艾灸調(diào)節(jié)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠E3泛素連接酶TRIM31的腸黏膜屏障保護(hù)機(jī)制

吳璐一 鐘蕊 林亞瑩 鄭寒丹 劉世敏 黃艷 馬喆 劉雅楠

摘要 目的：觀察艾灸對野生型和TRIM31基因敲除（TRIM31-/-）潰瘍性結(jié)腸炎（UC）模型小鼠緊密連接蛋白以及血清炎癥介質(zhì)的影響，探討TRIM31能否通過保護(hù)UC腸黏膜屏障而降低UC腸道炎癥反應(yīng)以及艾灸對其調(diào)節(jié)作用。方法：分別采用野生型和TRIM31基因敲除小鼠構(gòu)建UC模型，免疫組織化學(xué)檢測結(jié)腸組織中TRIM31、閉合蛋白、密封蛋白、ZO-1的蛋白表達(dá);實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測法檢測結(jié)腸組織中TRIM31的mRNA表達(dá);ELISA檢測血清白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、IL-13、IL-25、IL-33蛋白的濃度。結(jié)果：艾灸可改善野生型UC小鼠的結(jié)腸炎癥，升高結(jié)腸TRIM31蛋白及mRNA的表達(dá)以及腸黏膜屏障相關(guān)閉合蛋白、密封蛋白、ZO-1的表達(dá)，降低血清炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-13、IL-25、IL-33的濃度;TRIM31-/-小鼠較野生型小鼠相比，結(jié)腸炎癥加重，腸黏膜屏障相關(guān)閉合蛋白、密封蛋白、ZO-1表達(dá)降低，血清炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-13濃度升高;艾灸還可改善TRIM31-/-UC小鼠的結(jié)腸炎癥，升高結(jié)腸組織腸黏膜屏障相關(guān)閉合蛋白、密封蛋白、ZO-1的表達(dá)，降低血清炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-13、IL-25、IL-33的濃度。結(jié)論：TRIM31蛋白可能是艾灸參與調(diào)節(jié)UC腸黏膜屏障保護(hù)的關(guān)鍵靶點(diǎn);艾灸對TRIM31-/-小鼠腸黏膜屏障相關(guān)閉合蛋白、密封蛋白、ZO-1及血清炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-13、IL-25、IL-33仍有調(diào)節(jié)作用，表明艾灸還可能通過發(fā)揮其多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)作用參與UC腸黏膜屏障保護(hù)。

關(guān)鍵詞 潰瘍性結(jié)腸炎;艾灸;TRIM31;腸黏膜屏障;炎癥介質(zhì);基因敲除

Protective Mechanism of Moxibustion on Intestinal Mucosal Barrier by Regulating E3 Ubiquitin Ligase TRIM31 in Mice with Ulcerative Colitis

WU Luyi1，2，ZHONG Rui3，LIN Yaying2，ZHENG Handan2，LIU Shimin2，HUANG Yan2，MA Zhe2，LIU Yanan2

（1 Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200437，China; 2 Shanghai Research Institute of Acupuncture and Meridian，Shanghai 200030，China; 3 Shanghai Qigong Research Institute，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200030，China）

Abstract Objective：To observe the effects of moxibustion on tight junction proteins and serum inflammatory factors in wild-type and TRIM31 knockout （TRIM31-/-） ulcerative colitis （UC） model mice and explore the possibility of TRIM31 in reducing intestinal inflammation in UC by protecting the intestinal mucosal barrier，as well as the regulatory role of moxibustion.Methods：The UC model was induced in the wild-type and TRIM31-/-mice.Immunohistochemistry was used to detect the protein expression of TRIM31，Occludin，Claudin-1，and ZO-1 in colon tissues.RT-qPCR was used to detect the mRNA expression of TRIM31 in colon tissues.The serum levels of IL-1β，IL-13，IL-25，and IL-33 were detected by ELISA.Results：Moxibustion could resist colonic inflammation in wild-type UC mice，increase the protein and mRNA expression of TRIM31 and the expression of Occludin，Claudin-1，and ZO-1 in the colon，and reduce the concentrations of inflammatory factors IL-1β，IL-13，IL-25，and IL-33 in the serum.Compared with the wild-type mice，the TRIM31-/-mice showed aggravated colitis，decreased expression of Occludin，Claudin-1，and ZO-1，and increased serum concentrations of IL-1β and IL-13.Additionally，moxibustion could improve the colitis of TRIM31-/-UC mice，increase the expression of Occludin，Claudin-1，and ZO-1 in the colon，and reduce the serum concentrations of IL-1β，IL-13，IL-25，and IL-33.Conclusion：TRIM31 protein might serve as a key target of moxibustion in regulating the intestinal mucosal barrier in UC.The regulatory role of moxibustion on Occludin，Claudin-1，ZO-1，IL-1β，IL-13，IL-25，and IL-33 in TRIM31-/-mice was verified，which suggested that moxibustion presumedly participated in the protection of intestinal mucosal barrier in UC by virtue of its multi-target regulatory role.

