清肺顆粒HPLC指紋圖譜建立及(R,S)-告依春含量測(cè)定

劉雪松，張 艷，蘇 景，郝敬友，唐 偉，劉彥凱，孫洪杰，徐 麗，薛沾枚，史同瑞*

(1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江齊齊哈爾 161005；2.黑龍江省動(dòng)物疫病控制中心，黑龍江哈爾濱 150030；3.哈爾濱綠達(dá)生動(dòng)物藥業(yè)有限公司，黑龍江哈爾濱 150030)

清肺顆粒是《中華人民共和國(guó)獸藥典》中收錄的經(jīng)典復(fù)方藥，由板藍(lán)根、葶藶子、浙貝母、桔梗以及甘草組成，具有清肺平喘、化痰止咳的功效，對(duì)發(fā)熱咳嗽、咽喉腫痛的治療有非常好的療效[1-2]。到目前為止，清肺顆粒的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)僅僅是采用薄層色譜法對(duì)幾種成分進(jìn)行鑒定。為了更好地對(duì)清肺顆粒的質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測(cè)，本試驗(yàn)參考了相關(guān)文獻(xiàn)[3-4]，建立了清肺顆粒HPLC指紋圖譜，并測(cè)定了其中(R,S)-告依春的含量，以期為質(zhì)量控制提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器 島津LC20-AT液相色譜儀、SPD-M20A二級(jí)陣列管檢測(cè)器、InertSustainC18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，日本島津公司產(chǎn)品；KQ5200B超聲清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；電子分析天平，梅特勒-托利多有限公司產(chǎn)品；Milli-Q型超純水機(jī)，美國(guó)密理博公司產(chǎn)品；色譜級(jí)甲醇以及乙腈，北京迪科馬科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 藥品 (R,S)-告依春對(duì)照品(批號(hào)111753-202007)，購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量均大于98%；10批清肺顆粒由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)畜牧獸醫(yī)分院制備；板藍(lán)根、葶藶子、浙貝母、桔梗以及甘草購(gòu)自黑龍江省齊齊哈爾市不同中藥店，經(jīng)過(guò)鑒定均為正品，均符合2015年版《中國(guó)藥典》的相關(guān)規(guī)定。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 流動(dòng)相為乙腈-5 mL/L甲酸，梯度洗脫(0～30 min 50 mL/L～840 mL/L乙腈；30 min～40 min 840 mL/L～950 mL/L乙腈；40 min～50 min 950 mL/L～50 mL/L乙腈；50 min～60 min 50 mL/L乙腈)，體積流量1 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，進(jìn)樣量 10 μL。

1.2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取(R,S)-告依春對(duì)照品適量，置于容量瓶中，加入相應(yīng)適量的乙腈配成濃度為40 μg/mL溶液。

1.2.3 供試品溶液制備 精密稱取清肺顆粒20 g，置于錐形瓶中，加入20 mL甲醇，密塞，超聲(250 W，50 kHz)30 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足丟失的重量，搖勻，濾過(guò)。取濾過(guò)液加入60 mL無(wú)水乙醇，放置在4℃環(huán)境下冷藏過(guò)夜，4 000 r/min離心10 min后，吸取上清液，過(guò)0.22 μm濾膜，進(jìn)行液相色譜分析。

1.2.4 精密度試驗(yàn) 取清肺顆粒提取液按照1.2.1的色譜方法測(cè)定6次，以(R,S)-告依春為參照峰，對(duì)該方法的精密度進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取清肺顆粒提取液在0、3、6、12、24 h，按照1.2.1的色譜方法進(jìn)行測(cè)定，以(R,S)-告依春為參照峰，對(duì)該方法的穩(wěn)定性進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 平行制備6份清肺顆粒提取液，按照1.2.1的色譜方法進(jìn)行測(cè)定，以(R,S)-告依春為參照峰，對(duì)該方法的穩(wěn)定性進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.7 指紋圖譜的建立 制備清肺顆粒提取物樣品溶液10批，10 μL進(jìn)樣分析，選取峰面積大于1%的共有峰積分，以(R,S)-告依春色譜峰的保留時(shí)間和峰面積積分值為1，計(jì)算各峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。

1.2.8 相似度分析 采用國(guó)家藥典委員會(huì)編寫(xiě)的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2012A版”。參數(shù)設(shè)置如下：參照?qǐng)D譜采用第3批樣品色譜圖作為相似度計(jì)算時(shí)校正的參照?qǐng)D譜，時(shí)間窗寬度為0.10，數(shù)據(jù)剪切為0～45 min，校正方式采用自動(dòng)校正結(jié)合多點(diǎn)校正。采用平均算法進(jìn)行指紋圖譜的生成。以對(duì)照?qǐng)D為參照，各樣品指紋圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜進(jìn)行比較，計(jì)算得出各個(gè)批次指紋圖譜的相似度。

