沙門氏菌感染相關的雞Toll樣受體研究進展

李春華，繆德年，夏 葉，孫瑩慧，魏曉鋒

(1.上海市農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，上海 201106；2.上海實驗動物研究中心，上海 201203)

沙門氏菌(Salmonella)感染導致的常見疾病有雞白痢、傷寒和副傷寒等，影響家禽的生長和生產性能，甚至引起家禽死亡，使養(yǎng)禽業(yè)蒙受巨大經(jīng)濟損失。另外，污染的家禽肉蛋產品是一種常見的食源性沙門氏菌污染源，危害人類的公共衛(wèi)生安全。禽沙門氏菌病呈垂直和水平方式傳播，且存在隱性感染，使得禽沙門氏菌病的防治變得困難。近代養(yǎng)禽業(yè)生產中持續(xù)飼喂抗生素來防治沙門氏菌病，不僅造成了沙門氏菌耐藥性的增強，還導致了過度使用抗生素以及殘留問題。沙門氏菌能否感染發(fā)病通常與機體狀況有關，在抵抗沙門氏菌感染的過程中，雞只本身的免疫系統(tǒng)起決定作用；而雞Toll樣受體(chicken Toll-like receptors,chTLRs)在天然免疫方面發(fā)揮重要作用，因此，沙門氏菌感染與免疫中Toll樣受體的研究逐漸興起，本文綜述了沙門氏菌感染相關的雞Toll樣受體研究進展。

1 Toll樣受體概述

天然免疫系統(tǒng)是機體的第一道防線，通過模式識別受體實現(xiàn)對病原體的早期識別，誘導天然免疫反應的發(fā)生。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是模式識別受體的一種，可識別特定的病原相關分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs)，快速激活天然免疫系統(tǒng)，使機體產生抵御反應。TLRs是一種Ⅰ型跨膜蛋白，其結構高度保守，包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內區(qū)3個部分。富含亮氨酸重復序列(leucine rich repeat,LRR)的胞外區(qū)位于蛋白質N端，是配體結合結構域，促使蛋白質間的黏附，參與識別相應的PAMPs[1]；跨膜區(qū)是富含半胱氨酸的結構域，決定TLRs分子的亞細胞定位；胞內區(qū)位于蛋白質C端，具有與白細胞介素-1受體高度同源的結構域，又稱為 Toll/IL-1受體 結構域[2]。機體在LRR胞外結構域的介導下識別病原體的PAMPs，通過Toll/IL-1受體結構域募集并結合下游的接頭分子，參與信號傳導并促使信號級聯(lián)反應發(fā)生；活化下游轉錄因子，表達干擾素(interferon,IFN)、α腫瘤壞死因子(tumornecrosis factor-α,TNF-α)等一系列炎性因子，參與宿主對抗相應病原微生物入侵的天然免疫反應[3]。

2 雞TLRs種類

TLRs最早發(fā)現(xiàn)于果蠅體內，之后在人體細胞表面發(fā)現(xiàn)了與之同源的Toll樣蛋白，該蛋白在天然免疫過程中起重要作用。禽類的先天免疫研究較為遲緩，進入21世紀后，隨著雞基因組序列測定的完成，一些雞TLRs的種類逐漸被揭示和發(fā)現(xiàn)。目前已發(fā)現(xiàn)的雞TLRs有10種，分別是chTLR1LA、chTLR1LB、chTLR2A、chTLR2B、chTLR3、chTLR4、chTLR5、chTLR7、chTLR15 和 chTLR21[4],在健康雞的外周血單核細胞中檢測到10種chTLRs[5]。

