查干湖鰱源豚鼠氣單胞菌分離鑒定及生物學(xué)特性研究

劉長宇，田佳鑫，張 洋，徐雪彬，錢愛東，單曉楓*，劉艷輝

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130118；2.吉林省水產(chǎn)科學(xué)研究院，吉林長春 130033)

豚鼠氣單胞菌(Aeromonascaviae)屬于弧菌科氣單胞菌屬，是一種革蘭氏陰性短桿菌[1]。該菌是魚-人-家畜共患菌，除了感染魚類外，能夠致使蝦類、蟹類產(chǎn)生細(xì)菌敗血癥或出血病；還能引起人類敗血病和急性胃腸炎[2-3]。近幾年來我國水產(chǎn)業(yè)由該菌引發(fā)的病例日趨增多，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。查干湖位于北緯45°，東經(jīng)124°。其地形平坦、水源充足，位于內(nèi)蒙古自治區(qū)、黑龍江省和吉林省的交界地帶，近年關(guān)于查干湖漁類細(xì)菌性疾病流行情況報道較少，且水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物的氣單胞菌疾病主要集中于維氏氣單胞菌(Aeromonasveronii)和嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)，關(guān)于豚鼠氣單胞菌的防治與大多細(xì)菌性疾病一樣都采用抗生素以及部分強氧化劑，由于養(yǎng)殖戶不按照養(yǎng)殖規(guī)定濫用抗生素導(dǎo)致多重耐藥菌株的產(chǎn)生，同時也污染水質(zhì)，威脅公共衛(wèi)生安全。本研究從查干湖患病鰱魚體內(nèi)分離出1株優(yōu)勢菌，對其進(jìn)行革蘭氏染色、生理生化試驗、16S rDNA和管家基因序列分析、毒力基因檢測等，以期為鰱細(xì)菌性疾病的鑒別診斷和感染防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用動物和菌株 患病鰱來自查干湖，病鰱體重450 g左右，主要臨床癥狀為體表有出血點，剖檢發(fā)現(xiàn)肝胰臟糜爛，脾臟出血，腸道有出血壞死；健康鰱購自吉林省某大型養(yǎng)殖場，平均體重100 g±3.9 g；斑馬魚購自吉林省長春市某批發(fā)市場；將健康鰱和斑馬魚分別在水箱中飼養(yǎng)14 d待用，溫度為25℃；對照菌株A.caviaeATCC 154768保存于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院實驗室。

1.1.2 主要試劑 細(xì)菌生化鑒定試劑條，青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；藥敏紙片，杭州微生物試劑有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒，寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品；RS瓊脂平板培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；LB固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、PBS緩沖液等為吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實驗室配制。

1.1.3 主要儀器 PCR儀，Applied Biosystems公司產(chǎn)品；恒溫?fù)u床，CRYSTAL公司產(chǎn)品；高速離心機低溫型，Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分離與純化 選取發(fā)病鰱，無菌采集肝臟、脾臟和腎臟組織的橫切面，劃線于RS瓊脂平板培養(yǎng)基,37℃恒溫培養(yǎng)12 h～24 h后觀察細(xì)菌生長狀況；選取形態(tài)大小一致的優(yōu)勢菌落，進(jìn)行菌落的純化后獲得純培養(yǎng)菌株，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細(xì)菌形態(tài)觀察及生理生化鑒定 將純化的病原菌進(jìn)行革蘭氏染色，在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)特征；將分離純化的菌株接種于哥倫比亞綿羊血瓊脂培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)20 h～24 h，觀察分離菌株的溶血現(xiàn)象。并挑取單個菌落進(jìn)行微量生化管試驗,37℃培養(yǎng)12 h～24 h觀察,參照文獻(xiàn)[5-6]中菌株的生化特征，對分離菌株的分類地位進(jìn)行初步判斷。

1.2.3 16S rDNA和管家基因的序列分析 取對數(shù)生長期的菌液，離心取下層菌液，按照DNA提取試劑盒說明書提取細(xì)菌DNA。用細(xì)菌16S rDNA通用引物和gyrb、cpn60分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物信息見表1，引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收純化，測序由吉林省庫美生物科技有限公司完成?；蛐蛄型ㄟ^NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列相似性比較，用Mega4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹并進(jìn)行分析。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequence information