Keywords Ulcerative colitis; Moxibustion; TRIM31; Intestinal mucosal barrier; Inflammatory factors; Gene knockout

中圖分類號：R256.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2022.03.007

潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative Colitis，UC）是一種病因未明的慢性復(fù)發(fā)性結(jié)直腸疾病，與克羅恩?。–rohn Disease，CD）同屬于炎癥性腸病的范疇。UC的臨床癥狀主要包括腹瀉、腹痛、黏液膿血便、體質(zhì)量減輕、里急后重等，另外還可表現(xiàn)為皮膚、眼睛、關(guān)節(jié)和肝膽等腸外癥狀。UC的診斷目前主要結(jié)合患者病史、內(nèi)窺鏡檢查、組織病理學(xué)、實(shí)驗(yàn)室檢查以及影像學(xué)研究等綜合手段[1]。UC在全世界的影響范圍較廣，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢[2-3]。長期反復(fù)發(fā)作的潰瘍性結(jié)腸炎降低了患者的生命質(zhì)量，且增加了患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)[4]。UC的病理機(jī)制較為復(fù)雜，目前尚未完全闡明，主要與遺傳、免疫、環(huán)境等因素相關(guān)[5]。研究表明，三結(jié)構(gòu)域蛋白家族（Tripartite Motif，TRIM）可通過泛素-蛋白酶體途徑促進(jìn)各自底物的降解，在先天免疫應(yīng)答中具有重要的調(diào)節(jié)作用[6]。其中，TRIM31蛋白作為該家族中重要的一員，與腸道炎癥和腸道穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)[7-8]。TRIM31蛋白還可通過泛素蛋白酶途徑介導(dǎo)炎癥小體核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（Nucleotide-binding Oligomerization Domain-like Receptor Protein 3，NLRP3）的蛋白降解，參與葡聚糖硫酸鈉（Dextran Sulfate Sodium Salt，DSS）誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的炎癥反應(yīng)[9]。UC是一種最初由上皮細(xì)胞或結(jié)構(gòu)性腸上皮功能障礙引起的腸道屏障疾病，而腸道屏障障礙也可能被固有層中的強(qiáng)炎癥介質(zhì)和細(xì)胞破壞引起，繼而引發(fā)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)可導(dǎo)致疾病呈慢性發(fā)展[1]。在UC的整個(gè)病理過程中，腸黏膜屏障作為腸道的重要防線之一，其損傷引起的腸黏膜通透性的增加可能是UC發(fā)病的始動因素[10-13]。目前TRIM31與UC腸黏膜屏障的相關(guān)研究較少，TRIM31能否通過保護(hù)UC腸黏膜屏障而降低UC腸道炎癥反應(yīng)，可能是探討UC發(fā)病機(jī)制的一個(gè)突破點(diǎn)。