這些chTLRs基因的染色體定位有所不同，chTLR1LA、chTLR1LB、chTLR2A、chTLR2B和chTLR3位于染色體4；chTLR4位于染色體17；chTLR5、chTLR15 位于染色體3；chTLR7位于染色體1；chTLR21位于染色體11[6]。chTLR1LA、chTLR1LB、chTLR2A和chTLR2B是TLR1和TLR2在進化過程中基因倍增的產物，chTLR2A和chTLR2B與哺乳動物的單一TLR2基因同源；chTLR3、chTLR4、chTLR5、chTLR7同源于其他脊椎動物的TLRs；TLR8、TLR9和TLR10存在于哺乳動物中，但在雞中缺失；chTLR15是鳥類特有的，chTLR21則與魚類和兩棲動物的TLR21同源。

3 與沙門氏菌感染相關的雞Toll樣受體

3.1 chTLR1LA、chTLR1LB、chTLR2A、chTLR2B

chTLR1LA、chTLR1LB、chTLR2A和chTLR2B均位于細胞膜上，相互作用，協(xié)同識別細菌細胞壁的組成成分，如細菌肽聚糖(PGN)、脂多糖(LPS)和脂質。這4種蛋白具有組合功能特征，哺乳動物TLR2和TLR1、TLR6、TLR10形成的二聚體可識別的激動劑，也可被chTLR1L與chTLR2 相互作用形成的二聚體所識別。

chTLR2在抵抗雞沙門氏菌感染中發(fā)揮較大作用，感染沙門氏菌后，chTLR2在雞脾臟及盲腸中的表達量增加。有研究發(fā)現(xiàn)chTLR2B的分布表達比chTLR2A更為廣泛，chTLR2主要分布于免疫組織系統(tǒng)中，在一定程度上說明chTLR2與先天性免疫關系十分密切[7]。用腸炎沙門氏菌感染濟寧百日雞，檢測發(fā)現(xiàn)試驗組在感染后第3、7、21、28、35天盲腸組織中chTLR2表達量與對照組相比差異顯著[8]；感染后第3天chTLR2和chTLR4的表達量比第1天有所升高，有利于機體早期免疫應答的激活。

不同品種雞的chTLR1LA、chTLR1LB、chTLR2A和chTLR2B存在多態(tài)性，在chTLR1LA和chTLR1LB有27個氨基酸多態(tài)位點，其中14個位點存在于chTLR1LA、13個位點存在于chTLR1LB；chTLR2A和chTLR2B有10個氨基酸多態(tài)位點，其中6個位點存在于chTLR2A、4個位點存在于chTLR2B；對沙門氏菌病具有抗性的白來航雞品種在chTLR1LA和chTLR1LB分別存在一個獨特的多態(tài)位點A645T和L275P，LRRCT區(qū)域負責配體結合，LRRCT中的L275P可能影響chTLR1LB對配體的識別功能[9]，這些發(fā)現(xiàn)有助于揭示不同品種雞對疫病的抗性與易感性的差異。

3.2 chTLR3、chTLR7

chTLR3和chTLR7在B/T細胞等組織細胞中廣泛表達，可以識別一些人工合成的小分子化合物、病毒單鏈RNA和雙鏈RNA等，主要參與抗病毒感染反應[10]。不同品種雞的chTLR3、chTLR7存在多態(tài)性，chTLR3存在7個氨基酸多態(tài)位點：D14V、R345S、G362E、R459K、A540V、A649V、T713S[11]；chTLR7存在4個氨基酸多態(tài)位點：V91L、S135T、P669S、V876M；對H7N1型高致病性禽流感病毒具有抗性的白來航雞具有R345S、G362E、R459K、P669S、V876M 5個多態(tài)位點，而白絲羽烏骨雞具有除S135T之外的所有多態(tài)位點，可以作為研究不同品種雞抗病毒病性狀的良好模型。

3.3 chTLR4

chTLR4位于細胞膜上，可識別細菌的脂多糖，激活宿主的先天免疫以抵抗細菌感染。多數(shù)研究發(fā)現(xiàn)，雞感染沙門氏菌后，chTLR4的表達量上調。有人研究了沙門氏菌感染后易感和抗性品種雞盲腸淋巴組織中與載菌狀態(tài)相關的先天性免疫反應因子的基因表達，發(fā)現(xiàn)抗性品種的chTLR4基因表達量在感染后第1、2、4周顯著高于易感品種。給雞皮下注射腸炎沙門氏菌，發(fā)現(xiàn)感染組三黃雞脾臟中chTLR4表達量上調顯著，表明被沙門氏菌感染激活的chTLR4參與了免疫應答過程[12]。

