牦牛乳腺上皮細胞的體外分離培養(yǎng)及鑒定

楊玉瑩，荊海霞，董寶霞，張勤文

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院動物醫(yī)學(xué)系，青海西寧 810016)

牦牛(Bosgrunniens)在我國主要分布于青藏高原及其周邊地區(qū)[1]，可穩(wěn)定適應(yīng)高原以低氧、低壓、高寒為特點的惡劣環(huán)境，具有乳、肉、毛、絨、役等兼用的多種經(jīng)濟用途[2]，不僅對我國牧區(qū)有著極為重要的經(jīng)濟價值，還表現(xiàn)出了特殊的生態(tài)和社會地位，被譽為“高原珍寶”[3]。其中，牦牛乳作為高原特有的一種天然資源，綠色、高品質(zhì)、高營養(yǎng)食品為其優(yōu)勢特點[4]，其豐富的功能性和生物活性成分[5]，可發(fā)揮對機體有重要意義的抗氧化[6]、調(diào)節(jié)腸道微生物菌群[7]、免疫調(diào)節(jié)與抗炎[8]等生理功能，可極大滿足消費者對高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)乳制品的消費需求。

由于放牧環(huán)境、飼養(yǎng)方式、品種特性[9-11]等原因，牦牛泌乳量相對較低[4,12]，這不僅限制了牦牛乳及其制品在消費市場的地位，也在一定程度上造成了優(yōu)質(zhì)資源的浪費，因此對牦牛泌乳相關(guān)因子與其作用機制探究顯得尤為重要。隨著細胞生物學(xué)與分子生物學(xué)的發(fā)展，對乳腺泌乳的研究多為體外條件下、細胞水平上研究激素或基因調(diào)控，并深入探究到信號因子及其轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。目前雖有一系列培養(yǎng)乳腺上皮細胞(mammary epithelial cells,MECs)的技術(shù)體系，但是在物種上及可重復(fù)性上仍然不能滿足需求，尤其對于牦牛這種生活環(huán)境獨特且生長周期穩(wěn)定的大型反芻動物，重復(fù)采集泌乳期乳腺組織并成功進行乳腺上皮細胞的培養(yǎng)與傳代，相對來說，仍然是非常困難的。故建立穩(wěn)定可重復(fù)的牦牛MEC體外分離、培養(yǎng)及鑒定技術(shù)體系對于高原牦牛泌乳相關(guān)問題的進一步研究是非常必要的。

本研究采取胰酶/Ⅰ型膠原酶分段消化法進行牦牛乳腺上皮的分離培養(yǎng)，并對分離培養(yǎng)得到的乳腺上皮細胞進行分子表型及功能鑒定，以期建立穩(wěn)定可重復(fù)的牦牛乳腺上皮細胞培養(yǎng)體系，并為后期實現(xiàn)細胞永生化及研究牦牛乳腺的發(fā)育機制、泌乳機制和泌乳相關(guān)基因表達及其調(diào)控機制研究等提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織樣品來源 青海省海北州祁連縣養(yǎng)殖場成年泌乳期牦牛。

