臨床病原菌磷霉素耐藥機(jī)制研究進(jìn)展

王立新， 蘇云福， 王 毅

（1.天津醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300211；2. 新疆維吾爾自治區(qū)和田地區(qū)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，新疆 和田 848000）

隨著各類(lèi)抗菌藥物的廣泛使用，病原菌在耐藥性增強(qiáng)的同時(shí)，也不斷產(chǎn)生新的耐藥機(jī)制。磷霉素是一種廣譜抗菌藥物，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌有獨(dú)特的作用機(jī)制，不易產(chǎn)生交叉耐藥，其毒性低，組織（甚至在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和骨骼）滲透性高。磷霉素對(duì)耐藥革蘭陽(yáng)性菌，如甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌（methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA）、萬(wàn)古霉素耐藥腸球菌（vancomycinresistantEnterococcus，VRE）和青霉素耐藥肺炎鏈球菌（penicillin-resistantStreptococcus pneumoniae，PRSP），以及耐藥革蘭陰性菌，如產(chǎn)超廣譜β -內(nèi)酰胺酶（extended-spectrum betalactamase，ESBL）和產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細(xì)菌都具有良好的抗菌活性[1]。但是，隨著磷霉素的使用，其耐藥率也明顯上升[2]，磷霉素耐藥機(jī)制的相關(guān)報(bào)道也逐漸增多，包括染色體上磷霉素靶酶編碼基因發(fā)生突變、膜轉(zhuǎn)運(yùn)體的結(jié)構(gòu)基因突變、質(zhì)粒介導(dǎo)的磷霉素修飾酶及異質(zhì)性耐藥。本文對(duì)磷霉素耐藥機(jī)制的最新研究進(jìn)行綜述。

1 murA基因突變導(dǎo)致的磷霉素耐藥

磷霉素的作用靶酶UDP-N-乙酰葡萄糖胺烯醇丙酮酸轉(zhuǎn)移酶MurA是催化肽聚糖合成第1步反應(yīng)的關(guān)鍵酶之一，主要作用是催化UDP-N-乙酰葡萄糖胺和磷酸烯醇丙酮酸轉(zhuǎn)化為UDP-N-乙酰葡萄糖胞壁酸。磷霉素通過(guò)抑制MurA來(lái)阻礙細(xì)胞壁的合成。murA基因突變導(dǎo)致磷霉素靶酶MurA發(fā)生氨基酸替換是導(dǎo)致磷霉素耐藥的重要因素。有些細(xì)菌天然對(duì)磷霉素有耐藥性，導(dǎo)致天冬氨酸取代了半胱氨酸的murA突變使病原體（衣原體、結(jié)核分枝桿菌和費(fèi)氏弧菌）對(duì)這種抗菌藥物產(chǎn)生天然耐藥性。同樣，在MurA基因117位點(diǎn)的半胱氨酸替代天冬氨酸后，結(jié)核分枝桿菌對(duì)磷霉素開(kāi)始敏感[3]。

革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌臨床分離株中都存在murA基因突變導(dǎo)致的獲得性耐藥。磷霉素耐藥腸球菌發(fā)生磷霉素靶酶MurA突變的概率較大，以MurA上Cys263Arg、Ser281Gly的氨基酸替代最常見(jiàn)，部分菌株MurA發(fā)生了Cys263Arg、Glu278Arg、Ser281Gly和Val283Ile等多個(gè)氨基酸替代，相應(yīng)的磷霉素最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）也較高[4]。這些氨基酸替換可能是腸球菌對(duì)磷霉素耐藥的機(jī)制，我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)的一項(xiàng)抗菌藥物耐藥性監(jiān)測(cè)研究在MRSA中也發(fā)現(xiàn)了murA突變，該研究在這些突變基因中鑒定出7個(gè)不同亞型，只有1個(gè)亞型導(dǎo)致了717位點(diǎn)的1個(gè)核酸缺失，而其他6個(gè)突變導(dǎo)致了MurA蛋白中不同的氨基酸替換。最常見(jiàn)的對(duì)磷霉素耐藥的murA突變體是I型G257D突變[2]。有學(xué)者在磷霉素耐藥大腸埃希菌和碳青霉烯耐藥肺炎克雷伯菌中都檢測(cè)到了murA基因突變[5-6]。murA基因突變是臨床病原菌磷霉素耐藥的重要機(jī)制之一。

