新城疫病毒Anhinga株HN基因的克隆與生物信息學(xué)分析

何金嬌，毛雪飛，仇書興，李 瑞，李 鵬，董春秀，劉洋洋，欒 淼，吳云舟*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030；2.新鄉(xiāng)學(xué)院生命科學(xué)與基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453003)

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)是一種有囊膜的單股負(fù)鏈RNA病毒，屬副黏病毒科[1]。根據(jù)不同病毒株對雞致病力的強(qiáng)弱，可將NDV分為緩發(fā)型(弱毒株)、中發(fā)型(中等毒力株)和速發(fā)型(強(qiáng)毒株)，其中速發(fā)型的毒株能夠在禽類之間產(chǎn)生較高的病死率，主要表現(xiàn)癥狀為神經(jīng)紊亂、發(fā)熱、呼吸不通暢等[2]。

新城疫病毒基因組主要編碼6種蛋白，其中HN蛋白是位于病毒囊膜表面呈突起狀的跨膜糖蛋白，是一種多功能纖突Ⅱ型糖蛋白，具有血凝素活性(hemagglutinin activity，HA)，能夠使NDV識別宿主細(xì)胞唾液酸受體并與受體細(xì)胞相融合；還具有神經(jīng)氨酸酶活性(neuraminidase activity，NA)，可以水解唾液酸受體，防止病毒與受體細(xì)胞凝聚簇集，便于子代NDV進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)，提高NDV活性[3-4]。此外，通過NDV與宿主細(xì)胞膜融合機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，NDV HN蛋白在具有HA和NA活性的同時(shí)，還具有與同樣位于NDV囊膜的融合蛋白(F)相互作用的活性，一起介導(dǎo)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞，用HN蛋白的HA活性使NDV識別宿主細(xì)胞表面的神經(jīng)氨酸受體引發(fā)受體細(xì)胞感染[5-6]。HN蛋白對NDV的毒力、復(fù)制能力和組織嗜性上有著重要的影響[7-8]。

暴露于病毒表面的HN蛋白是病毒識別并入侵宿主細(xì)胞的關(guān)鍵性受體，也是疫苗開發(fā)的重點(diǎn)研究對象。已有研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)氨酸酶同樣存在于惡性腫瘤細(xì)胞表面，HN蛋白所擁有的神經(jīng)氨酸酶活性能夠使NDV感染腫瘤細(xì)胞，誘導(dǎo)宿主激活自身免疫系統(tǒng)從而達(dá)到治療癌癥的效果[9-10]。NDV還能夠在缺氧腫瘤組織中破壞對某些類型的化學(xué)療法具有抗性的癌細(xì)胞以及具有凋亡抗性的腫瘤細(xì)胞，是一種具有潛力的治療癌癥的佐劑[11-13]。用生物信息學(xué)方法對新城疫病毒Anh株HN蛋白的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行分析，可以對與腫瘤細(xì)胞表面神經(jīng)氨酸酶位點(diǎn)特異性結(jié)合的新城疫病毒HN蛋白類疫苗研究提供參考，為深入探究不同病毒株來源的HN蛋白與NDV感染和抗腫瘤活性之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株 新城疫病毒中等毒力Anh株由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物技術(shù)研究中心實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑 Trizol reagent，美國Invitrogen公司產(chǎn)品；SMART MMLV Reverse Transcritptase、pMD-18T載體、TaqDNA聚合酶、10×PCR buffer、dNTP溶液、限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和HindⅢ，大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小量提取試劑盒和膠回收純化試劑盒，TAKARA公司和北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 Veriti梯度PCR儀，美國ABI公司產(chǎn)品；核酸電泳系統(tǒng)和凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；低溫高速離心機(jī)，美國Theremo Fisher公司產(chǎn)品。