UC的治療主要體現(xiàn)在最大限度地緩解癥狀、消除炎癥、愈合潰瘍，常用藥物主要有5-氨基水楊酸類、皮質(zhì)類固醇、免疫抑制劑、抗生素以及一些新興的生物制劑等，但個(gè)體間療效具有較大差異，且部分藥物具有一定的不良反應(yīng)、停藥易復(fù)發(fā)的缺點(diǎn)[14]。研究表明艾灸治療UC有著良好的臨床療效，可從多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫平衡，且具有安全、復(fù)發(fā)率低及遠(yuǎn)期療效好等優(yōu)勢[15-16]。實(shí)驗(yàn)研究表明艾灸還可對UC免疫細(xì)胞因子、炎癥信號通路及腸黏膜屏障等有調(diào)節(jié)作用[17-19]。因此，本研究采用TRIM31基因敲除小鼠深入探討艾灸干預(yù)UC的腸黏膜屏障保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 本研究選用6周齡的無特定病原體（SPF）級雄性C57BL/6野生型（Wild Type，WT）小鼠和C57BL/6背景的TRIM31基因敲除（TRIM31-/-）小鼠為實(shí)驗(yàn)對象，均由江蘇集萃藥康生物科技有限公司提供，所有實(shí)驗(yàn)動物均飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心[實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK（滬）2014-0008]。飼養(yǎng)環(huán)境：12 h晝夜節(jié)律交替、室內(nèi)溫度控制在（20±2）℃，室內(nèi)濕度控制在50%～70%。實(shí)驗(yàn)動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始正式實(shí)驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)操作均在上海中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會指導(dǎo)下進(jìn)行，動物福利倫理委員會批準(zhǔn)通過（倫理審批號：PZSHUTCM211227010）

1.1.2 藥物 DSS（MP Biomedicals，美國，批號：00081551），艾絨（南陽漢醫(yī)艾絨有限責(zé)任公司，批號：20190716），桂附一號方（上海華濟(jì)藥業(yè)有限公司），黃酒（上海慶豐釀造調(diào)味品有限公司，批號：20190519）。

1.1.3 試劑與儀器 TRIM31（Thermo Fisher，美國，貨號：PA5-40961），閉合蛋白（abcam，美國，貨號：ab222691），密封蛋白（SANTA CRUS，美國，貨號：sc-166338），ZO-1（abcam，美國，貨號：ab190085），小鼠白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）ELISA試劑盒（上海司鼎生物科技有限公司，貨號：SDM0002），小鼠白細(xì)胞介素-13（IL-13）ELISA試劑盒（上海司鼎生物科技有限公司，貨號：SDM0012），小鼠白細(xì)胞介素-25（IL-25）ELISA試劑盒（上海司鼎生物科技有限公司，貨號：SDM0130），小鼠白細(xì)胞介素-33（IL-33）ELISA試劑盒（上海司鼎生物科技有限公司，貨號：SDM0019），光學(xué)顯微鏡（OLYMPUS，日本，型號：CX33），酶標(biāo)儀（Tecan，瑞士，型號：F50），組織研磨儀（上海凈信科技有限公司，型號：Tissuelyser-48），qPCR儀（Roche，瑞士，型號：LightCycler 480Ⅱ）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 1）實(shí)驗(yàn)一：艾灸干預(yù)WT小鼠UC模型的效應(yīng)及機(jī)制研究：將WT小鼠隨機(jī)分成正常組（n=8）和造模組（n=20），造模組采用3% DSS水溶液連續(xù)飲用7 d制備UC模型[20]。造模結(jié)束后隨機(jī)抽取正常組和造模組各2只進(jìn)行模型鑒定;HE染色的組織病理學(xué)觀察見到潰瘍面確定造模成功后將造模組小鼠隨機(jī)分為模型組、隔藥餅灸組、西藥組，每組6只。2）實(shí)驗(yàn)二：TRIM31-/-對UC小鼠腸黏膜屏障相關(guān)蛋白及血清炎癥介質(zhì)的影響研究：WT小鼠和TRIM31-/-小鼠各6只，造模方法同實(shí)驗(yàn)一。3）實(shí)驗(yàn)三：艾灸干預(yù)TRIM31-/-小鼠UC模型的效應(yīng)及機(jī)制研究：將TRIM31-/-小鼠隨機(jī)分成正常組、模型組、隔藥餅灸組、西藥組，每組6只，造模方法同實(shí)驗(yàn)一。

1.2.2 干預(yù)方法 1）實(shí)驗(yàn)一：隔藥餅灸、西藥組小鼠分別進(jìn)行隔藥餅灸、西藥連續(xù)干預(yù)7 d后與正常組、模型組一起取材處理。2）實(shí)驗(yàn)二：不進(jìn)行干預(yù)，取材時(shí)間節(jié)點(diǎn)同實(shí)驗(yàn)一。3）實(shí)驗(yàn)三：干預(yù)方法及取材時(shí)間節(jié)點(diǎn)均同實(shí)驗(yàn)一。