2 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變、缺失導(dǎo)致的磷霉素耐藥

細(xì)菌膜通透性改變可抑制抗菌藥物進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部，而降低抗菌藥物的殺菌或抑菌作用，細(xì)菌表現(xiàn)為對(duì)該藥物耐藥。膜通透性改變也是引起磷霉素耐藥的重要原因之一，最常見(jiàn)的膜轉(zhuǎn)運(yùn)體突變是編碼GlpT和UhpT膜轉(zhuǎn)運(yùn)體的結(jié)構(gòu)基因突變。臨床常見(jiàn)細(xì)菌通過(guò)GlpT和UhpT膜轉(zhuǎn)運(yùn)體運(yùn)輸細(xì)菌代謝功能和毒力所需的甘油和其他碳水化合物，磷霉素通過(guò)相同的轉(zhuǎn)運(yùn)體進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)部。編碼GlpT和UhpT膜轉(zhuǎn)運(yùn)體的結(jié)構(gòu)基因、GlpT和UhpT的調(diào)節(jié)基因，調(diào)節(jié)cAMP水平，進(jìn)而降低GlpT表達(dá)的ptsI和cyaA基因，以及影響細(xì)菌生長(zhǎng)和細(xì)胞壁通透性的abrp基因發(fā)生突變均可以導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)磷霉素的攝取降低，導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)磷霉素產(chǎn)生耐藥[7]。

glpT和uhpT的突變是引起大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌磷霉素耐藥的主要原因之一。LEE等[2]發(fā)現(xiàn)，在磷霉素耐藥的MRSA中包含6種不同glpT基因的突變，每種突變都會(huì)導(dǎo)致GlpT蛋白內(nèi)的氨基酸替換；此外，他們還在uhpT基因中發(fā)現(xiàn)了4種不同的突變，均可導(dǎo)致UhpT蛋白的氨基酸替換。有研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌磷霉素耐藥主要由glpT和uhpT突變引起；同時(shí)，外排基因tet38的過(guò)表達(dá)也是引起磷霉素耐藥的重要原因[8]。

SORLOZANO-PUERTO等[9]發(fā)現(xiàn)，在29株大腸埃希菌中，有22株因uhpT和/或uhpA基因缺失而對(duì)磷霉素產(chǎn)生耐藥性。碳青霉烯類(lèi)耐藥肺炎克雷伯菌的glpT突變（或glpT缺失）和/或uhpT突變也是磷霉素耐藥的機(jī)制之一[6，10]。有學(xué)者在大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)了對(duì)磷霉素耐藥的新的染色體uhpB或uhpC基因突變，通過(guò)定點(diǎn)誘變技術(shù)引入突變uhpB（G469R）或uhpC（F384L）可使大腸埃希菌（CFT073）（MIC=1 mg/L）磷霉素MIC升高128倍[11]。

3 磷霉素修飾酶導(dǎo)致的磷霉素耐藥

臨床主要致病菌對(duì)磷霉素耐藥的重要機(jī)制之一是獲得質(zhì)粒編碼的金屬酶基因。Fos酶屬于乙二醛酶超家族，包括FosA、FosB、FosC、FosL1-2和FosX，這些金屬酶通過(guò)添加谷胱甘肽（FosA1～A10，F(xiàn)osL1-2，F(xiàn)osC2）、桿菌硫醇（FosB）或水（fosX）來(lái)催化磷霉素環(huán)氧化物（環(huán)氧烷）環(huán)的打開(kāi)，使磷霉素失活[12-13]。近十年來(lái)，至少有10種fos基因被發(fā)現(xiàn)，其中fosA、fosA亞型和fosC2主要見(jiàn)于腸桿菌科細(xì)菌；除fosA2外，所有fosA亞型都在質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子、鄰近的插入序列元件或整合子中被發(fā)現(xiàn)，表明這些可移動(dòng)元件在腸桿菌科細(xì)菌質(zhì)粒介導(dǎo)的fos基因轉(zhuǎn)移中起著重要作用[14]。

