量子點在獸醫(yī)領域應用研究進展

李任峰，秦保亮，金前躍，王自良*

(1.河南科技學院動物科技學院，河南新鄉(xiāng) 453003；2.新鄉(xiāng)市動物疫病預防控制中心，河南新鄉(xiāng) 453003；3.河南省農業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室，河南鄭州 450002)

量子點(quantum dots，QDs)是一種半徑小于或接近于激子玻爾半徑的新型納米材料，由少量的原子組成，外觀一般呈球形或類球形，又被稱為納米晶[1]，傳統(tǒng)的量子點材料由Ⅱ-Ⅵ族、Ⅲ-Ⅴ族或Ⅳ-Ⅵ族元素組成，研究較多的主要是CdX(X=S、Se、Te)[2]。目前，量子點的概念已經從最初的半導體納米晶延伸到碳量子點、二維量子點以及鈣鈦礦量子點等。對于量子點的研究最早開始于20世紀80年代，早期主要集中在物理、電子和材料工程領域。1998年美國加州伯克利大學的Alivisatos研究團隊和印地安納大學Nie研究小組同時在《Science》雜志發(fā)文，提出將量子點用于生物標記材料，開創(chuàng)了量子點在生命科學領域研究的先河[3-4]。本文圍繞量子點的特性、種類及其在獸醫(yī)領域的應用研究展開綜述，為拓展對量子點的認識以及將來更好地將其應用于獸醫(yī)領域提供參考。

1 量子點的特性

量子點具有一系列獨特而優(yōu)良的光學特性，包括：①量子點比有機熒光分子穩(wěn)定，不易發(fā)生光漂白；②熒光吸收譜寬，單光子和雙光子均可吸收；③發(fā)射譜窄(通常半峰寬低于40 nm)而對稱，無長波段拖尾現(xiàn)象；④熒光強度大，量子產率高(>20%)，生物相容性好；⑤具有獨特的量子效應和較大的斯托克斯位移；⑥與普通有機染料相比，量子點熒光壽命較長(20 ns～40 ns)，有利于提高檢測結果的對比度和準確性[2,5]。另外，量子點在外界能量激發(fā)的情況下，可發(fā)出與其自身能級相對應的熒光，用一種激發(fā)光源可以同時激發(fā)不同粒徑和組成的量子點。因此，通過合成不同粒徑大小或組分的量子點可獲得從藍色到紅色不同波長的熒光，幾乎可以覆蓋整個可見光范圍，有利于實現(xiàn)對多組分目標分子的實時檢測[6]。

2 量子點的種類

量子點的種類包括半導體量子點、碳量子點、二維量子點和鈣鈦礦量子點等。其中，半導體量子點根據組成元素不同又可分為Ⅱ-Ⅵ族(包括CdS、CdSe、CdTe、ZnO、ZnS、ZnSe、ZnTe等)、Ⅲ-Ⅴ族(包括InN、InP、InAs、InSb、GaN、GaP、GaAs、GaSb等)、Ⅳ-Ⅵ族(包括PbS、PbSe、PbTe等)以及Ⅳ族(Si)。比較成熟的材料是以CdSe為核心的核殼類量子點，具有發(fā)光半峰寬窄(FWHM<30 nm)、量子產率高(>90%)、藍光吸收好、穩(wěn)定性強等特點[7-8]。

碳量子點(C-QDs)是一類由準離散球形碳納米顆粒組成的納米材料，大小在10 nm以下。作為一種新型量子點，C-QDs的發(fā)射光譜通常依賴于量子點大小和激發(fā)光的波長。傳統(tǒng)半導體量子點由于其重金屬含量高而毒性較強，限制了它們在納米醫(yī)學中的應用。C-QDs除了具備類似于傳統(tǒng)量子點的發(fā)光性能和小尺寸特性外，還具有毒性小、成本低、生物相容性好、易修飾等優(yōu)點，成為取代半導體量子點在納米醫(yī)療領域中應用的又一新型材料[9-10]。