1.2.4 毒力基因檢測 參照文獻(xiàn)[5]方法并有所改進(jìn),分別合成7種毒力基因的特異性引物，即細(xì)胞毒性腸毒素(act)、黏附素(aha)、核酸酶(exu)、氣溶素(aer)、密度感應(yīng)系統(tǒng)調(diào)控基因(luxs)、脂肪酶(lip)、絲氨酸蛋白酶(ser)(表1)。

1.2.5 生長曲線測定 將具有致病性的分離菌株與相對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)菌株分別傳代于LB液體培養(yǎng)基，30℃搖床過夜培養(yǎng)，用無菌生理鹽水稀釋至1×107CFU/mL；然后按照1%接種至LB液體培養(yǎng)基，放置于30℃搖床培養(yǎng)24 h，期間每隔1 h測定菌液OD600nm值。試驗重復(fù)3次,取平均值。以時間為橫坐標(biāo),OD600nm值為縱坐標(biāo),繪制出生長曲線。

1.2.6 人工感染試驗 對文獻(xiàn)[9]方法有所改進(jìn)，將培養(yǎng)于LB液體培養(yǎng)基中的病原菌的菌液進(jìn)行細(xì)菌平板計數(shù)，計算出初始菌液濃度，并將原菌液于離心機12 000 r/min離心2 min，并用PBS洗滌，重復(fù)洗滌3次。將洗滌后的菌液分別稀釋成濃度為1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101CFU/mL，共8組攻毒濃度，每組10尾斑馬魚和10尾鰱魚，0.2 mL/尾，腹腔注射各組的菌液濃度，并一同連續(xù)觀察1周，記錄試驗組和對照組的發(fā)病魚數(shù)及死亡魚數(shù)，根據(jù)改良寇氏法計算出細(xì)菌的半數(shù)致死量。

1.2.7 藥敏試驗 采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行菌株耐藥性分析[4]，即將菌株接種在LB液體培養(yǎng)基中，30℃搖床培養(yǎng)20 h，向菌懸液中加入無菌生理鹽水稀釋至OD=0.5，取100 μL的菌懸液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上；然后選擇慶大霉素、新霉素、多西環(huán)素、四環(huán)素、氧氟沙星等30種抗菌素藥敏紙片分別貼于培養(yǎng)基上；30℃培養(yǎng)24 h后取出平板，記錄每個菌株藥敏抑菌圈直徑。判定標(biāo)準(zhǔn)參考杭州天和微生物試劑有限公司《藥敏試驗紙片法的抑菌范圍解釋標(biāo)準(zhǔn)》。

2 結(jié)果

2.1 病原菌純化及形態(tài)特征

從病魚體內(nèi)分離出1株優(yōu)勢菌株，接種于RS培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)24 h。可形成圓形，表面濕潤，邊緣整齊中間突起的黃綠色菌落(圖1)；分離菌能夠在血平板上形成溶血環(huán)(圖2)。

圖1 分離菌形態(tài)Fig.1 Isolated bacterial morphology

圖2 α-溶血環(huán)Fig.2 α-hemolytic ring

2.2 病原菌革蘭氏染色及生理生化特征

該病原菌經(jīng)革蘭氏染色為陰性，細(xì)菌形態(tài)為短桿狀；結(jié)合細(xì)菌形態(tài)和生理生化結(jié)果可初步判斷分離菌為豚鼠氣單胞菌，命名為AC-CY(表2)。

表2 分離株和標(biāo)準(zhǔn)株理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of isolated and standard strains

2.3 16S rDNA和管家基因的序列分析結(jié)果

分別用細(xì)菌16S rDNA和gyrb、cpn6對AC-CY基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳見圖3A。PCR擴(kuò)增得到片段大小為1 408 bp，經(jīng)過NCBI數(shù)據(jù)庫 Blast后并建立系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(圖4)，結(jié)果AC-CY與A.caviae同源性為99%。cpn60和gyrbPCR瓊脂糖電泳見圖3B。gyrb和cpn60進(jìn)化樹結(jié)果見圖5、圖6，與16S rDNA進(jìn)化樹結(jié)果相似，cpn60和gyrb結(jié)果表明AC-CY與A.caviae聚類，其隸屬于A.caviae。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000；1～2.16S rDNA PCR結(jié)果；3.gyrb PCR結(jié)果；4.cpn 60 PCR結(jié)果M.DNA Marker DL 2 000；1-2.PCR results of 16S rDNA；3.gyrb PCR results;4.cpn 60 PCR results圖3 病原菌16S rDNA和管家基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR results of 16S rDNA and house-keeping genes

