沙門(mén)氏菌感染相關(guān)的雞Toll樣受體研究進(jìn)展

李春華，繆德年，夏 葉，孫瑩慧，魏曉鋒

(1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；2.上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，上海 201203)

沙門(mén)氏菌(Salmonella)感染導(dǎo)致的常見(jiàn)疾病有雞白痢、傷寒和副傷寒等，影響家禽的生長(zhǎng)和生產(chǎn)性能，甚至引起家禽死亡，使養(yǎng)禽業(yè)蒙受巨大經(jīng)濟(jì)損失。另外，污染的家禽肉蛋產(chǎn)品是一種常見(jiàn)的食源性沙門(mén)氏菌污染源，危害人類(lèi)的公共衛(wèi)生安全。禽沙門(mén)氏菌病呈垂直和水平方式傳播，且存在隱性感染，使得禽沙門(mén)氏菌病的防治變得困難。近代養(yǎng)禽業(yè)生產(chǎn)中持續(xù)飼喂抗生素來(lái)防治沙門(mén)氏菌病，不僅造成了沙門(mén)氏菌耐藥性的增強(qiáng)，還導(dǎo)致了過(guò)度使用抗生素以及殘留問(wèn)題。沙門(mén)氏菌能否感染發(fā)病通常與機(jī)體狀況有關(guān)，在抵抗沙門(mén)氏菌感染的過(guò)程中，雞只本身的免疫系統(tǒng)起決定作用；而雞Toll樣受體(chicken Toll-like receptors,chTLRs)在天然免疫方面發(fā)揮重要作用，因此，沙門(mén)氏菌感染與免疫中Toll樣受體的研究逐漸興起，本文綜述了沙門(mén)氏菌感染相關(guān)的雞Toll樣受體研究進(jìn)展。

1 Toll樣受體概述

天然免疫系統(tǒng)是機(jī)體的第一道防線，通過(guò)模式識(shí)別受體實(shí)現(xiàn)對(duì)病原體的早期識(shí)別，誘導(dǎo)天然免疫反應(yīng)的發(fā)生。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是模式識(shí)別受體的一種，可識(shí)別特定的病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)，快速激活天然免疫系統(tǒng)，使機(jī)體產(chǎn)生抵御反應(yīng)。TLRs是一種Ⅰ型跨膜蛋白，其結(jié)構(gòu)高度保守，包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)3個(gè)部分。富含亮氨酸重復(fù)序列(leucine rich repeat,LRR)的胞外區(qū)位于蛋白質(zhì)N端，是配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，促使蛋白質(zhì)間的黏附，參與識(shí)別相應(yīng)的PAMPs[1]；跨膜區(qū)是富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，決定TLRs分子的亞細(xì)胞定位；胞內(nèi)區(qū)位于蛋白質(zhì)C端，具有與白細(xì)胞介素-1受體高度同源的結(jié)構(gòu)域，又稱(chēng)為 Toll/IL-1受體 結(jié)構(gòu)域[2]。機(jī)體在LRR胞外結(jié)構(gòu)域的介導(dǎo)下識(shí)別病原體的PAMPs，通過(guò)Toll/IL-1受體結(jié)構(gòu)域募集并結(jié)合下游的接頭分子，參與信號(hào)傳導(dǎo)并促使信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)發(fā)生；活化下游轉(zhuǎn)錄因子，表達(dá)干擾素(interferon,IFN)、α腫瘤壞死因子(tumornecrosis factor-α,TNF-α)等一系列炎性因子，參與宿主對(duì)抗相應(yīng)病原微生物入侵的天然免疫反應(yīng)[3]。

2 雞TLRs種類(lèi)

TLRs最早發(fā)現(xiàn)于果蠅體內(nèi)，之后在人體細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)了與之同源的Toll樣蛋白，該蛋白在天然免疫過(guò)程中起重要作用。禽類(lèi)的先天免疫研究較為遲緩，進(jìn)入21世紀(jì)后，隨著雞基因組序列測(cè)定的完成，一些雞TLRs的種類(lèi)逐漸被揭示和發(fā)現(xiàn)。目前已發(fā)現(xiàn)的雞TLRs有10種，分別是chTLR1LA、chTLR1LB、chTLR2A、chTLR2B、chTLR3、chTLR4、chTLR5、chTLR7、chTLR15 和 chTLR21[4],在健康雞的外周血單核細(xì)胞中檢測(cè)到10種chTLRs[5]。