隔藥餅灸穴位選取天樞（雙）、氣海穴，穴位定位參照余曙光主編《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[21]。操作方法：將制附子、肉桂、木香等藥研末，用黃酒調(diào)制，藥餅用定制模具做成藥餅（直徑0.5 cm，厚度0.3 cm）;將藥餅置于穴區(qū)，上置艾炷施灸，每壯艾炷大小約30 mg，1次/d，每次每穴灸2壯，連續(xù)灸7 d。西藥組采用柳氮磺胺吡啶（SASP）溶液灌胃，每日投藥量參照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》[22]配制：按成人（70 kg體質(zhì)量）與小鼠（20 g體質(zhì)量）1∶0.002 6比例，1次/d，共灌胃7 d，并做與隔藥餅灸組同樣的抓取固定。

1.2.3 標(biāo)本采集與制備

干預(yù)結(jié)束后，所有小鼠禁食、不禁水24 h。小鼠腹腔注射1%的戊巴比妥鈉（35～40 mg/kg）進(jìn)行麻醉后，剪去胸部被毛，于心尖搏動最明顯處穿刺抽血，室溫靜置2 h離心（4 ℃，3 000 r/min，15 min，離心半徑10 cm）后取上清，并置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。沿小鼠腹中線剪開小鼠腹部，充分暴露直腸、結(jié)腸，從恥骨聯(lián)合處上行剪至盲腸部，并量取結(jié)腸長度;每段結(jié)腸分成兩部分，一部分將其漿膜層貼于濾紙上，放入4%多聚甲醛中固定，另一部分放入凍存管中置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 檢測指標(biāo)與方法

1.2.4.1 觀察小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)改變 將多聚甲醛中固定的結(jié)腸組織脫水、包埋后進(jìn)行石蠟切片，切片厚度為4 μm。石蠟切片經(jīng)二甲苯、梯度乙醇脫蠟水化后，再經(jīng)流水沖洗、蘇木素染色、1%鹽酸乙醇分化、伊紅侵染、乙醇和二甲苯脫水透明后封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察小鼠結(jié)腸黏膜組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.4.2 檢測小鼠結(jié)腸組織腸黏膜屏障相關(guān)蛋白的表達(dá) 取小鼠結(jié)腸組織石蠟切片，經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)、封閉后于37 ℃條件下滴加一抗（TRIM31濃度：1∶200;閉合蛋白濃度：1∶200;密封蛋白濃度：1∶200;ZO-1濃度：1∶200），4 ℃冰箱過夜并于第2天滴加二抗孵育。磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗后用DAB顯色液進(jìn)行顯色。之后用蘇木精對細(xì)胞核進(jìn)行染色1 min，脫水，封片。每張切片在固定光亮度下，隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行拍照，采用Image-Plus Pro 6.0軟件分析每張照片積分光密度（IOD），最后取平均值即為該切片的陽性目標(biāo)積分光密度值。

1.2.4.3 檢測小鼠結(jié)腸組織TRIM31mRNA的表達(dá)? 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測法檢測小鼠結(jié)腸組織TRIM31的mRNA表達(dá)。主要的步驟如下：1）總RNA抽提;2）逆轉(zhuǎn)錄;3）熒光定量PCR擴(kuò)增，小鼠的基因序列參照Gene Bank數(shù)據(jù)庫中各目的基因的序列，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。Mouse TRIM31 F-primer：AATACGTTCAGGCCCAATAAGC;Mouse TRIM31 R-primer：GTCCTTGGAGTCACGACACAC;Mouse GAPDH F-primer：AGGTCGGTGTGAACGGATTTG;Mouse GAPDH R-primer：TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA。反應(yīng)條件：95 ℃，2 min;94 ℃，10 s;60 ℃，10 s;72 ℃，40 s，共40個(gè)循環(huán)，采用 2-△△Ct法對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.4.4 檢測小鼠血清炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-13、IL-25、IL-33的濃度 采用ELISA試劑盒檢測小鼠血清IL-1β、IL-13、IL-25、IL-33蛋白的濃度，實(shí)驗(yàn)方法嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書進(jìn)行，步驟如下：配置標(biāo)準(zhǔn)品液，每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100 μL，將反應(yīng)板充分混勻后置37 ℃ 40 min;洗滌液充分洗滌4～6次，向?yàn)V紙上印干;每孔加入蒸餾水和第一抗體工作液各50 μL（空白孔除外），充分混勻后置37 ℃ 20 min;洗板同前;每孔加酶標(biāo)抗體工作液100 μL，37 ℃反應(yīng)10 min;洗板同前;每孔加入底物工作液100 μL，置37 ℃暗處反應(yīng)15 min;每孔加入100 μL終止液混勻;30 min內(nèi)用酶標(biāo)儀在450 nm波長處測吸光值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料先作正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）法，2組間比較采用t檢驗(yàn)法，方差分析法中若方差齊性采用LSD法，方差不齊性采用Dunnett法;不符合正態(tài)分布者以M（P25，P75）表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)法。所有檢驗(yàn)采用雙側(cè)檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 艾灸干預(yù)WT小鼠UC模型的效應(yīng)及機(jī)制研究