圖4 AC-CY 16S rDNA基因序列與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 AC-CY 16S rDNA gene sequence and phylogenetic tree of related strains

圖5 AC-CY gyrb基因序列與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 AC-CY gyrb 60 gene sequence and phylogenetic tree of related strains

圖6 AC-CY cpn 60基因序列與相關(guān)菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 AC-CY cpn 60 gene sequence and phylogenetic tree of related strains

2.4 毒力基因檢測結(jié)果

通過PCR方法檢測分離菌株AC-CY攜帶毒力基因(圖7)。7種毒力基因PCR條帶清晰且單一，大小與預(yù)期相符合。證明AC-CY攜帶7種毒力基因，分別為aer、lip、act、ser、aha、exu和luxs。

M.DNA Marker DL 2 000 ；1.aer；2.lip；3.act；4.ser；5.aha；6.exu；7.luxs

2.5 生長曲線測定結(jié)果

檢測AC-CY與A.caviaeATCC15468菌株生長情況(圖8)。分離株AC-CY與對照株ATCC 15468的生長曲線無顯著差異，3 h～5 h期間為對數(shù)生長期，之后生長速度放慢，在13 h后達(dá)到平臺期。

圖8 分離菌與對照株生長曲線Fig.8 Growth curves of pathogenic bacteria and control strain

2.6 人工感染試驗結(jié)果

對斑馬魚和鰱魚腹腔進(jìn)行梯度攻毒，連續(xù)觀察 1 周，記錄各組魚體死亡數(shù)(表3和表4)。根據(jù)改良寇氏法計算出AC-CY感染斑馬魚和鰱魚的半數(shù)致死量分別為 2.51×102CFU和2×104CFU，說明該菌的毒力較強。

表3 豚鼠氣單胞菌AC-CY感染斑馬魚半數(shù)致死量測定Table 3 Determination of median lethal dose of zebrafish infected with Aeromonas caviae AC-CY

表4 豚鼠氣單胞菌AC-CY感染鰱魚半數(shù)致死量測定Table 4 Determination of median lethal dose of silver carp infected with Aeromonas caviae AC-CY

2.7 藥敏試驗結(jié)果

采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行分離菌株AC-CY耐藥性分析，并記錄藥敏抑菌圈直徑。參考杭州天和微生物試劑有限公司《藥敏試驗紙片法的抑菌范圍解釋標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行判定(表3)。結(jié)果顯示，分離菌株AC-CY對哌拉西林、多西環(huán)素、頭孢哌酮、丁胺卡那、四環(huán)素、卡那霉素、呋喃唑酮、慶大霉素、新霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星、氯霉素高度敏感；對復(fù)方新諾明、頭孢曲松、頭孢呋辛、多粘菌素B、紅霉素中度敏感；對青霉素、苯唑西林、氨芐西林、羧芐西林、頭孢氨芐、米諾環(huán)素、頭孢他啶、克林霉素、麥迪霉素、萬古霉素、頭孢拉定、頭孢唑啉耐藥。