1.1.4 引物 根據(jù)已知的新城疫病毒Anh株HN基因序列(登錄號：AY562986.1)，應(yīng)用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，上游引物序列為：F:5′-CTCGAGATGGATCATGTAGTCAGCAG-3′(下劃線序列為XhoⅠ酶切位點(diǎn))；下游引物序列為：R:5′-AAGCTTTTAAACCCTGTCTTCCTTGA-3′(下劃線序列為HindⅢ酶切位點(diǎn))，引物序列由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 新城疫病毒Anh毒株HN基因的擴(kuò)增 采用TRIzol法提取病毒總RNA，按試劑盒說明書操作，將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，利用上游引物和下游引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，預(yù)期擴(kuò)增目的片段約為1 800 bp。反應(yīng)體系10 μL：模板1 μL，上、下游引物各1 μL，dNTP 1 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL，10×PCR buffer 1 μL，ddH2O補(bǔ)至10 μL。反應(yīng)程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸5 min。反應(yīng)完成后，取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，然后用膠回收試劑盒將目標(biāo)條帶切割純化。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建、鑒定及測序 膠回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物后，與pMD18-T載體連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，隨后將轉(zhuǎn)化細(xì)胞接種至含Amp的LB固體培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)，次日挑選LB固體培養(yǎng)基中單個(gè)白色菌落接種至10 mL加有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，置于37℃搖床上振蕩培養(yǎng)過夜，進(jìn)行菌液PCR鑒定，質(zhì)粒抽提后進(jìn)行雙酶切鑒定。將上述鑒定為陽性的質(zhì)粒送上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.3 Anh株HN蛋白的序列獲取 從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中下載HN基因核苷酸序列及其編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列。

1.2.4 Anh株HN蛋白基本性質(zhì)的預(yù)測 用ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測HN蛋白的基本理化性質(zhì)；用ProtScale(https://web.expasy.org/protscale/)預(yù)測HN蛋白的親疏水性；用TMHMM Server.v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)數(shù)據(jù)庫預(yù)測HN蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)；用SignaIP 5.0(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)預(yù)測HN蛋白的信號肽；用NetNGlyc 1.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)預(yù)測HN蛋白的糖基化修飾位點(diǎn)；用Net Phos 3.1 server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預(yù)測HN蛋白的磷酸化位點(diǎn)；用DNAstar及IEDB(http://www.iedb.org/)預(yù)測HN蛋白的細(xì)胞表位抗原位點(diǎn)。以上預(yù)測所用序列均為生物公司測序的結(jié)果。

1.2.5 空間結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域分析 用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr)預(yù)測HN蛋白的二級結(jié)構(gòu)；使用Phyre 2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)預(yù)測HN蛋白的三級結(jié)構(gòu)；通過SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)構(gòu)建HN蛋白的四級結(jié)構(gòu)模型，在數(shù)據(jù)庫CDD中(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)獲取HN蛋白的結(jié)構(gòu)域。以上預(yù)測所用序列皆是生物公司測序的結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 Anh毒株HN基因的RT-PCR擴(kuò)增

以提取的毒株總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，采用上、下游引物對Anh毒株HN基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在1 800 bp左右出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期條帶大小相符(圖1)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000；1.Anh株HN基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M.DNA Marker DL 5 000；1.PCR products of HN gene of Anh strain圖1 Anh株HN基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of HN gene of Anh strain

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定及測序

將膠回收后的PCR片段，克隆至T載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒。分別用相應(yīng)的上游引物和下游引物對重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，鑒定結(jié)果與預(yù)期條帶大小相符(圖2)。然后，將PCR鑒定為陽性的重組質(zhì)粒分別經(jīng)XhoⅠ和HindⅢ雙酶切，酶切結(jié)果與預(yù)期相符(圖3)。將上述鑒定正確的陽性重組質(zhì)粒送到上海英駿生物技術(shù)有限公司測序，并通過DNAman軟件比對分析后，與NCBI上Anh株HN基因核苷酸序列的同源性為99.77%。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000；1.重組質(zhì)粒；2.重組質(zhì)粒的PCR鑒定M.DNA Marker DL 5 000；1.Recombinant plasmid；2.PCR identification of recombinant plasmid圖2 重組質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.2 PCR identification of recombinant plasmid

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 5 000；1.重組質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ和XhoⅠ雙酶切M.DNA Marker DL 5 000；1.Recombinant plasmid digested by HindⅢ and XhoⅠ圖3 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.3 Identification of recombinant plasmid by double enzyme digestion