2.1.1 艾灸干預(yù)WT小鼠UC結(jié)腸炎癥的效應(yīng) 結(jié)腸長度比較結(jié)果提示，與正常組比較，模型組結(jié)腸長度明顯縮短（P<0.05）;與模型組比較，隔藥餅灸組與西藥組結(jié)腸長度均變長（P<0.05）。HE染色結(jié)果顯示，正常組可見結(jié)腸上皮層完整，腺體排列良好，杯狀細(xì)胞清晰可見;模型組可見潰瘍形成，腺體數(shù)量減少，伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤;隔藥餅灸組與西藥組潰瘍愈合，有新生上皮細(xì)胞覆蓋，杯狀細(xì)胞增多，炎癥細(xì)胞浸潤程度減輕。見圖1。

2.1.2 艾灸對WT小鼠UC結(jié)腸組織TRIM31蛋白及mRNA表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組結(jié)腸組織中TRIM31的蛋白及mRNA表達(dá)顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，隔藥餅灸組和西藥組TRIM31的蛋白及mRNA表達(dá)均顯著升高（均P<0.05）。見圖2。

2.1.3 艾灸對WT小鼠UC結(jié)腸腸黏膜屏障相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織閉合蛋白、密封蛋白、ZO-1蛋白表達(dá)降低（P<0.05）;與模型組比較，隔藥餅灸組與西藥組小鼠結(jié)腸組織閉合蛋白、密封蛋白、ZO-1蛋白表達(dá)升高（P<0.05）。見圖3。

2.1.4 艾灸對WT小鼠UC血清炎癥介質(zhì)的影響

與正常組比較，模型組小鼠血清IL-1β、IL-13、IL-25、IL-33濃度升高（P<0.05）;與模型組比較，隔藥餅灸組與西藥組小鼠血清IL-1β、IL-13、IL-25、IL-33濃度降低（P<0.05）。見圖4。

2.2 TRIM31-/-對UC小鼠腸黏膜屏障相關(guān)蛋白及血清炎癥介質(zhì)的影響

2.2.1 TRIM31-/-對UC小鼠結(jié)腸長度及組織病理學(xué)的影響

結(jié)腸長度比較結(jié)果提示，與WT比較，TRIM31-/-結(jié)腸長度明顯縮短（P<0.05）;HE染色結(jié)果顯示，與WT比較，TRIM31-/-結(jié)腸組織潰瘍面積較大，腺體消失，炎癥細(xì)胞浸潤程度較嚴(yán)重。見圖5。

2.2.2 TRIM31-/-對UC小鼠結(jié)腸腸黏膜屏障相關(guān)蛋白的影響

與WT比較，TRIM31-/-小鼠腸黏膜屏障相關(guān)閉合蛋白、密封蛋白、ZO-1蛋白表達(dá)均降低（P<0.05）。見圖6。

2.2.3 TRIM31-/-對UC小鼠血清炎癥介質(zhì)的影響

與WT比較，TRIM31-/-血清炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-13濃度升高（P<0.05），而IL-25、IL-33的濃度無明顯變化（P>0.05）。見圖7。