1.2.9 指紋圖譜共有峰來(lái)源確認(rèn) 按照清肺顆粒提取液的制作方法，分別制備板藍(lán)根、浙貝母、甘草、葶藶子以及桔梗的單味藥材樣品溶液，按照相同的色譜方法進(jìn)行分析，分別將單味藥的色譜圖與指紋圖譜共有峰圖進(jìn)行對(duì)比，確認(rèn)共有峰來(lái)源。

1.2.10 (R,S)-告依春含量測(cè)定 精密吸取供試品以及板藍(lán)根缺失樣品溶液，按照1.2.1色譜方法進(jìn)行測(cè)定，精密吸取對(duì)照品溶液0.5、1、5、10、15 mL，置于25 mL容量瓶中，加乙腈稀釋，超聲。按照1.2.1色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以定量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，以藥物濃度為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)該方法的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性進(jìn)行試驗(yàn)。精密稱取板藍(lán)根缺失清肺顆粒，平均分成3份，按照80%、100%、120%水平加入(R,S)-告依春對(duì)照品溶液，按照1.2.3的方法制備供試品溶液，按照1.2.1的方法檢測(cè)，測(cè)定(R,S)-告依春加樣回收率，并運(yùn)用該方法測(cè)定清肺顆粒中的(R,S)-告依春含量。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)專屬性

在精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)以及重復(fù)性試驗(yàn)中，皆以1號(hào)峰(R,S)-告依春峰為參照峰，其中在精密度試驗(yàn)中各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD小于0.98%，相對(duì)峰面積RSD小于2.96%，表明精密度良好。穩(wěn)定性試驗(yàn)中，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD小于0.94%，相對(duì)峰面積RSD小于2.62%，表明穩(wěn)定性良好。在重復(fù)性試驗(yàn)中，各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD小于0.71%，相對(duì)峰面積RSD小于2.89%，說(shuō)明重復(fù)性良好。用該HPLC方法可以進(jìn)行清肺顆粒指紋圖譜的建立。

2.2 相似度評(píng)價(jià)

按照1.2.3的方法進(jìn)行供試品制備，1.2.1的方法進(jìn)行測(cè)定(圖1),共標(biāo)定出12個(gè)共有峰，其中通過(guò)相對(duì)保留時(shí)間以及光譜圖可以看出1號(hào)峰為(R,S)-告依春(圖2)。采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012A)進(jìn)行分析，以S3為參照峰進(jìn)行色譜峰自動(dòng)匹配，采用平均算法生成對(duì)照?qǐng)D譜，測(cè)定10批樣品相似度分別為0.982、0.98、0.971、0.982、0.978、0.975、0.981、0.991、0.973、0.988，均大于0.9，說(shuō)明各批次之間的質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定。

圖1 10批清肺顆粒指紋圖譜疊加圖Fig.1 Fingerprint overlay of 10 batches of Qingfei granules

2.3 共有峰歸屬

通過(guò)對(duì)比確認(rèn)了1、2、3、6、7、8、9號(hào)峰來(lái)自于板藍(lán)根，2、6、8號(hào)峰來(lái)自于葶藶子，2、3、9、10號(hào)峰來(lái)自于甘草，4、5、7、11號(hào)峰來(lái)自于貝母，7和12號(hào)峰來(lái)自于桔梗(圖3)。

a.清肺顆粒；b.對(duì)照品a.Qingfei granules;b.Control solution圖2 清肺顆粒提取液與對(duì)照品溶液中(R,S)-告依春對(duì)比Fig.2 Comparisons of epigoitrin in Qingfei granules extract and control solution

圖3 各個(gè)藥材共有峰色譜圖Fig.3 Chromatogram of common peaks of each medicinal material

2.4 (R,S)-告依春含量測(cè)定

精密吸取供試品溶液以及板藍(lán)根陰性缺失溶液，按照1.2.1的色譜方法進(jìn)行測(cè)定(圖4)。在板藍(lán)根陰性缺失溶液中，沒(méi)有供試品溶液中(R,S)-告依春處的色譜峰，說(shuō)明方法的專屬性良好。以定量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，以藥物濃度為橫坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。該標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)為0.996 9，方程為y=1.060 5x-2.157 6。精密度試驗(yàn)中測(cè)得(R,S)-告依春峰面積RSD為0.73%，穩(wěn)定性試驗(yàn)中測(cè)得(R,S)-告依春峰面積RSD為0.86%，重復(fù)性試驗(yàn)中測(cè)得(R,S)-告依春峰面積RSD為1.53%。該結(jié)果表明該方法的精密度、穩(wěn)定性以及重復(fù)性良好。加樣回收率試驗(yàn)中，測(cè)得(R,S)-告依春加樣回收率為98.63%，RSD為1.56%。運(yùn)用該方法測(cè)定10批清肺顆粒中(R,S)-告依春含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 (R,S)-告依春含量測(cè)定(n=5)Table 1 Determination of the content of epigoitrin(n=5)