在更小的納米尺度下，量子點能以二維晶格形式存在，即二維量子點。組成二維無機化合物家族的成員幾乎涵蓋了整個化學元素周期表，包括石墨烯、硅烯、鍺烯、磷烯、氟石墨烯、氟硅烯、氟鍺烷、石墨烷、硅烷、鍺烷、氮化物(如h-BN、g-C3N4等)、碳化物(如碳化硅)、半金屬硫系化合物、過渡金屬鹵化物，過渡金屬氧化物、錳烯、黏土、氫氧化物、磷酸鹽和三元化合物(如CuSbS2)等[11-12]。近年來，二維石墨烯材料已成為許多領域研究熱點。當石墨烯薄層尺寸小于20 nm時即呈現(xiàn)出激發(fā)光。與大尺度石墨烯相比，納米尺度石墨烯既保留了石墨烯固有的優(yōu)點，又展現(xiàn)出一些新的特性，如具有較大的比表面積、溶解性好、易于組裝和修飾等。石墨烯量子點為石墨烯的研究提供了新的思路，同時也為其他二維量子點的研究指明了方向[13]。

鈣鈦礦量子點是指一系列具有ABX3化學式的化合物所組成的新型發(fā)光材料。其中A為堿金屬陽離子，B為二價金屬陽離子，X為鹵素陰離子。與其它材料相比，鈣鈦礦量子點具有以下優(yōu)勢：(1)發(fā)光效率高，量子產率可達90%；(2)制備成本低，可在常溫溶液中完成；(3)波長可調、發(fā)射光譜窄。通過調控陰離子配比并結合高溫熱注入法，可使其發(fā)光波長覆蓋整個可見光區(qū)域(450 nm～520 nm)。以上特點使得鈣鈦礦量子點特別適合應用于顯示技術領域。目前，鈣鈦礦量子點已成為發(fā)光二極管、太陽能電池、光電探測器以及激光等領域的熱門材料[14]。

3 量子點在獸醫(yī)領域的應用

量子點作為一種新型熒光材料，具有激發(fā)光譜范圍寬、發(fā)射譜窄、發(fā)光效率高、顏色可調等優(yōu)點，目前已被廣泛應用于細胞及組織成像、活體動物體內靶向示蹤、藥物篩選、生物分子(DNA、RNA、葡萄糖等)及病原體檢測等多種生物分析中[6,11,15]。在獸醫(yī)領域，量子點在動物病原體檢測和病毒示蹤方面得到越來越多的研究和應用。

3.1 量子點在病原檢測方面的應用

在生物醫(yī)學領域，研究人員利用量子點獨特的光學和電學特性，通過與抗原、抗體或DNA等生物分子偶聯(lián)作為標記物，建立了多種用于腫瘤和傳染病診斷的生物分析技術[11]。作為新型熒光標記材料，量子點在獸醫(yī)病原檢測方面的應用也越來越受到重視。林彥星等根據非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)VP73蛋白的氨基酸序列推測抗原表位優(yōu)勢區(qū)域，合成表位多肽并與牛血清白蛋白偶聯(lián)，篩選有抗原性的多肽作為試紙條檢測線的包被抗原，采用量子點作為標記材料對葡萄球菌蛋白A(SPA)進行標記，以抗SPA的多克隆抗體作為質控線的包被蛋白，研制了能夠快速檢測ASFV抗體的量子點免疫層析試紙條，該試紙?zhí)禺愋詮?、敏感性高、穩(wěn)定性好、操作簡便，可用于ASFV抗體的快速檢測和流行病學調查，為ASFV的防控提供了重要技術支撐[16]。為建立快速、簡便檢測豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)抗體的方法，江地科等將純化的重組CSFV E2蛋白作為捕捉抗原，分別采用膠體金和量子點(CdSe)標記，將純化的抗CSFV E2蛋白多克隆抗體和HRP兔抗豬IgG包被于硝酸纖維素膜上，分別作為質控線(C線)和檢測線(T線)，研制了膠體金和量子點免疫層析試紙，兩種試紙均具有較好的敏感性和特異性，且量子點試紙的陽性率和符合率均高于膠體金試紙，可用于CSFV的臨床快速檢測[17]。