這些chTLRs基因的染色體定位有所不同，chTLR1LA、chTLR1LB、chTLR2A、chTLR2B和chTLR3位于染色體4；chTLR4位于染色體17；chTLR5、chTLR15 位于染色體3；chTLR7位于染色體1；chTLR21位于染色體11[6]。chTLR1LA、chTLR1LB、chTLR2A和chTLR2B是TLR1和TLR2在進(jìn)化過(guò)程中基因倍增的產(chǎn)物，chTLR2A和chTLR2B與哺乳動(dòng)物的單一TLR2基因同源；chTLR3、chTLR4、chTLR5、chTLR7同源于其他脊椎動(dòng)物的TLRs；TLR8、TLR9和TLR10存在于哺乳動(dòng)物中，但在雞中缺失；chTLR15是鳥(niǎo)類(lèi)特有的，chTLR21則與魚(yú)類(lèi)和兩棲動(dòng)物的TLR21同源。

3 與沙門(mén)氏菌感染相關(guān)的雞Toll樣受體

3.1 chTLR1LA、chTLR1LB、chTLR2A、chTLR2B

chTLR1LA、chTLR1LB、chTLR2A和chTLR2B均位于細(xì)胞膜上，相互作用，協(xié)同識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞壁的組成成分，如細(xì)菌肽聚糖(PGN)、脂多糖(LPS)和脂質(zhì)。這4種蛋白具有組合功能特征，哺乳動(dòng)物TLR2和TLR1、TLR6、TLR10形成的二聚體可識(shí)別的激動(dòng)劑，也可被chTLR1L與chTLR2 相互作用形成的二聚體所識(shí)別。

chTLR2在抵抗雞沙門(mén)氏菌感染中發(fā)揮較大作用，感染沙門(mén)氏菌后，chTLR2在雞脾臟及盲腸中的表達(dá)量增加。有研究發(fā)現(xiàn)chTLR2B的分布表達(dá)比chTLR2A更為廣泛，chTLR2主要分布于免疫組織系統(tǒng)中，在一定程度上說(shuō)明chTLR2與先天性免疫關(guān)系十分密切[7]。用腸炎沙門(mén)氏菌感染濟(jì)寧百日雞，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組在感染后第3、7、21、28、35天盲腸組織中chTLR2表達(dá)量與對(duì)照組相比差異顯著[8]；感染后第3天chTLR2和chTLR4的表達(dá)量比第1天有所升高，有利于機(jī)體早期免疫應(yīng)答的激活。

不同品種雞的chTLR1LA、chTLR1LB、chTLR2A和chTLR2B存在多態(tài)性，在chTLR1LA和chTLR1LB有27個(gè)氨基酸多態(tài)位點(diǎn)，其中14個(gè)位點(diǎn)存在于chTLR1LA、13個(gè)位點(diǎn)存在于chTLR1LB；chTLR2A和chTLR2B有10個(gè)氨基酸多態(tài)位點(diǎn)，其中6個(gè)位點(diǎn)存在于chTLR2A、4個(gè)位點(diǎn)存在于chTLR2B；對(duì)沙門(mén)氏菌病具有抗性的白來(lái)航雞品種在chTLR1LA和chTLR1LB分別存在一個(gè)獨(dú)特的多態(tài)位點(diǎn)A645T和L275P，LRRCT區(qū)域負(fù)責(zé)配體結(jié)合，LRRCT中的L275P可能影響chTLR1LB對(duì)配體的識(shí)別功能[9]，這些發(fā)現(xiàn)有助于揭示不同品種雞對(duì)疫病的抗性與易感性的差異。

3.2 chTLR3、chTLR7

chTLR3和chTLR7在B/T細(xì)胞等組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)，可以識(shí)別一些人工合成的小分子化合物、病毒單鏈RNA和雙鏈RNA等，主要參與抗病毒感染反應(yīng)[10]。不同品種雞的chTLR3、chTLR7存在多態(tài)性，chTLR3存在7個(gè)氨基酸多態(tài)位點(diǎn)：D14V、R345S、G362E、R459K、A540V、A649V、T713S[11]；chTLR7存在4個(gè)氨基酸多態(tài)位點(diǎn)：V91L、S135T、P669S、V876M；對(duì)H7N1型高致病性禽流感病毒具有抗性的白來(lái)航雞具有R345S、G362E、R459K、P669S、V876M 5個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，而白絲羽烏骨雞具有除S135T之外的所有多態(tài)位點(diǎn)，可以作為研究不同品種雞抗病毒病性狀的良好模型。

3.3 chTLR4

chTLR4位于細(xì)胞膜上，可識(shí)別細(xì)菌的脂多糖，激活宿主的先天免疫以抵抗細(xì)菌感染。多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，雞感染沙門(mén)氏菌后，chTLR4的表達(dá)量上調(diào)。有人研究了沙門(mén)氏菌感染后易感和抗性品種雞盲腸淋巴組織中與載菌狀態(tài)相關(guān)的先天性免疫反應(yīng)因子的基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)抗性品種的chTLR4基因表達(dá)量在感染后第1、2、4周顯著高于易感品種。給雞皮下注射腸炎沙門(mén)氏菌，發(fā)現(xiàn)感染組三黃雞脾臟中chTLR4表達(dá)量上調(diào)顯著，表明被沙門(mén)氏菌感染激活的chTLR4參與了免疫應(yīng)答過(guò)程[12]。