1.1.2 主要試劑 組織保存液(130-100-008)，美天旖生物技術(shù)貿(mào)易(上海)有限公司產(chǎn)品；Ⅰ型膠原酶(C0130)、表皮生長因子(E4127)、氫化可的松(H0135)、DMSO(D2650)，德國Sigma-aldrich公司產(chǎn)品；青霉素-硫酸鏈霉素(PYG0016)、DAPI染液(AR1176)、CCK8(AR1160)、HRP-羊抗兔IgG(BA1054)、鼠抗β-actin單克隆抗體(BM0627)、HRP-羊抗鼠IgG(BA1050)，武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品；DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液(01-172-1ACS)、0.5 g/L胰蛋白酶/EDTA(03-053)、2.5 g/L胰蛋白酶/0.5 g/L EDTA(03-052)，以色列Biological Industries公司產(chǎn)品；胎牛血清(FBS)(1099-141)、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒(41400-045)，美國Gibco公司產(chǎn)品；4 g/L臺盼藍染液(C0040)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(PC0020)、4×蛋白上樣緩沖液(P1016)、凝膠制備試劑盒(P1200)、ECL Plus超敏發(fā)光液試劑盒(PE0010)，北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品；波形蛋白一抗(bs-5833R)、CK18一抗(bs-2043R)、CK14一抗(bs-1792R)、β-酪蛋白一抗(bs-10032R)，北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；熒光二抗試劑盒(P0186)，上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；支原體檢測(DNA熒光染料法)試劑盒(KGY0110)、全蛋白提取試劑盒(KGP250)，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品；脫脂奶粉(232100)，美國BD公司上海有限公司產(chǎn)品；催乳素(Peprotech-100-07)，美國Peprotech公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 Ti熒光倒置顯微鏡，日本Nikon公司產(chǎn)品；超凈工作臺、CO2培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀和-80℃超低溫冰箱，美國Thermo scientific公司產(chǎn)品；低溫超速離心機和PCR儀，德國Eppendorf公司產(chǎn)品；電泳儀，Bio-Rad公司產(chǎn)品；化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)，美國ProteinSample公司產(chǎn)品；核酸蛋白濃度測定儀，德國Implen公司產(chǎn)品；水平核酸電泳系統(tǒng)，北京凱元信瑞儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 乳腺組織采集 于青海大學(xué)動物醫(yī)院內(nèi)采集10 g～20 g牦牛乳腺組織，置于生理鹽水中多次涮洗至液體顏色變淡后，750 mL/L酒精浸泡3 s～5 s，無菌生理鹽水再次涮洗后放入含20 g/L雙抗的組織保存液中，750 mL/L酒精擦拭管口，無菌封口膜封口，于低溫保溫瓶內(nèi)盡快帶回實驗室。

1.2.2 試劑配制 DMEM/F12培養(yǎng)液：150 mL/L～200 mL/L FBS+20 g/L雙抗+基礎(chǔ)培養(yǎng)液；0.5 g/L胰酶/0.2 g/L EDTA、2.5 g/L胰酶/0.5 g/LEDTA均為試劑成品，無需另外處理。

膠原酶Ⅰ溶液：用基礎(chǔ)培養(yǎng)液溶解，使用濃度為1 mg/mL。

氫化可的松溶液：1 mL無水乙醇將其溶解，后加入19 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)液制備濃度為50 μg/mL的儲存原液。

表皮生長因子溶液：500 μL(含100 mL/L FBS)基礎(chǔ)培養(yǎng)液將其制備為0.2 mg/mL的儲存原液。

催乳素溶液：用稀釋液將其制備為500 μg/mL的儲存原液。

誘導(dǎo)貼壁分化培養(yǎng)液：5 μg/mL胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒+1 μg/mL氫化可的松+50 ng/mL表皮生長因子+DMEM/F12培養(yǎng)液。

傳代培養(yǎng)液：1 μg/mL胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒+200 ng/mL氫化可的松+10 ng/mL表皮生長因子+DMEM/F12培養(yǎng)液。

1.2.3 牦牛MECs的分離與原代培養(yǎng) 吸取約0.3 mL含20 g/L雙抗的PBS于一次性60 mm培養(yǎng)皿中，剪取適當(dāng)大小的組織塊，修除雜組織，后將組織塊剪碎至約1 mm3，用含20 g/L雙抗的生理鹽水反復(fù)漂洗3～5遍，直到液體變至無色及液面無漂浮物為止，1 000 r/min，離心5 min以收集組織，加入組織塊6倍體積的2.5 g/L胰蛋白酶/0.5 g/L EDTA，封口后于37℃水浴中消化10 min，每2 min輕輕搖晃離心管，后70 μm細胞篩過濾，濾渣直接收集至離心管中，加入6倍體積的膠原酶Ⅰ(1 mg/mL)，封口后于37℃水浴鍋中消化2 h～3 h，每15 min～25 min輕晃離心管以充分均勻消化，視組織塊被消化的程度和消化液的渾濁度依次用100 μm、70 μm細胞篩過濾，收集濾液并終止消化(視濾渣大小可選擇繼續(xù)消化)，1 000 r/min離心6 min，棄上清，加1 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)液(200 mL/L FBS)重懸細胞，鏡下觀察細胞密度，以保證高密度接種。