劉旭輝等采用CdSe量子點標記雞抗禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)抗體，并對標記的抗體量子點復合產物進行了純化。用H5N1型AIV單克隆抗體作為包被抗體，以CdSe量子點標記的雞抗AIV IgG作為檢測抗體，建立了基于納米量子點的AIV快速檢測方法。該方法的敏感性比血凝試驗高出4倍以上，具有較好的特異性和靈敏度，而且操作簡單，檢測快速，在AIV臨床檢測和進出口檢疫方面具有很好的應用前景[18]。Wu等將量子點(CdSe/ZnS QDs)通過酰胺鍵與流感病毒(H5和H9亞型)的單克隆抗體偶聯(lián)作為熒光探針，包被的抗H5和H9亞型流感病毒抗體分別作為檢測線1和檢測線2，包被的羊抗鼠 IgG作為控制線，建立了基于量子點標記抗體的免疫層析試紙，該試紙可同時檢測H5和H9亞型流感病毒，檢測限分別達到0.016 HAU和0.25 HAU。而且該方法操作簡便，可在15 min內完成檢測，具有很好的特異性和敏感性，為流感病毒的早期診斷和監(jiān)測提供了新方法[19]。孫潔等采用熒光量子點標記H5亞型AIV單克隆抗體，建立了基于夾心法原理的免疫層析檢測試紙條。該試紙能夠特異性檢測出H5N1、H5N2等H5亞型AIV，而與H1N1、H3N2、H7N9、H9N2、NDV等無交叉反應，最低檢測量為1 ng/mL，比市售H5亞型AIV膠體金檢測試紙條靈敏度高100倍，為H5亞型禽流感的流行病學調查和快速診斷提供了新的方法[20]。石墨烯氧化物和金納米顆粒作為生物醫(yī)學材料已被廣泛應用于診斷、治療和藥物的輸送等領域。Kim等采用原位還原法將石墨烯氧化物和金納米顆粒制成納米復合材料，通過與PCR試劑混合，建立了一種新的納米PCR檢測技術，可用于口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)的早期感染診斷，相較于傳統(tǒng)PCR的檢測限提高了1 000倍，對于FMD的防控具有重要的臨床應用價值[21]。

3.2 量子點在病原示蹤方面的應用

用量子點標記病毒顆粒，通過單病毒示蹤 “可視化”技術研究病毒對宿主細胞的相互作用，有助于深入探索病毒的侵染機制。在獸醫(yī)領域，量子點已成為病原示蹤研究的熱點材料。豬偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)是危害養(yǎng)豬業(yè)的一種重要病原。Lv等采用量子點標記PRV和病毒示蹤技術研究了PRV的入侵機制，提出了PRV通過巨胞飲作用進入HeLa細胞的感染模型。PRV首先發(fā)生細胞吸附，然后沿著富含肌動蛋白的突起移動到質膜上，并被限制在質膜。隨后，PRV被內化進入含有SNX5陽性巨胞飲體的HeLa細胞中。研究結果證明了巨胞飲是PRV進入HeLa細胞的主要途徑，拓展了人們對于PRV的致病機制的認識，同時也為研制抗PRV藥物提供了新的方向[22]。為了研究豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)的感染機制，Hou等采用無銅催化的點擊化學反應對PEDV進行量子點標記，同時在培養(yǎng)基中添加1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[二苯并環(huán)辛基(聚乙二醇)-2000](DSPE-PEG-DBCO)，病毒在Vero細胞增殖過程中，DSPE-PEG-DBCO吸附在病毒囊膜上，并進一步與量子點(QD-N3)結合，從而形成量子點標記病毒，通過單病毒粒子示蹤研究了PEDV在Vero細胞中的感染動力學[23]，為闡明PEDV的致病機制提供了重要線索。最近，哈爾濱獸醫(yī)研究所的研究人員將量子點與基因編輯技術相結合，通過將生物素化的dCas9、PRV特異性的gRNA和鏈霉親和素修飾的量子點(SA-QDs)轉染進入細胞，采用單病毒示蹤技術系統(tǒng)研究了PRV在Vero細胞和HeLa細胞中入胞、膜融合、胞內運輸、基因組入核等動態(tài)過程，研究結果為深入揭示PRV的致病機制提供了新的參考[24]。

4 展望

量子點在生命科學及醫(yī)學中的應用前景十分廣闊。當前，新冠肺炎疫情仍在全球肆虐，科研人員已開始將量子點應用于新冠肺炎的診斷、藥物開發(fā)、致病機制等方面的研究[25-26]。在獸醫(yī)領域，盡管量子點已經在動物病原檢測及病原示蹤方面得到逐步應用，但由于其合成及成核條件要求苛刻(需要在高溫、絕氧、絕水等條件下成核)，同時存在穩(wěn)定性差、易于聚集、表面難以修飾等不足，使得量子點在獸醫(yī)領域的研究成果仍相對較少，更缺乏較為成熟的研究產品。未來仍需對量子點的合成與標記技術進行改進，尋求調控量子點尺寸、結構、性能和分散度的更好方法，降低標記成本，加強與新興技術(如CRISPR/Cas9、微流控、生物傳感器等)的結合，使其在動物疫病診斷、獸藥研發(fā)以及病原體致病機制研究等方面發(fā)揮更大作用。相信量子點技術的發(fā)展和完善將會給獸醫(yī)領域帶來新的更多的發(fā)展契機。