研究顯示沙門(mén)氏菌易感性與chTLR4基因多態(tài)性存在一定相關(guān)性，chTLR4基因有可能為宿主抗沙門(mén)氏菌感染相關(guān)的候選免疫基因。研究發(fā)現(xiàn)chTLR4基因第3外顯子區(qū)域存在14個(gè)突變位點(diǎn)，其中5個(gè)導(dǎo)致了氨基酸改變，分別是：Gly225Glu、Glu301Asp、Arg343Lys、Tyr383His和 Gln611Arg，這5個(gè)氨基酸均位于chTLR4胞外區(qū)的LRR配體識(shí)別區(qū)域；其中Tyr383His和 Gln611Arg為非保守替代的氨基酸，僅存在于易感品種雞。有人研究了SLC11A1和chTLR4兩個(gè)候選基因與雞沙門(mén)氏菌載菌量的效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)沙門(mén)氏菌PT4株感染后，盲腸、卵巢、脾臟和肝臟的載菌量不同；應(yīng)用PCR-SSCP進(jìn)行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)257 bp的chTRL4基因片段中存在3個(gè)SNPs，分別位于外顯子2的Leu73和Glu/Lys83和內(nèi)含子2，突變位點(diǎn)與上述4個(gè)器官的載菌量差異有關(guān)，在盲腸和卵巢中呈顯著相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)chTLR4基因內(nèi)含子區(qū)存在的SNP突變位點(diǎn)(G156C)與脾臟載菌量呈中度相關(guān)。對(duì)引進(jìn)品種雞和地方品種雞進(jìn)行 chTLR4 基因序列檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)36個(gè)SNPs多態(tài)位點(diǎn)，這些突變位點(diǎn)與機(jī)體對(duì)病原菌的抗性具有重要作用[13]。研究10個(gè)不同品種雞的chTLR4，發(fā)現(xiàn)了19個(gè)SNPs，其中4個(gè)與不同品種雞的抗病力相關(guān)，分別為G247A(Glu83Lys)、A896T(Arg298Ser)、A1104C(Ser368Arg)和 A1832G(Gln611Arg)[14]；人工感染白來(lái)航雛雞的試驗(yàn)結(jié)果顯示，與雞抗沙門(mén)氏菌能力顯著相關(guān)的是G247A，基因型GG雞在感染后死亡率較高，而基因型AG和AA雞的死亡率明顯低于前者。

3.4 chTLR5

chTLR5在具有免疫學(xué)和基質(zhì)來(lái)源的組織和細(xì)胞中廣泛表達(dá)，與哺乳動(dòng)物TLR5具有保守的序列和結(jié)構(gòu)相似性。鞭毛是沙門(mén)氏菌的一種毒力因子，也是TLR的PAMPs之一。chTLR5可識(shí)別細(xì)菌鞭毛蛋白成分，但對(duì)來(lái)源于不同種類(lèi)細(xì)菌的鞭毛蛋白存在差異性識(shí)別；chTLR5始終比hTLR5對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌鞭毛蛋白產(chǎn)生更強(qiáng)的應(yīng)答，細(xì)菌鞭毛蛋白中的單個(gè)氨基酸替換可改變物種特異性TLR5反應(yīng)，影響沙門(mén)氏菌感染的宿主范圍和易感性。沙門(mén)氏菌血清型的生物學(xué)差異(全身性或腸道限制性定殖)與鞭毛的存在與否有關(guān)，無(wú)鞭毛的鼠傷寒沙門(mén)氏菌fliM突變體能逃避chTLR5的識(shí)別，入侵定殖率升高，引起的全身感染能力增強(qiáng)；沙門(mén)氏菌鞭毛則可誘導(dǎo)chTLR5的表達(dá)上調(diào)，能調(diào)節(jié)CD4+T類(lèi)群的免疫反應(yīng)，從而有利于清除細(xì)菌，減輕感染[15]。chTLR5在限制鞭毛沙門(mén)氏菌進(jìn)入雞全身部位，抵抗沙門(mén)氏菌的全身性感染中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