2.3 艾灸干預(yù)TRIM31-/-小鼠UC模型的效應(yīng)及機(jī)制研究

2.3.1 艾灸干預(yù)TRIM31-/-小鼠UC結(jié)腸炎癥的效應(yīng)

結(jié)腸長度比較結(jié)果提示，與正常組比較，模型組結(jié)腸長度明顯縮短（P<0.05）;與模型組比較，隔藥餅灸組與西藥組結(jié)腸長度均變長（P<0.05）。HE染色結(jié)果提示，正常組結(jié)腸上皮完整，腺體排列良好，杯狀細(xì)胞清晰可見;與正常組比較，模型組可見大面積潰瘍形成，腺體排列不規(guī)則，有大量炎癥細(xì)胞浸潤;與模型組比較，隔藥餅灸組與西藥組潰瘍面積減小，并伴有新生上皮細(xì)胞覆蓋，仍可見少量炎癥細(xì)胞浸潤。見圖8。

2.3.2 艾灸對TRIM31-/-小鼠結(jié)腸腸黏膜屏障相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組小鼠結(jié)腸組織閉合蛋白、密封蛋白、ZO-1蛋白表達(dá)降低（P<0.05）;與模型組比較，隔藥餅灸組與西藥組小鼠結(jié)腸組織閉合蛋白、密封蛋白、ZO-1蛋白表達(dá)升高（P<0.05）。見圖9。

2.3.3 艾灸對TRIM31-/-小鼠血清炎癥介質(zhì)的影響

與正常組比較，模型組小鼠血清IL-1β、IL-13、IL-25、IL-33濃度升高（P<0.05）;與模型組比較，隔藥餅灸組與西藥組小鼠血清IL-1β、IL-13、IL-25、IL-33濃度降低（P<0.05）。見圖10。

3 討論

TRIM家族蛋白是一類含有多個(gè)結(jié)構(gòu)域的生物大分子，因其含有RING結(jié)構(gòu)域，有作為泛素連接酶的潛能故而通常有E3泛素連接酶的活性，在抗病毒的天然免疫反應(yīng)過程中也常常通過其泛素連接酶活性調(diào)控信號通路中的分子活性[23]。TRIM家族蛋白中一種命名為TRIM31的分子被確定為具有E3泛素連接酶活性，研究表明TRIM31蛋白參與了肺癌、胃癌、肝癌等的發(fā)生發(fā)展[24-26]，TRIM31蛋白還可通過核因子κB途徑介導(dǎo)慢性炎癥促進(jìn)結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[27]。TRIM31在腸道炎癥和腸道穩(wěn)態(tài)中也扮演著重要的角色，研究發(fā)現(xiàn)，在TRIM31缺陷小鼠中，TRIM31-/-小鼠較WT小鼠可出現(xiàn)葡萄糖不耐受與胰島素抵抗的現(xiàn)象，并伴有腸道微生物群的顯著差異，表明TRIM31缺陷與小鼠糖代謝受損和腸道微生物群破壞有關(guān)[7]。另有研究表明，內(nèi)源性TRIM31的損耗可顯著增加腸上皮細(xì)胞入侵細(xì)菌的數(shù)量[8]。TRIM31蛋白還可通過泛素蛋白酶途徑介導(dǎo)炎癥小體NLRP3的蛋白降解，參與DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的炎癥反應(yīng)[9]，可能是UC的關(guān)鍵治療靶點(diǎn)之一。

艾灸治療UC具有安全、復(fù)發(fā)率低及遠(yuǎn)期療效好等優(yōu)勢[15-16]，其中腧穴配伍對臨床療效起了關(guān)鍵作用[28]。氣海穴屬任脈之經(jīng)穴，可補(bǔ)益元?dú)?，對脾腎之元?dú)馓潛p所致的UC有較好的臨床療效[29]。天樞屬大腸之募穴，是人體氣機(jī)升降之樞紐，對腸腑疾病具有雙向良性調(diào)節(jié)作用，本穴也是動物實(shí)驗(yàn)研究中針灸干預(yù)UC的常用腧穴[30-31]。本研究采用DSS誘導(dǎo)的UC小鼠模型，并觀察艾灸天樞、氣海穴對UC小鼠結(jié)腸組織TRIM31的調(diào)節(jié)作用，研究結(jié)果表明，DSS誘導(dǎo)的UC小鼠結(jié)腸TRIM31蛋白和mRNA表達(dá)均明顯降低，這與既往研究中TRIM31在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠中表達(dá)下調(diào)一致[8-9]。艾灸干預(yù)后，UC小鼠結(jié)腸長度升高、炎癥緩解，結(jié)腸TRIM31蛋白和mRNA表達(dá)均明顯升高，提示艾灸可能通過調(diào)節(jié)TRIM31的表達(dá)參與改善UC炎癥。