1.2.4 牦牛MECs的純化、傳代 待原代細胞鋪至瓶底的70%～80%時，即可利用細胞對胰酶的敏感性及貼壁差異性純化牦牛MECs。棄去舊培養(yǎng)液，用含20 g/L雙抗的冷PBS清洗2～3遍后，加入0.5 mL冷0.5 g/L胰蛋白酶-0.2 g/L EDTA液于細胞表面預(yù)消化10 s，棄去液體，再加1 mL消化1 min，適時輕微搖晃培養(yǎng)瓶，鏡下觀察，待對胰酶敏感的成纖維細胞回縮變圓且有少量懸浮時，立即吸除消化液，加PBS迅速輕微漂洗2遍，后加入1 mL冷2.5 g/L胰蛋白酶-0.5 g/LEDTA消化，鏡下觀察，2 min左右待細胞變型且有微少細胞懸浮后，略略水平晃動培養(yǎng)瓶后終止消化，1 000 r/min離心6 min收集細胞，加入適量傳代培養(yǎng)液重懸并接種，貼壁12 min左右，收集懸液高密度接種，適量補液，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，48 h后換液。待細胞純化完畢后，不再進行差速消化和差速貼壁，直接利用2.5 g/L胰酶/0.5 g/LEDTA進行細胞的傳代，操作同上。

1.2.5 細胞形態(tài)學(xué)觀察 做好細胞的觀察記錄，觀察內(nèi)容包括細胞的貼壁生長狀況、形態(tài)等。

1.2.6 細胞的凍存、復(fù)蘇及活力檢測 細胞凍存：凍存液現(xiàn)用現(xiàn)配(FBS∶DMSO=9∶1)并4℃預(yù)冷。選擇對數(shù)生長期的細胞(步驟同乳腺上皮細胞的傳代)，得到的細胞懸液以1 000 r/min離心6 min，吸盡液體，加入凍存液1 mL進行重懸，盡量無氣泡，移入無菌凍存管，封口膜封口并標(biāo)記，后放入程序降溫盒內(nèi)于-80℃冰箱過夜，次日即轉(zhuǎn)入液氮。

細胞復(fù)蘇：于37℃水浴鍋使其快速完全融化，清理消毒，無菌條件下補充新鮮培養(yǎng)液，1 000 r/min離心6 min，收集細胞，加入1 mL完全培養(yǎng)液小心重懸，后以適當(dāng)密度接種到25 cm2培養(yǎng)瓶，加入3 mL培養(yǎng)液，24 h后更換新鮮培養(yǎng)液。

臺盼藍染色法檢測凍存前后的細胞活力。

1.2.7 細胞生長曲線繪制 取純化3代的牦牛MECs，2.5 g/L胰酶/0.5 g/LEDTA消化并收集、重懸細胞，設(shè)空白孔(僅傳代培養(yǎng)液)和實驗孔(細胞+傳代培養(yǎng)液)，以2×104個/mL細胞密度接種，每孔接種0.1 mL細胞懸液，每隔1 d于96孔培養(yǎng)板內(nèi)加入10 μL CCK8，孵育2.5 h，后于450 nm處測定各孔OD值，減去最大值及最小值后取各組平均值，實驗組與空白組的OD值之差表示細胞活性，與細胞數(shù)量呈線性關(guān)系。連續(xù)計數(shù)至細胞鋪滿孔底，生長曲線以培養(yǎng)時間(D)為橫坐標(biāo)(x軸)，OD值為縱坐標(biāo)(y軸)。

1.2.8 牦牛MECs的細胞免疫熒光鑒定 具體操作參考試劑盒說明書，其中一抗?jié)舛染鶠?∶200，二抗?jié)舛染鶠?∶1000，陰性對照一抗為PBS。