2.3 HN蛋白的結(jié)構(gòu)與功能預(yù)測

2.3.1HN基因的核苷酸序列及其編碼蛋白的氨基酸序列 Anh株HN基因序列號為：EF065682.1；GI：118181197。氨基酸序列登錄號為：ABK63994.1。

2.3.2 HN蛋白理化性質(zhì)分析 用ExPASy ProtParam對新城疫病毒Anh株HN蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測分析。結(jié)果顯示，其HN蛋白的分子式為C2786H4380N760O851S24；由571個(gè)氨基酸組成，其中Ser較多，占10.2%；Trp占0.5%含量最少；相對分子質(zhì)量為62 907.45 u；理論P(yáng)I=7.19；若HN蛋白中Cys殘基均形成胱氨酸時(shí)，在280nm處1 g/L溶液中的消光系數(shù)為0.937，若HN蛋白中所有Cys殘基均以殘基形式存在，在280nm處1 g/L溶液中的消光系數(shù)為0.925；脂肪系數(shù)預(yù)測值為86.15；不穩(wěn)定系數(shù)為32.38，小于閾值，說明HN蛋白穩(wěn)定性較高。

2.3.3 HN蛋白親疏水性分析 用ExPASy ProtScale在線軟件Hphob./Kyte &Doolittle模式對HN蛋白的氨基酸序列進(jìn)行疏水和親水性分析。預(yù)測結(jié)果顯示HN蛋白最高疏水性分值點(diǎn)是41位的Val，分值為2.822，最高親水性分值點(diǎn)是15位的Arg，分值為-3.067。序列中所有氨基酸得分平均值為-0.104 16，預(yù)測為親水性蛋白(圖4)。

圖4 Anh株HN蛋白疏水性分析Fig.4 Hydrophobicity analysis of HN protein of Anh strain

2.3.4 HN蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽

2.3.4.1 HN蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域分析 用TMHMM server 2.0軟件HN蛋白的跨膜區(qū)預(yù)測，結(jié)果顯示(圖5A)，HN蛋白的跨膜螺旋數(shù)(Number of predicted TMHs)為1，跨膜螺旋區(qū)氨基酸數(shù)(Exp number of AAs in TMHs)為22.73903，大于18，很可能為跨膜蛋白；且HN蛋白的N端在病毒膜內(nèi)的概率為99.886%，HN蛋白aa 1-22位于病毒膜內(nèi)，aa 23-45構(gòu)成一個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)區(qū),而HN蛋白aa 46-571位于病毒表面。結(jié)果表明，HN蛋白屬于一次跨膜結(jié)構(gòu)蛋白，可初步推測，位于病毒膜表面的氨基酸序列可能與其毒性相關(guān)。

2.3.4.2 HN蛋白的信號肽預(yù)測 用SignaIP 5.0在線軟件對Anh株HN蛋白信號肽的有無進(jìn)行預(yù)測。預(yù)測結(jié)果顯示，Anh株HN蛋白不存在信號肽(圖5B)。

2.3.5 HN蛋白翻譯后修飾位點(diǎn)預(yù)測分析

2.3.5.1 HN蛋白的糖基化修飾分析 Asn在Asn-Xaa-Ser/Thr片段中會(huì)發(fā)生糖基化，其中Xaa是不包括脯氨酸的任何氨基酸，通過NetNGlyc 1.0 Server在線軟件對HN蛋白的N-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測。結(jié)果顯示，Anh毒株HN蛋白有4個(gè)Asn是潛在N-糖基化位點(diǎn)，分別在aa 119、341、433、481(圖6A)。

2.3.5.2 HN蛋白磷酸化位點(diǎn)的分析 利用Net Phos 3.1 server在線預(yù)測HN蛋白的磷酸化位點(diǎn)。結(jié)果顯示，Anh毒株HN蛋白具有較多磷酸化位點(diǎn)且未過閾值的位點(diǎn)磷酸化傾向也很高，說明該蛋白整體磷酸化傾向較高(圖6B)，而蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化幾乎參與所有的生命活動(dòng)。因此根據(jù)其磷酸化程度可推測HN蛋白與Anh株病毒感染機(jī)制高度相關(guān)，在Anh株病毒感染宿主時(shí)發(fā)揮重要作用。