圖4 方法專屬性圖Fig.4 Chromatogram of method specificity

3 討論

清肺顆粒中的板藍(lán)根、葶藶子、甘草、桔梗以及浙貝母具有清熱解毒、涼血利咽、補(bǔ)中益氣、潤(rùn)肺止咳、清熱解毒等作用，對(duì)于抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)免疫以及解毒抗癌等具有良好的效果[5-8]。清肺顆粒具有清肺平喘、化痰止咳的功效，對(duì)于治療動(dòng)物的感冒、發(fā)熱、咳嗽等疾病有較好療效。

本試驗(yàn)比較了乙腈-水流動(dòng)相系統(tǒng)以及乙腈-5 mL/L甲酸流動(dòng)相系統(tǒng)的差別，并在選擇出峰數(shù)目適中、峰面積適中以及分離度較好的流動(dòng)相的情況下，篩選出適合的檢測(cè)波長(zhǎng)。經(jīng)過(guò)對(duì)比后，發(fā)現(xiàn)乙腈-5 mL/L甲酸流動(dòng)相更加適合清肺顆粒指紋圖譜的建立。在流動(dòng)相中加入酸性試劑，可以抑制復(fù)方藥中某些酸性成分的電離，從而使其保持著游離狀態(tài)，便于液相色譜的檢測(cè)，并且加入酸性試劑也有利于改善色譜峰的峰形以及分離度，讓HPLC指紋圖譜方法更加有效地進(jìn)行質(zhì)量控制的檢測(cè)[4]。對(duì)比了254、280、300、350 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下色譜圖的差異，發(fā)現(xiàn)300 nm以及350 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，出峰數(shù)目顯著小于254 nm以及280 nm。254 nm以及280 nm處的出峰數(shù)目、峰面積以及分離度差異不顯著，但是考慮到(R,S)-告依春的檢測(cè)波長(zhǎng)一般為245 nm，故選擇254 nm為本次試驗(yàn)的檢測(cè)波長(zhǎng)[10]。

通過(guò)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012A版)發(fā)現(xiàn)了10批清肺顆粒中共有12個(gè)共有峰，其中板藍(lán)根有7個(gè)共有峰，葶藶子有3個(gè)共有峰，甘草有4個(gè)共有峰，浙貝母有4個(gè)共有峰，桔梗有2個(gè)共有峰。這其中板藍(lán)根的共有峰最多。發(fā)現(xiàn)各個(gè)藥材中存在著共有峰交差現(xiàn)象。造成這種現(xiàn)象的原因可能是因?yàn)橹兴巻挝端幉慕?jīng)過(guò)提取后成分復(fù)雜，包括了多糖類、黃酮類以及木質(zhì)素類等物質(zhì)[11-12]。引起這種共有峰交差存在的現(xiàn)象有可能是不同種藥材中存在著相似的有效成分，并且這些物質(zhì)的紫外吸收光譜相近導(dǎo)致的。

(R,S)-告依春是板藍(lán)根中主要的芥子苷類成分，與板藍(lán)根的用藥功能主治相關(guān)且為專屬性成分。(R,S)-告依春具有抗菌、抗病毒以及抗內(nèi)毒素等作用[13]。許多中藥復(fù)方制劑中都以(R,S)-告依春的含量為指標(biāo)進(jìn)行質(zhì)量控制。夏金松等就用高效液相色譜法檢測(cè)扶正解毒微粉中(R,S)-告依春含量，測(cè)得10批扶正解毒微粉中(R,S)-告依春平均含量為0.026%[14]。陳路等就采用高效液相色譜法測(cè)定板山崗顆粒中(R,S)-告依春含量，得出板山崗顆粒中(R,S)-告依春平均含量為0.065 5 mg/g[15]。本試驗(yàn)采用高效液相色譜的方法建立了清肺顆粒指紋圖譜并且測(cè)定了(R,S)-告依春的含量，通過(guò)建立的方法對(duì)清肺顆粒的質(zhì)量控制提供依據(jù)。