大孔吸附樹脂對魚籽多肽脫色工藝

徐秉歆，王晗 ，裴棟 ，邸多隆 ，王利濤*，魏鑒騰 , *

1.濟寧醫(yī)學院藥學院（日照 276826）；2.中國科學院蘭州化學物理研究所中國科學院西北特色植物資源化學重點實驗室和甘肅省天然藥物重點實驗室（蘭州 730000）；3.青島市資源化學與新材料研究中心（青島 266100）；4.煙臺中科先進材料與綠色化工產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院（煙臺 264001）

海洋生物活性肽是來源于海洋且具有生物學活性的一類化合物的總稱，其具有抗炎癥[1]、抑菌、抗腫瘤[2-3]、抗高血壓[4]、抗衰老[5]等生理功能，在食品、藥品等領域應用廣泛[6]。魚籽是水產(chǎn)加工副產(chǎn)品，前期研究發(fā)現(xiàn)，魚籽多肽有抗氧化、降血糖等生理活性[7]。其加工過程中殘留有棕褐色色素，嚴重影響進一步開發(fā)，因此，對魚籽多肽脫色工藝的探究有重要意義[8]。

大孔吸附樹脂是一類有較好吸附性能的有機高聚物吸附劑，其具有成本低、穩(wěn)定性高、吸附速度快、可重復使用等[9]優(yōu)點。試驗以魚籽多肽為研究對象，其脫色率和得率為評價指標，得到優(yōu)選大孔吸附樹脂，并通過單因素試驗和響應面試驗[10]，篩選出最佳脫色工藝條件，為魚籽多肽進一步研究與開發(fā)提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚籽（山東省青島市南山市場）；康寧Corning 3599 96孔板（美國康寧公司）；鹽酸、氫氧化鈉（國藥集團化學試劑有限公司）；95%（V/V）乙醇消毒液（山東省利爾康醫(yī)療科技股份有限公司）；Na+732陽離子樹脂、氯717陰離子樹脂、HPD450、LSCAS、MCI、LSA-21、LSA-40、DM-130、LX69B、YWD12G、HPD100、LX68M、LSA-50型樹脂[南京貝斯特生物技術(shù)有限公司、西安藍曉科技新材料股份有限公司、麥科儀（北京）科技有限公司、上海紫一試劑廠、安徽三星樹脂科技有限公司]；等。

1.2 儀器與設備

HWS26型電熱恒溫水浴鍋、DHG-940A電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；Sartorius BSA224S電子天平[賽多利斯科學儀器（北京）]；WD-2102A型酶標儀（北京六一儀器廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 大孔吸附樹脂預處理

分別將13種樹脂用乙醇浸泡并洗滌，至流出液加水無渾濁，再用去離子水洗至無乙醇味，待用[11]。

1.3.2 魚籽多肽脫色率、得率測定

脫色前后多肽上清液，在630 nm波長處測定吸光度，烘干、稱重，按式（1）和（2）計算脫色率、得率[12]。

式中：A1為脫色前樣品吸光度；A2為脫色后樣品吸光度。

式中：M1為脫色前樣品質(zhì)量；M2為脫色后樣品質(zhì)量。

1.3.3 脫色大孔吸附樹脂種類的篩選

選取預處理后的樹脂對魚籽多肽進行脫色處理，分別檢測脫色率和得率，篩選出最佳大孔吸附樹脂。

1.3.4 魚籽多肽脫色的單因素試驗

分別考察脫色劑用量（2，3，4，5和6 g/g）、脫色溫度（20，30，40，50和60 ℃）、脫色時間（1，2，4，6和8 h）以及pH（pH 3，5，7，9和13）對魚籽多肽脫色率和得率的影響。

1.3.5 響應面試驗

在單因素試驗基礎上，依據(jù)Box-Behnken試驗設計原理，以魚籽多肽脫色率和得率為響應值，設計四因素三水平的響應面試驗[13]，見表1。將所得數(shù)據(jù)用Design-Expert 8.0.6軟件進行二次多項式擬合及分析。

表1 響應面因素與水平設計表

2 結(jié)果與討論

2.1 不同大孔吸附樹脂對魚籽多肽脫色工藝的影響

由圖1可知，在脫色劑用量2 g/g、脫色溫度20 ℃、脫色時間8 h、pH 5條件下，綜合考慮脫色率與得率，選擇大孔吸附樹脂LSA-50進行脫色工藝優(yōu)化。