炎癥反應(yīng)始終貫穿UC的整個(gè)病理過程，而由腸黏膜屏障損傷引起的腸黏膜通透性的增加可能是UC發(fā)病的關(guān)鍵因素。腸黏膜屏障主要由機(jī)械屏障、免疫屏障、生物屏障及化學(xué)屏障組成[32]，而構(gòu)成機(jī)械屏障的緊密連接對于維持腸黏膜屏障完整性和腸上皮屏障通透性具有重要意義[33]。其中，緊密連接蛋白如閉合蛋白、密封蛋白、ZO-1等的減少或破壞會導(dǎo)致腸黏膜通透性增加，引起腸腔抗原攝入的增加，激活機(jī)體天然免疫反應(yīng)，產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)，進(jìn)一步加重腸道炎癥反應(yīng)[34-35]。本研究發(fā)現(xiàn)，WT小鼠UC模型中腸黏膜屏障相關(guān)閉合蛋白、密封蛋白、ZO-1明顯降低，血清炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-13、IL-25、IL-33濃度明顯升高;而經(jīng)過艾灸干預(yù)后，上述腸黏膜屏障相關(guān)蛋白的表達(dá)均明顯升高，血清炎癥介質(zhì)濃度均明顯降低，提示艾灸對腸黏膜屏障相關(guān)閉合蛋白、密封蛋白、ZO-1蛋白和血清炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-13、IL-25、IL-33濃度具有調(diào)節(jié)作用。

為了進(jìn)一步觀察TRIM31在UC腸黏膜屏障中的作用，我們采用野生型小鼠和TRIM31-/-小鼠，從正反2個(gè)方面觀察UC小鼠的炎癥程度、腸黏膜屏障相關(guān)蛋白及血清炎癥介質(zhì)的變化。研究發(fā)現(xiàn)，TRIM31-/-小鼠較WT小鼠結(jié)腸炎癥程度加重，腸黏膜屏障相關(guān)閉合蛋白、密封蛋白、ZO-1的表達(dá)降低，血清炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-13濃度升高，表明TRIM31可能是參與UC腸黏膜屏障保護(hù)、降低炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵靶點(diǎn)。但既往有研究發(fā)現(xiàn)，在DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎中，TRIM31-/-較野生型小鼠的結(jié)腸炎癥程度減輕[9]，與本研究結(jié)果存在一定的差異。既往研究的實(shí)驗(yàn)周期為6 d，而本研究為了與艾灸、西藥組保持相同的研究周期，在7 d造模結(jié)束后設(shè)置了7 d的等待期，實(shí)驗(yàn)周期的不同可能是造成兩項(xiàng)研究結(jié)果差異的重要因素。TRIM31在UC不同階段是否發(fā)揮了不同的作用值得關(guān)注。

艾灸可從多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)機(jī)體生理平衡。本研究同時(shí)也觀察了艾灸對TRIM31-/-小鼠UC模型的效應(yīng)、腸黏膜屏障相關(guān)蛋白及血清炎癥介質(zhì)的影響。研究結(jié)果表明，艾灸可改善TRIM31-/-小鼠的UC結(jié)腸炎癥程度，升高TRIM31-/-小鼠UC結(jié)腸組織腸黏膜屏障相關(guān)閉合蛋白、密封蛋白、ZO-1的表達(dá)，降低TRIM31-/-小鼠血清炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-13、IL-25、IL-33的濃度，提示TRIM31基因敲除后，艾灸仍能改善UC小鼠的腸道炎癥，保護(hù)腸黏膜屏障，這也進(jìn)一步證實(shí)了艾灸的多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)作用。

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（2022-01-06收稿 本文編輯：吳珊）