研究顯示沙門氏菌易感性與chTLR4基因多態(tài)性存在一定相關性，chTLR4基因有可能為宿主抗沙門氏菌感染相關的候選免疫基因。研究發(fā)現(xiàn)chTLR4基因第3外顯子區(qū)域存在14個突變位點，其中5個導致了氨基酸改變，分別是：Gly225Glu、Glu301Asp、Arg343Lys、Tyr383His和 Gln611Arg，這5個氨基酸均位于chTLR4胞外區(qū)的LRR配體識別區(qū)域；其中Tyr383His和 Gln611Arg為非保守替代的氨基酸，僅存在于易感品種雞。有人研究了SLC11A1和chTLR4兩個候選基因與雞沙門氏菌載菌量的效應，發(fā)現(xiàn)經(jīng)沙門氏菌PT4株感染后，盲腸、卵巢、脾臟和肝臟的載菌量不同；應用PCR-SSCP進行多態(tài)性分析，發(fā)現(xiàn)257 bp的chTRL4基因片段中存在3個SNPs，分別位于外顯子2的Leu73和Glu/Lys83和內含子2，突變位點與上述4個器官的載菌量差異有關，在盲腸和卵巢中呈顯著相關。研究發(fā)現(xiàn)chTLR4基因內含子區(qū)存在的SNP突變位點(G156C)與脾臟載菌量呈中度相關。對引進品種雞和地方品種雞進行 chTLR4 基因序列檢測分析，發(fā)現(xiàn)36個SNPs多態(tài)位點，這些突變位點與機體對病原菌的抗性具有重要作用[13]。研究10個不同品種雞的chTLR4，發(fā)現(xiàn)了19個SNPs，其中4個與不同品種雞的抗病力相關，分別為G247A(Glu83Lys)、A896T(Arg298Ser)、A1104C(Ser368Arg)和 A1832G(Gln611Arg)[14]；人工感染白來航雛雞的試驗結果顯示，與雞抗沙門氏菌能力顯著相關的是G247A，基因型GG雞在感染后死亡率較高，而基因型AG和AA雞的死亡率明顯低于前者。

3.4 chTLR5

chTLR5在具有免疫學和基質來源的組織和細胞中廣泛表達，與哺乳動物TLR5具有保守的序列和結構相似性。鞭毛是沙門氏菌的一種毒力因子，也是TLR的PAMPs之一。chTLR5可識別細菌鞭毛蛋白成分，但對來源于不同種類細菌的鞭毛蛋白存在差異性識別；chTLR5始終比hTLR5對鼠傷寒沙門氏菌鞭毛蛋白產生更強的應答，細菌鞭毛蛋白中的單個氨基酸替換可改變物種特異性TLR5反應，影響沙門氏菌感染的宿主范圍和易感性。沙門氏菌血清型的生物學差異(全身性或腸道限制性定殖)與鞭毛的存在與否有關，無鞭毛的鼠傷寒沙門氏菌fliM突變體能逃避chTLR5的識別，入侵定殖率升高，引起的全身感染能力增強；沙門氏菌鞭毛則可誘導chTLR5的表達上調，能調節(jié)CD4+T類群的免疫反應，從而有利于清除細菌，減輕感染[15]。chTLR5在限制鞭毛沙門氏菌進入雞全身部位，抵抗沙門氏菌的全身性感染中發(fā)揮至關重要的作用。