1.2.9 Western blot檢測β-酪蛋白的蛋白表達水平 為探究培養(yǎng)獲得的牦牛MECs是否具有分泌β-酪蛋白的能力，試驗提取了未經(jīng)催乳素(僅傳代培養(yǎng)液)或經(jīng)催乳素(500 ng/mL催乳素+傳代培養(yǎng)液)誘導(dǎo)48 h的細胞總蛋白，并以泌乳期牦牛乳腺組織作為陽性對照，通過Western blot試驗檢測其在蛋白水平上是否表達，其中以β-actin為內(nèi)參，選擇制備120 g/L分離膠及50 g/L濃縮膠，一抗?jié)舛染鶠?∶1 000；二抗?jié)舛染鶠?∶8 000。

1.3.0 支原體檢測 具體操作參考試劑盒說明書。

2 結(jié)果

2.1 初期細胞貼壁生長情況

組合酶消化法所分離獲得的細胞貼壁、增殖及分化速度均較快，第3天細胞貼壁量多，且見部分細胞開始增殖(圖1A)，培養(yǎng)第5天即見大部分貼壁細胞大量增殖并分化(圖1B)，高密度接種的條件下，平均于原代培養(yǎng)的第8天即能鋪至細胞培養(yǎng)瓶底壁面積的85%以上，具有培養(yǎng)周期短、成功率高、最大限度地利用組織樣品等優(yōu)點。對比發(fā)現(xiàn)，于DMEM/F12培養(yǎng)液中添加激素可有效促進細胞貼壁、提高細胞活力及促進細胞增殖，后期傳代時激素的加入可有效維持細胞形態(tài)及功能特征，延長細胞的傳代次數(shù)。

圖1 細胞鏡下觀察結(jié)果(10×)Fig.1 Cell observation by microscope(10×)

2.2 牦牛MECs形態(tài)學(xué)觀察

原代培養(yǎng)細胞未經(jīng)純化時，多見呈扁平、梭狀且輪廓不清的成纖維細胞與形態(tài)均一、排列整齊乳腺上皮細胞的混合生長(圖2A)，經(jīng)多次純化操作后，可得到純度較高牦牛MECs。細胞低密度接種時，大部分于24 h內(nèi)完成貼壁并增殖，未貼壁細胞部分仍有活力，單個細胞剛開始呈“煎蛋樣”貼壁，后隨增殖而呈獨立的島嶼狀(圖2B)，待細胞生長混合時，細胞呈上皮細胞特征，形成單層聚集，似“鵝卵石鋪路樣”，形態(tài)整齊均一，排列生長，活力旺盛，細胞間形成管腔狀結(jié)構(gòu)(圖2C )。牦牛MECs的細胞核呈圓形或者橢圓形，核仁以2個～4個居多，排列緊密，未發(fā)現(xiàn)明顯分泌的乳滴，但具有MECs典型的圓頂樣結(jié)構(gòu)(圖2D)。

細胞前7代形態(tài)比較穩(wěn)定，傳至8代時，部分培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞形態(tài)發(fā)生變化，有的細胞呈長形，梭形，或三角形，并有拉網(wǎng)現(xiàn)象(圖2.2E)，邊緣細胞逐漸變形，培養(yǎng)至12代后，細胞逐漸分化成多種形態(tài)，如大且扁平的圓形細胞、形態(tài)均一的鋪路石樣細胞及狹長不規(guī)則細胞，且隨著培養(yǎng)時間的延長，扁平的圓形及狹長細胞包繞鋪路石樣細胞，并限制其增殖范圍(圖2.2F)。培養(yǎng)12代后，傳代以低密度接種時，細胞生長緩慢并伴隨空泡化、細胞崩解等衰亡跡象，但高密度均勻接種時，細胞活力相對旺盛，且具有繼續(xù)增殖、傳代的潛力。

A.原代培養(yǎng)時成纖維細胞與乳腺上皮細胞混合生長(10×)；B.低密度接種乳腺上皮細胞呈島嶼狀增殖(10×)；C.高密度接種時，乳腺上皮細胞融合呈鋪路石狀(10×)；D.細胞核以2～4個居多(20×)；E.細胞呈拉網(wǎng)狀，腔內(nèi)邊緣排列一層細長形態(tài)的細胞(10×)；F.細胞分化出明顯不同的形態(tài)(10×)A.fibroblasts and mammary epithelial cells in primary culture (10×);B.Low density inoculated mammary epithelial cells show island proliferation (10×);C.During high-density inoculation,the mammary epithelial cells fuse to form a paving stone state (10×);D.Most of the nuclei are 2 to 4 (20×);E.The cells show a tensile network,the edge of the lumen is lined with a thin layer of cells (10×);F.The cells differentiate into significantly different morphologies (10×)圖2 牦牛乳腺上皮細胞形態(tài)觀察結(jié)果Fig.2 Observation results of yak mammary epithelial cells

