經(jīng)接受利奈唑胺的抗感染治療。與我們研究相同的是，Yang于2013年報道[14]在兩所醫(yī)院出現(xiàn)攜帶cfr基因的對利奈唑胺耐藥凝固酶陰性葡萄球菌，也是因為這些患者接受了利奈唑胺的治療。同樣，楊洋于2017年也報道2例患者在使用利奈唑胺治療2 周期間出現(xiàn)了頭狀葡萄球菌耐藥株[15]。因此，臨床在使用利奈唑胺治療時，需要謹(jǐn)慎延長治療時間并要動態(tài)監(jiān)測菌株的耐藥性。

optrA基因編碼的ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可介導(dǎo)噁唑烷酮類耐藥或MIC升高[7，10]。有研究顯示，optrA基因可以在腸球菌屬之間傳遞，甚至在體外實驗中可以傳遞到金黃色葡萄球菌，但是，關(guān)于葡萄球菌臨床株攜帶oprtA基因的報道非常少。在本研究中，也未發(fā)現(xiàn)這9株頭狀葡萄球菌攜帶optrA基因。

總之，攜帶cfr基因的頭狀葡萄球菌容易引起醫(yī)院感染的暴發(fā)流行，在臨床抗感染治療時尤其要注意利奈唑胺使用的療程，并要動態(tài)監(jiān)測耐藥性的發(fā)展。