表5 分離菌株藥物敏感性試驗結(jié)果Table 5 Antimicrobials sensitivity of the isolated bacteria

3 討論

Aeromonascaviae作為水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)發(fā)病嚴(yán)重的病原菌，典型的人-獸-水生生物致病菌，近些年關(guān)于其流行情況成上升趨勢，對多種水生經(jīng)濟(jì)動物致病力強，造成嚴(yán)重過的經(jīng)濟(jì)損失。研究發(fā)現(xiàn)，草魚源A.caviae具有較強的致病力[3]，在南美白對蝦中分離得到1株高致病性的A.caviae,對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展造成影響[2]。本研究從查干湖患病鰱體內(nèi)分離出1株優(yōu)勢病原菌，用細(xì)菌常用鑒定方法，對其菌落形態(tài)、革蘭氏染色以及生理生化鑒定發(fā)現(xiàn)其菌落成半透明圓形菌落，在RS平板中呈黃綠色菌落，革蘭氏陰性短桿菌，生理生化初步鑒定結(jié)果表明其隸屬于氣單胞菌屬。用血瓊脂平板對其溶血活性進(jìn)行檢測，表明其具有α-溶血活性，維氏氣單胞菌具有溶血活性同時其具備較強的致病性[6]。為更準(zhǔn)確地鑒定分離株AC-CY，用16S rDNA對分離株AC-CY進(jìn)行PCR并測序，用NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast后建立系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，對其聚類進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)AC-CY與A.caviae聚類且相似度達(dá)99%。隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)的發(fā)展，16S rDNA的保守程度的缺陷也日漸暴露，國內(nèi)外學(xué)者通過對全基因組比對發(fā)現(xiàn)更多保守的序列，其中管家基因gyrb和cpn60保守程度更高，所以本試驗用相對保守性高且攜帶一定變異率的管家基因序列進(jìn)行分析,用RNA聚合酶基因gyrb和cpn60進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。gyrb即為促旋酶B亞單位,1.2 kb～1.4 kb,其在DNA的合成、超螺旋結(jié)構(gòu)的維持中作用極大。由于gyrb基因變化十分緩慢,每百萬年堿基替換速率僅為0.7%～0.8%,在以核苷酸序列為基礎(chǔ)的細(xì)菌分類及鑒別研究中可作為靶分子,能更有效地用來標(biāo)記生物的進(jìn)化距離,從而區(qū)分親緣關(guān)系較近的種類[7]。研究表明，在氣單胞菌屬菌株的鑒定中，cpn60(Hsp60或GroEL)是編碼細(xì)菌和部分古菌的一個高度保守蛋白的基因,它比16S rDNA更具有保守性，可應(yīng)用于氣單胞菌屬鑒定[8]。同時應(yīng)用3種基因鑒定從而彌補非蛋白編碼16S rDNA基因鑒定細(xì)菌的缺陷。因此，本研究在16S rDNA的基礎(chǔ)上，對AC-CY的管家基因gyrb和cpn60進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序，建立進(jìn)化樹后發(fā)現(xiàn)結(jié)果與16S rDNA結(jié)果相似，AC-CY與A.caviae聚類，進(jìn)一步證明其為A.caviae，同時也說明16S rDNA在A.caviae的鑒定中具有較高的保守性。

為進(jìn)一步探究其致病力，用斑馬魚以及鰱檢測其半數(shù)致死量時，結(jié)果分別為2.51×102CFU和2×104CFU，證明其具有較強致病性[8]。結(jié)合氣單胞菌常見7種毒力基因進(jìn)行PCR，結(jié)果表明其具有aer、lip、act、ser、aha、exu和luxs7種毒力基因。aer是氣單胞菌最常見的毒力基因，生物學(xué)功能為細(xì)胞毒性、溶血性和腸毒素毒性,可在宿主體內(nèi)破壞宿主細(xì)胞的細(xì)胞膜，從而使宿主細(xì)胞死亡 。而ser、lip、aha毒力基因在氣單胞菌黏附和整合的過程中發(fā)揮極大的作用。luxs毒力基因可能促進(jìn)細(xì)菌生物膜的形成，進(jìn)一步加強細(xì)菌的感染能力[4]。攜帶毒力基因的數(shù)量與致病性存在正相關(guān)性，但毒力基因之間的互作關(guān)系以及氣單胞菌的致病機制還有待深入探究[9]。為檢測AC-CY的耐藥性，采用紙片擴(kuò)散(KB)法進(jìn)行分離菌株耐藥性分析，結(jié)果顯示AC-CY對哌拉西林、多西環(huán)素、頭孢哌酮、丁胺卡那、四環(huán)素、卡那霉素、慶大霉素、新霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、環(huán)丙沙星高度敏感；對復(fù)方新諾明、頭孢曲松、頭孢呋辛、多黏菌素B、紅霉素中度敏感；對青霉素、苯唑西林、氨芐西林、羧芐西林、頭孢氨芐、米諾環(huán)素、頭孢他啶、克林霉素、麥迪霉素、萬古霉素、頭孢拉定、頭孢唑啉耐藥,AC-CY為多重耐藥菌株。抗菌藥物使用應(yīng)當(dāng)合法合規(guī)[10]，從選擇種類和用藥劑量都要有理論根據(jù)，避免藥物殘留，避免盲目用藥。

本研究通過對查干湖發(fā)病鰱進(jìn)行分離病原菌得到1株具有強致病性的AC-CY菌株，其隸屬于氣單胞菌科、氣單胞菌屬，為A.caviae。A.caviae的報道較少，本菌株AC-CY攜帶7種毒力基因并具有較強的致病性，同時還存在多重耐藥性，對水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)具有潛在的威脅。