3.5 chTLR15

TLR15是禽特有的一種受體，具有保守的氨基酸序列，在雞脾臟、法氏囊和骨髓中表達，chTLR15識別毒力相關的蛋白酶，介導的先天性免疫反應有助于禽類抵御細菌入侵[16]。腸炎沙門氏菌感染雞的盲腸中chTLR15表達顯著上調，且與chTLR2的誘導呈顯著相關性；在受到熱滅活的腸炎沙門氏菌刺激后，雞胚成纖維細胞中誘導產生chTLR15。有人研究了海蘭褐雞TLR15基因的生物學信息及組織表達，發(fā)現(xiàn)chTLR15在肝臟和肺部表達較少，主要在脾臟中表達，且主要分布在細胞質中[17]。沙門氏菌易感雞和抗性雞嗜異染細胞中的chTLR15存在差異表達，在腸炎沙門氏菌的刺激下，兩組雞的嗜異染細胞chTLR15 mRNA表達均顯著增加；與易感雞相比，無論在腸炎沙門氏菌刺激之前或之后，抗性雞的嗜異染細胞中都具有更高的chTLR15 mRNA表達水平，chTLR15基因表達上的差異解釋了易感品種與抗性品種對感染敏感性的差異。清遠麻雞和白耳雞的chTLR15基因外顯子存在3個SNPs位點，分別是G168A、C726T和A1166G，其中 C726T位點可能與雞白痢沙門氏菌病抗性相關[18]。

3.6 chTLR21

chTLR21是一種先天的CpG DNA受體，主要在B細胞和巨噬細胞等細胞亞群中表達，定位于細胞的內質網(wǎng)上。chTLR21被稱為哺乳動物TLR9的功能同系物，二者均識別微生物的DNA，激發(fā)先天性免疫反應，協(xié)同誘導獲得性免疫反應[19]。

腸炎沙門氏菌的細菌DNA可引起chTLR21轉染的HEK293細胞內NF-κB的活化，而不能誘導hTLR9轉染的HEK-293細胞內NF-κB的活化，表明chTLR21比hTLR9具有更廣泛的CpG DNA配體特性，能夠識別更廣泛的物種[20]。chTLR21在成年家禽、雛禽和雞胚的多種組織中表達，促使新生雞可對ODNs迅速做出反應；對雞胚和雛雞進行 ODNs 藥物處理，可增強其抗沙門氏菌感染能力。有研究進一步證實chTLR21能被含有不同的CpG六聚體基序，且長度范圍在15個-31個核苷酸的CpG ODN活化，chTLR21具有廣泛的CpG ODN序列識別特性，可以識別微生物的各種DNA相關分子模式，從而啟動家禽對感染的先天免疫反應[21]。將chTLR21的激動劑CpG ODN 2007與基于聚乳酸-乙醇酸(PLGA)的空心劑結合，成功制備了具有強大免疫增強能力的新型佐劑CpG-NP，其在體內和體外試驗均表現(xiàn)出對雞有效而持久的免疫刺激能力，在疫苗開發(fā)中具有廣泛的應用潛力[22]。

4 展望

由沙門氏菌感染引起的疾病不僅給家禽生產造成巨大經(jīng)濟損失，也導致人類食源性疾病。傳統(tǒng)的沙門氏菌病防治方法不能滿足對禽產品安全的需求，隨著分子遺傳育種的開展，選擇抗沙門氏菌的品系進行育種已經(jīng)成為一種趨勢。雞抗沙門氏菌感染不僅與宿主的功能基因有關，還受雞的表觀遺傳修飾、雞腸道微生物菌群、雞不同品種或品系等的影響[23]。chTLRs參與機體抵抗病原體感染的反應，在沙門氏菌感染引發(fā)的機體免疫應答中發(fā)揮重要作用，是一種抗性相關基因，也是遺傳育種研究中的重要候選基因。本文綜述了與沙門氏菌感染相關的chTLRs，不同品種雞chTLRs的多態(tài)性，及其對沙門氏菌的抗性或易感性的影響，可為家禽抗病育種與沙門氏菌病防治提供參考。