3.1 FosA修飾酶及亞群

fosA及亞群基因結(jié)構(gòu)很相似（fosA1～A10），fosA2基因與fosA具有95%的氨基酸同源性；fosA3和fosA5是碳青霉烯類(lèi)耐藥及產(chǎn)KPC酶肺炎克雷伯菌磷霉素耐藥的主要機(jī)制，分別有約90%和10%菌株攜帶fosA3和fosA5基因，并可通過(guò)質(zhì)粒在醫(yī)院內(nèi)廣泛傳播[6，15-16]。fosA4基因于2014年在日本的1株大腸埃希菌臨床分離株中被鑒定出來(lái)，澳大利亞有報(bào)道稱(chēng)在分離自尿路感染患者的大腸埃希菌中也檢測(cè)到質(zhì)粒編碼的fosA4基因，其對(duì)磷霉素的MIC＞256 mg/L[17]。fosA5基因全長(zhǎng)420 bp，編碼1個(gè)含有139個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，與fosA、fosA2、fosA3和fosA4的同源性為69%～80%，攜帶fosA3、fosA4和fosA6基因是大腸埃希菌磷霉素耐藥的機(jī)制之一[9，18]。

有研究在分離自尿液樣本的大腸埃希菌中發(fā)現(xiàn)了質(zhì)粒編碼fosA8，與Leclercia adecarboxylata染色體中的fosA基因一致性最高，這種菌引起的人類(lèi)感染罕見(jiàn)，原因可能是由于高水平的fosA基因表達(dá)對(duì)磷霉素具有固有耐藥性[19]。FosA9首次在一個(gè)反復(fù)發(fā)作的膿毒癥患者血培養(yǎng)分離的大腸埃希菌中被檢出[20]。fosA2和fosA7分別為陰溝腸桿菌和Salmonella enterica serovar Heidelberg中fosA的染色體變異，被提議命名為FosAEC和FosASH[21]。

除本身存在fosA可引起耐藥外，某些啟動(dòng)子對(duì)其表達(dá)的影響也對(duì)磷霉素耐藥起重要作用。有學(xué)者對(duì)磷霉素耐藥并產(chǎn)生碳青霉烯酶（OXA-48）的肺炎克雷伯菌進(jìn)行了全基因組測(cè)序，結(jié)果顯示，ISEcp1-bla CTX-M-14b串聯(lián)插入染色體編碼的lysR-fosA位點(diǎn)上游；他們對(duì)lysR和fosA基因表達(dá)量進(jìn)行定量分析，發(fā)現(xiàn)該插入有1個(gè)強(qiáng)大的雜交啟動(dòng)子，使fosA基因過(guò)表達(dá)，導(dǎo)致磷霉素耐藥[22]。

3.2 FosB修飾酶

FosB是一種Mg2+依賴(lài)酶，以L-半胱氨酸作為硫基供體，催化L-半胱氨酸或桿菌巰基添加到磷霉素上，使磷霉素失去殺菌活性。FosB型酶主要存在于芽孢桿菌和葡萄球菌中，在腸球菌中也有報(bào)道，1項(xiàng)關(guān)于磷霉素耐藥屎腸球菌fos基因的研究結(jié)果顯示，在145株屎腸球菌中，有10株對(duì)磷霉素耐藥（MIC＞1 024 mg/L），且均攜帶fosB3基因，部分菌株fosB3位于轉(zhuǎn)座子Tn1546，提示fosB3對(duì)屎腸球菌的磷霉素耐藥起重要作用[23，4]。