A.HN蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域分析；B.HN蛋白的信號肽分析；SP (Sec/SPI)代表出現(xiàn)信號肽類型的概率,CS代表切割位點(diǎn)出現(xiàn)的概率,OTHER代表不包含任何信號肽的概率A.Transmembrane domain analysis of HN protein;B.Signal peptide analysis of HN protein；SP (Sec/SPI)represents the probability of occurrence of signal type,CS represents the probability of occurrence of cleavage site,and other represents the probability of no signal peptide圖5 HN蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域和信號肽分析Fig.5 Transmembrane domain and signal peptide analysis of HN protein

A.HN蛋白的糖基化修飾預(yù)測；B.HN蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測A.Prediction of glycosylation modification of HN protein;B.Prediction of phosphorylation sites of HN protein圖6 HN蛋白的糖基化和磷酸化位點(diǎn)預(yù)測Fig.6 Prediction of glycosylation and phosphorylation sites of HN protein

2.3.6 HN蛋白的B細(xì)胞表位預(yù)測分析 使用DNAstar Protean程序預(yù)測HN蛋白的抗原表位時(shí)選擇了親水性、表面可及性及柔韌性三種預(yù)測方法結(jié)合的方式來預(yù)測抗原表位，由于氨基酸的性質(zhì)決定了親水性殘基大概率位于蛋白表面，易于參與形成抗原表位；當(dāng)氨基酸活性越強(qiáng)時(shí)，其柔韌性得分越高，柔韌性得分高的位點(diǎn)說明其參與生命活動(dòng)的可能性較高，可能參加蛋白抗原與抗體結(jié)合，是形成B細(xì)胞抗原表位的優(yōu)良位點(diǎn)。對其各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行綜合分析預(yù)測，可推測主要的B細(xì)胞抗原表位極大概率可能出現(xiàn)在aa 8-19、68-83、127-137、142-149、166-174、227-235、256-266、281-293、307-312、318-333、339-364、449-457、492-499、509-523(圖7)。

圖7 HN蛋白的B細(xì)胞抗原表位的預(yù)測Fig.7 Prediction of B cell epitopes of HN protein

2.3.7 HN蛋白的空間結(jié)構(gòu)

2.3.7.1 HN蛋白的二級結(jié)構(gòu) 通過SOPMA對HN蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測分析。結(jié)果顯示，Anh株HN蛋白二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲占比最多，為47.46%，β轉(zhuǎn)角所占比例最少，為3.85%，此外α螺旋為25.04%，延伸鏈為23.64%。二級結(jié)構(gòu)各組分中α螺旋含量并不少，但根據(jù)2.3.4.1結(jié)果可知其主要存在于病毒膜內(nèi)側(cè)與跨膜部位且較為集中，而β轉(zhuǎn)角含量則較低，病毒膜外主要是由無規(guī)則卷曲及延伸鏈組成(圖8)。由于化學(xué)鍵鍵能較低的無規(guī)則卷曲含量較多，因此推測HN蛋白位于病毒膜外側(cè)的空間結(jié)構(gòu)易于發(fā)生改變，是一種多功能蛋白。

圖8 HN蛋白的二級結(jié)構(gòu)分析Fig.8 Secondary structure analysis of HN protein

2.3.7.2 HN蛋白的三維結(jié)構(gòu) 圖9A為HN蛋白三級結(jié)構(gòu)3D平面圖。預(yù)測結(jié)果與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果基本吻合(圖8)，該蛋白的三級結(jié)構(gòu)主要是α螺旋、延伸鏈和無規(guī)則卷曲組成。

2.3.7.3 HN蛋白的結(jié)構(gòu)域分析 通過CDD數(shù)據(jù)庫獲取HN蛋白的結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域ID：10450460，屬于神經(jīng)氨酸酶CL21531超家族?；钚晕稽c(diǎn)在氨基酸序列中是由以下位點(diǎn)aa 174-198-401-416-498-526-547組成的，其序列為R-D-E-R-R-Y-E；受體結(jié)合位點(diǎn)在氨基酸序列中是由以下位點(diǎn)174-258-299-317-363-364-401-416-418-466-498-526組成的，其序列為R-E-Y-Y-R-F-E-R-S-I-R-Y(圖9B)。