3.5 chTLR15

TLR15是禽特有的一種受體，具有保守的氨基酸序列，在雞脾臟、法氏囊和骨髓中表達(dá)，chTLR15識(shí)別毒力相關(guān)的蛋白酶，介導(dǎo)的先天性免疫反應(yīng)有助于禽類(lèi)抵御細(xì)菌入侵[16]。腸炎沙門(mén)氏菌感染雞的盲腸中chTLR15表達(dá)顯著上調(diào)，且與chTLR2的誘導(dǎo)呈顯著相關(guān)性；在受到熱滅活的腸炎沙門(mén)氏菌刺激后，雞胚成纖維細(xì)胞中誘導(dǎo)產(chǎn)生chTLR15。有人研究了海蘭褐雞TLR15基因的生物學(xué)信息及組織表達(dá)，發(fā)現(xiàn)chTLR15在肝臟和肺部表達(dá)較少，主要在脾臟中表達(dá)，且主要分布在細(xì)胞質(zhì)中[17]。沙門(mén)氏菌易感雞和抗性雞嗜異染細(xì)胞中的chTLR15存在差異表達(dá)，在腸炎沙門(mén)氏菌的刺激下，兩組雞的嗜異染細(xì)胞chTLR15 mRNA表達(dá)均顯著增加；與易感雞相比，無(wú)論在腸炎沙門(mén)氏菌刺激之前或之后，抗性雞的嗜異染細(xì)胞中都具有更高的chTLR15 mRNA表達(dá)水平，chTLR15基因表達(dá)上的差異解釋了易感品種與抗性品種對(duì)感染敏感性的差異。清遠(yuǎn)麻雞和白耳雞的chTLR15基因外顯子存在3個(gè)SNPs位點(diǎn)，分別是G168A、C726T和A1166G，其中 C726T位點(diǎn)可能與雞白痢沙門(mén)氏菌病抗性相關(guān)[18]。

3.6 chTLR21

chTLR21是一種先天的CpG DNA受體，主要在B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等細(xì)胞亞群中表達(dá)，定位于細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。chTLR21被稱(chēng)為哺乳動(dòng)物TLR9的功能同系物，二者均識(shí)別微生物的DNA，激發(fā)先天性免疫反應(yīng)，協(xié)同誘導(dǎo)獲得性免疫反應(yīng)[19]。

腸炎沙門(mén)氏菌的細(xì)菌DNA可引起chTLR21轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞內(nèi)NF-κB的活化，而不能誘導(dǎo)hTLR9轉(zhuǎn)染的HEK-293細(xì)胞內(nèi)NF-κB的活化，表明chTLR21比hTLR9具有更廣泛的CpG DNA配體特性，能夠識(shí)別更廣泛的物種[20]。chTLR21在成年家禽、雛禽和雞胚的多種組織中表達(dá)，促使新生雞可對(duì)ODNs迅速做出反應(yīng)；對(duì)雞胚和雛雞進(jìn)行 ODNs 藥物處理，可增強(qiáng)其抗沙門(mén)氏菌感染能力。有研究進(jìn)一步證實(shí)chTLR21能被含有不同的CpG六聚體基序，且長(zhǎng)度范圍在15個(gè)-31個(gè)核苷酸的CpG ODN活化，chTLR21具有廣泛的CpG ODN序列識(shí)別特性，可以識(shí)別微生物的各種DNA相關(guān)分子模式，從而啟動(dòng)家禽對(duì)感染的先天免疫反應(yīng)[21]。將chTLR21的激動(dòng)劑CpG ODN 2007與基于聚乳酸-乙醇酸(PLGA)的空心劑結(jié)合，成功制備了具有強(qiáng)大免疫增強(qiáng)能力的新型佐劑CpG-NP，其在體內(nèi)和體外試驗(yàn)均表現(xiàn)出對(duì)雞有效而持久的免疫刺激能力，在疫苗開(kāi)發(fā)中具有廣泛的應(yīng)用潛力[22]。

4 展望

由沙門(mén)氏菌感染引起的疾病不僅給家禽生產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，也導(dǎo)致人類(lèi)食源性疾病。傳統(tǒng)的沙門(mén)氏菌病防治方法不能滿足對(duì)禽產(chǎn)品安全的需求，隨著分子遺傳育種的開(kāi)展，選擇抗沙門(mén)氏菌的品系進(jìn)行育種已經(jīng)成為一種趨勢(shì)。雞抗沙門(mén)氏菌感染不僅與宿主的功能基因有關(guān)，還受雞的表觀遺傳修飾、雞腸道微生物菌群、雞不同品種或品系等的影響[23]。chTLRs參與機(jī)體抵抗病原體感染的反應(yīng)，在沙門(mén)氏菌感染引發(fā)的機(jī)體免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，是一種抗性相關(guān)基因，也是遺傳育種研究中的重要候選基因。本文綜述了與沙門(mén)氏菌感染相關(guān)的chTLRs，不同品種雞chTLRs的多態(tài)性，及其對(duì)沙門(mén)氏菌的抗性或易感性的影響，可為家禽抗病育種與沙門(mén)氏菌病防治提供參考。