2.3 細胞凍存與復(fù)蘇

凍存前和復(fù)蘇后細胞活力均保持較高水平(85%以上)，復(fù)蘇后的乳腺上皮細胞形狀規(guī)則，邊緣整齊，短時間內(nèi)即可貼壁分化，生長迅速、活力旺盛，仍保持聚集生長的特性。

2.4 細胞生長曲線繪制

牦牛乳腺上皮細胞在0～3 d、3 d～7 d、7 d后分別經(jīng)歷了生長遲緩期、對數(shù)生長期、平臺期，生長曲線整體為“S”形(圖3)，表明培養(yǎng)的牦牛乳腺上皮細胞具有正常的分裂增殖特性，符合細胞生長的生物學(xué)規(guī)律。

圖3 牦牛乳腺上皮細胞生長曲線Fig.3 Growth curve of yak mammary epithelial cells

2.5 牦牛MECs免疫熒光鑒定

免疫熒光結(jié)果(圖4)表明，在熒光束下，分離純化所得細胞的細胞質(zhì)內(nèi)，角蛋白18呈綠色熒光強陽性表達，另微弱表達β-酪蛋白，說明純化后的細胞為乳腺分泌型上皮細胞；波形蛋白及角蛋白14陰性表達，說明純化后所獲得的細胞不存在成纖維細胞和乳腺肌上皮細胞，即純化得到的牦牛MECs種類單一且具有正常泌乳生理功能。

A～C.角蛋白18(CK18)免疫熒光染色圖(20×)；D～F.β-酪蛋白(CSN2)免疫熒光染色圖(10×)；G～I.波形蛋白(Vimentin)免疫熒光染色圖(10×)；J～L.角蛋白14(CK14)免疫熒光染色圖(10×)；M～O.陰性對照圖(10×)A-C.CK18 immunofluorescence staining (20×);D-F.CSN2 immunofluorescence staining (10×);G-I.Vimentin immunofluorescence staining (10×);J-L.CK14 immunofluorescence staining (10×);M-O.Negative control (10×)圖4 牦牛乳腺上皮細胞特異性標(biāo)記物檢測結(jié)果Fig.4 Detection results of specific markers of yak mammary epithelial cells

2.6 β-酪蛋白的蛋白水平表達檢測

以泌乳期牦牛乳腺組織作為陽性對照，Western blot結(jié)果顯示，在經(jīng)含有3種激素的培養(yǎng)液培養(yǎng)后，細胞在無催乳素刺激時，β-酪蛋白也可表現(xiàn)出在蛋白水平的表達；經(jīng)催乳素刺激可有利于促進β-酪蛋白表達，明確了純化后所培養(yǎng)的細胞是具有泌乳生理功能的牦牛乳腺上皮細胞(圖 5)。

1.無PRL;2.有PRL,3.乳腺組織1.No PRL;2.PRL；3.Breast tissue圖5 牦牛MECs內(nèi)β-酪蛋白的蛋白水平檢測結(jié)果Fig.5 Detection of protein level of MECs β-casein in yak

2.7 牦牛MECs支原體檢測

鏡下可見MECs的細胞核為圓形或橢圓形，于熒光束下發(fā)出藍色熒光，但周圍無絲狀或散在的熒光顆粒小點即支原體的DNA染色斑，說明牦牛乳腺上皮細胞在培養(yǎng)過程中未被支原體污染(圖6)。

圖6 熒光Hoechst 33258染色結(jié)果為陰性(10×)Fig.6 Negative staining result of fluorescent dye Hoechst 33258 (10×)