圖1 不同大孔吸附樹脂對魚籽多肽脫色工藝的影響

2.2 魚籽多肽脫色工藝單因素試驗結(jié)果

由圖2（a）可知，樹脂用量對脫色工藝有顯著影響，隨著樹脂用量增加，多肽脫色率先迅速增長后逐漸放緩。得率下降，可能是由于樹脂用量增加，比表面積增大，對多肽吸附能力增大。故用量最佳為4 g/g。由圖2（b）可知，溫度與脫色率變化呈正相關(guān)。但溫度升高，得率先升后降?？赡苁牵簻囟鹊蜁r，溫度升高，多肽解吸附加快，得率上升；溫度高時，樹脂溶脹系數(shù)增加，孔徑變大，多肽進入，得率下降。故優(yōu)選40 ℃。由圖2（c）可知，脫色率隨時間延長而增大，2 h后多肽得率開始下降，因此，最優(yōu)時間選2 h。由圖2（d）可知，多肽脫色率隨pH升高而增大，酸性條件下脫色效果好。得率隨pH升高，先下降后上升。結(jié)合實際生產(chǎn)多肽料液pH，最佳pH 5。

圖2 各單因素對魚籽多肽脫色工藝的影響

2.3 響應面法優(yōu)化分析

2.3.1 響應面試驗結(jié)果

將表2結(jié)果進行擬合得回歸方程：脫色率Y1=79.86+3.42A+4.85B+0.82C+3.38D-1.00AB-0.81AC-0.24AD+0.020BC-0.54BD+0.46CD-0.85A2-1.48B2+0.48C2-1.65D2；得率Y2=60.75-5.23A-0.028B+1.99C-8.36D+0.62AB+1.87AC-0.36AD-0.31BC-1.43BD-4.70CD-1.41A2-1.25B2+0.90C2+2.26D2。

2.3.2 響應面方差分析結(jié)果

對表2進行顯著性檢驗及方差分析，結(jié)果見表3。Radj2為95.16%和87.96%，表明擬合值與實際值相關(guān)性好。模型p值小于0.01，有極顯著差異；失擬項p值大于0.05，無顯著差異；變異系數(shù)（C.V.）分別為1.33%和4.15%，說明該模型相關(guān)性較好，模型構(gòu)建合理。

表2 響應面試驗設計結(jié)果

對表3分析可知，對魚籽多肽脫色率有顯著影響（p＜0.05）的因素有A、B、C、D、B2、D2，其中各單因素對其脫色效果影響的大小順序為脫色時間（B）＞樹脂用量（A）＞pH（D）＞脫色溫度（C）。對魚籽多肽得率有顯著影響（p＜0.05）的因素有A、C、D、CD、D2，其中各單因素對得率影響的大小順序為pH（D）＞樹脂用量（A）＞脫色溫度（C）＞脫色時間（B）。

表3 響應面方差分析結(jié)果

2.3.3 雙因素的交互影響

由圖3（a）可知：脫色溫度和pH選最優(yōu)值，樹脂用量一定，脫色時間延長，脫色率顯著升高；脫色時間一定，脫色率隨樹脂用量增加而增大。由圖3（b）可知：脫色溫度和時間選最優(yōu)值，樹脂用量一定，脫色率隨pH升高而增大；pH一定，脫色率隨樹脂用量增大緩慢升高。由圖3（c）可知：樹脂用量和脫色溫度均選最優(yōu)值，脫色時間一定，脫色率隨pH增加先增加后趨于平緩；pH一定，脫色時間增長，脫色率增大。

圖3 脫色率的雙因素交互影響

由圖4（a）可知：脫色溫度和pH選最優(yōu)值，樹脂用量一定，脫色時間延長，得率先升高后降低；脫色時間一定，得率隨樹脂用量增加急速上升。由圖4（b）可知：樹脂用量和脫色時間選最優(yōu)值，脫色溫度一定，得率隨pH增大而上升；pH一定，得率隨溫度升高先升高后降低。

圖4 得率的雙因素交互影響

2.3.4 魚籽多肽最佳脫色工藝條件驗證

綜上所述，大孔吸附樹脂LSA-50對魚籽多肽脫色最優(yōu)工藝條件：樹脂用量4.94 g/g，脫色時間2 h，脫色溫度55 ℃，pH 4。在此條件下，多肽理論脫色率為80.07%，理論得率為77.98%。驗證結(jié)果顯示，脫色率為80.20%，得率為77.05%。由此可見，脫色率和得率的預測值與理論值相近，說明構(gòu)建的模型合理，脫色工藝可行。

3 結(jié)論

以魚籽多肽為研究對象，最優(yōu)脫色大孔吸附樹脂LSA-50對應的最佳脫色工藝條件：樹脂用量4.94 g/g，脫色時間2 h，脫色溫度55 ℃，pH 4。在此條件下，脫色率為80.20%，得率為77.05%。該工藝對魚籽多肽脫色效果較好，為魚籽多肽進一步研究、開發(fā)提供技術(shù)支持。