A.HN蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測；B.HN蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測A.Prediction of tertiary structure of HN protein；B.Prediction of domain of HN protein圖9 HN蛋白的三級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域預(yù)測Fig.9 Prediction of tertiary structure and domain of HN protein

2.3.8 HN蛋白的氨基酸序列變異分析 在NCBI中查找到的新城疫病毒HN蛋白基因序列號：NC-039223.1，GI：37627205。HN蛋白序列號：YP-009513198.1，GI：1464315645。將測序結(jié)果與NCBI上HN蛋白的氨基酸序列進(jìn)行比對分析。結(jié)果顯示，二者具有較高的同源性，為91.07%。且在aa 25-45之間的跨膜區(qū)序列變異程度相對于膜內(nèi)和膜外的變異程度整體較高，可推測跨膜區(qū)的變異可能與其毒力的大小相關(guān)。且其在膜外的變異位點(diǎn)多是組成無規(guī)則卷曲的氨基酸，而無規(guī)則卷曲是蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的變化過程中起重要作用的部位，與蛋白質(zhì)的功能息息相關(guān)(圖10)。

圖10 HN蛋白的氨基酸序列分析Fig.10 The analysis of amino acid sequence of HN protein

3 討論

通過生物信息學(xué)分析中等毒力Anh株HN蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，可知HN蛋白為無信號肽的跨膜蛋白，且HN蛋白中疏水序列主要位于蛋白的N端胞質(zhì)區(qū)和跨膜區(qū)。HN蛋白的糖基化修飾和磷酸化修飾對HN蛋白的總體活性具有一定影響，根據(jù)預(yù)測結(jié)果可知HN蛋白具有較高的磷酸化傾向，說明其在病毒入侵宿主細(xì)胞時(shí)較為活躍，參與多項(xiàng)生命活動(dòng)。此外，不同位點(diǎn)的修飾會(huì)影響病毒感染宿主細(xì)胞，這兩種化學(xué)修飾也參與受體細(xì)胞與病毒的融合，影響病毒蛋白的分泌合成，而且處于病毒胞膜糖蛋白上的糖基化或磷酸化可以使病毒躲避宿主的免疫應(yīng)答識別，因此，蛋白的糖基化與磷酸化修飾與病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞以及病毒的復(fù)制能力大小都有著緊密的聯(lián)系[14]。

研究結(jié)果表明，HN蛋白屬于神經(jīng)氨酸酶超家族，具備神經(jīng)氨酸酶與血凝素活性，因此HN蛋白可識別宿主表面的唾液酸受體使NDV與受體細(xì)胞融合，也可使唾液酸受體水解，防止病毒與受體細(xì)胞凝聚簇集，有助于凝集的受體細(xì)胞上的病毒釋放，加快病毒對宿主的感染。已有研究結(jié)果表明與F蛋白的融合會(huì)影響NDV的毒力，而HN蛋白中aa 124-152對與F蛋白相互作用具有重要意義[15]。在氨基酸序列分析中，aa 124-152中第135位相較于與NCBI所給序列發(fā)生了變異，由Thr變?yōu)榱薞al。我們可以推測，HN蛋白毒力的變化，一是由于與F蛋白結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生了突變，影響其與宿主細(xì)胞膜融合的功能；二是由于HN蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)和位于膜外的無規(guī)則卷曲部位發(fā)生了變異，導(dǎo)致其與宿主細(xì)胞的識別發(fā)生了影響，兩者共同作用導(dǎo)致其毒力發(fā)生改變。

通過分析HN蛋白發(fā)現(xiàn)其參與多種病毒的生命活動(dòng)，對促進(jìn)NDV與受體的融合，識別受體位點(diǎn)以及與其他蛋白的相互作用具有重要意義。本研究通過生物信息學(xué)方法分別對Anh HN蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析，為進(jìn)一步探究HN蛋白毒株來源不同與NDV感染活性及其抗腫瘤活性之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。