3 討論

目前，培養(yǎng)乳腺上皮細胞的常用方法可分為組織塊貼壁法和酶消化法，其中組織塊貼壁法作為經(jīng)典的原代細胞培養(yǎng)方法，一直以來在細胞體外分離培養(yǎng)中占有主要地位，亦在不斷改進中[13-15]，但相對于酶消化法，其優(yōu)勢尚不突出。在實際操作時，存在組織塊干涸時間不好把握、培養(yǎng)周期長、遷出成功率較低等問題，本試驗應(yīng)用2.5 g/L胰酶/0.5 g/L EDTA組合Ⅰ型膠原酶分段消化發(fā)現(xiàn)，該方法所獲得的細胞數(shù)量較多、活力較強、培養(yǎng)時間較短，細胞于原代培養(yǎng)第7天至第8天即可實現(xiàn)細胞的純化傳代，且操作具有可重復(fù)性，成功率較高，說明該操作程序具有可應(yīng)用性。

組合酶消化所獲得細胞大多為包含成纖維細胞和乳腺上皮細胞的異質(zhì)細胞群，為保證目的細胞的存活與增殖，必須進行細胞的純化。細胞的純化方法主要有差速貼壁法、胰酶消化法和細胞刮刀法[16]，因成纖維細胞對胰酶比較敏感，且貼壁速度更快[17]，故可先通過低濃度即0.5 g/L胰酶(含0.2 g/LEDTA)預(yù)先消化掉大部分成纖維細胞，2.5 g/L胰酶(含0.5 g/L EDTA)則進行乳腺上皮細胞的消化分散，后將細胞懸液預(yù)接種，即于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)10 min～15 min，見大部分成纖維細胞貼壁后，再將細胞懸液重接種，后期培養(yǎng)可發(fā)現(xiàn)MECs逐漸成為優(yōu)勢細胞群，視情況進行2～3次純化，即可去除成纖維細胞。

細胞骨架包括微管、微絲和中間纖維，中間纖維家族中包含波形蛋白、角蛋白(CKs)等許多成員。其中間質(zhì)細胞內(nèi)主要的中間纖維是波形蛋白，如存在于成纖維細胞、內(nèi)皮細胞和白細胞等；CK14和CK18則可分別作為乳腺肌上皮細胞和上皮細胞的分子標(biāo)記物[18-20]；除乳脂外，乳蛋白是判斷乳腺特征的另一個基本指標(biāo)，β-酪蛋白的表達已被用作MECs分化的重要標(biāo)志[21]，通常用來評估MECs的分泌功能。本試驗通過細胞免疫熒光對純化后的細胞進行分子表型鑒定，結(jié)果顯示，細胞的細胞質(zhì)中陽性表達CK18，而不表達波形蛋白和CK14，在氫化可的松、表皮生長因子、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒和催乳素作用下，均可檢測到β-酪蛋白在蛋白水平的表達，綜合說明純化所得的細胞為為分泌型MECs，具有一定的泌乳能力且純度較高。

體外培養(yǎng)時，添加一定的促細胞分裂劑可顯著加快MECs原代培養(yǎng)的DNA合成，從而促進細胞的增殖[21]。表皮生長因子和胰島素樣生長因子能推進細胞周期進程，促使細胞由G1期進入S期，進而促進細胞分裂并刺激細胞的生長，轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒鈉可減緩細胞的衰退與老化，在僅添加這3種因子時，奶山羊MECs可傳至30代且活力旺盛并具有乳蛋白分泌能力[22]；體外培養(yǎng)細胞的貼壁和正常生長離不開氫化可的松的作用[23]。本試驗在牦牛MECs分離后貼壁培養(yǎng)時添加胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒、氫化可的松和表皮生長因子發(fā)現(xiàn)可極大提高細胞的貼壁數(shù)量，促進MECs的增殖分化，在傳代培養(yǎng)過程中，降低三者的作用濃度，在保持β-酪蛋白在蛋白水平表達的同時，可有效維持細胞活力，增加牦牛MECs原代細胞的傳代次數(shù)。

采用2.5 g/L胰酶/0.5 g/L EDTA結(jié)合Ⅰ型膠原酶消化方法成功分離培養(yǎng)了具有一定泌乳生理功能的牦牛乳腺上皮細胞，可為后期基于牦牛乳腺細胞水平上的相關(guān)試驗提供一定的參考。