3.3 FosC、FosX和FosL修飾酶

在Pseudomonas syringae中發(fā)現(xiàn)的FosC是一種類(lèi)似于谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶的酶，它能在ATP的參與下因催化磷霉素磷酸化而失活。FosX是一種Mn2+依賴(lài)水解酶，與其他Fos酶作用相似，通過(guò)在磷霉素的C1位置加水并打開(kāi)其環(huán)氧環(huán)，使磷霉素失去活性。最新的研究結(jié)果顯示，F(xiàn)osX的高表達(dá)是腸球菌磷霉素耐藥的重要原因之一，在單核李斯特菌、鮑曼不動(dòng)桿菌的磷霉素耐藥中也起重要作用[4，24-25]。有學(xué)者在快速生長(zhǎng)的膿腫分枝桿菌亞群中發(fā)現(xiàn)了FosM，其為FosX亞家族的成員，含有134個(gè)氨基酸，是一種依賴(lài)于Mn2+的FosX型水合酶，對(duì)MSH或其他硫醇沒(méi)有選擇性[26]。KHABTHANI等[27]從人類(lèi)腸道的新細(xì)菌物種（Bacillus massiliogabonensis、Gracilibacillus timonensis和Bacillus phoceensis）中鑒定出3個(gè)新的磷霉素耐藥基因，分別是fosM1、fosM2和fosM3，均對(duì)磷霉素產(chǎn)生高水平的耐藥；他們認(rèn)為，人類(lèi)微生物群中的細(xì)菌可能是磷霉素耐藥基因的儲(chǔ)備庫(kù)。2020年，瑞士有學(xué)者發(fā)現(xiàn)1株產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的磷霉素耐藥大腸埃希菌，攜帶1個(gè)新的質(zhì)粒介導(dǎo)的磷霉素耐藥基因，將其命名為fosL1。有研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)osL1蛋白是一種谷胱甘肽s轉(zhuǎn)移酶，對(duì)磷霉素高水平耐藥，與其他fosA類(lèi)家族成員有57%～63%的同源性；該研究在腸道沙門(mén)菌基因組中發(fā)現(xiàn)了另一個(gè)編碼FosL1-like酶的基因，這個(gè)酶被命名為FosL2，與FosL1具有96%的氨基酸同源性[28]。

3.4 FomA和FomB型激酶

有學(xué)者在磷霉素耐藥的鏈霉菌屬中發(fā)現(xiàn)了1種激酶，該種激酶不同于Fos金屬酶，可以修飾磷霉素，并使其毒性消失；這些酶分別由fomA和fomB基因編碼，并通過(guò)磷酸化使磷霉素失活，F(xiàn)omA將磷霉素轉(zhuǎn)化為一磷酸磷霉素，而FomB則以一磷酸磷霉素作為底物，轉(zhuǎn)化成二磷酸磷霉素[29-30]。

4 磷霉素的異質(zhì)性耐藥

抗菌藥物的異質(zhì)性耐藥是指同一克隆菌株中包含與主要細(xì)菌群體相比對(duì)抗菌藥物敏感性降低的亞群，細(xì)菌的異質(zhì)性可能會(huì)出現(xiàn)2種情況：一種是細(xì)菌主要群體和異質(zhì)性的細(xì)菌亞群的MIC都在敏感或耐藥的范圍內(nèi)，但存在差異；還有一種是細(xì)菌主要群體的MIC為敏感，而異質(zhì)性的細(xì)菌亞群為耐藥[31]。

有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)從磷霉素異質(zhì)性耐藥的肺炎鏈球菌中敲除murA1后，磷霉素異質(zhì)性耐藥也隨之消失了；進(jìn)一步的研究結(jié)果顯示，murA1是磷霉素的異質(zhì)性耐藥所必需的，但并不是唯一的相關(guān)因素[32]。磷霉素異質(zhì)性耐藥表型的發(fā)生和變化部分是由菌株的突變?cè)黾訉?dǎo)致的，因此，不僅在磷霉素藥物敏感性試驗(yàn)中，在其他抗菌藥物的藥物敏感性試驗(yàn)中，都應(yīng)考慮這些異質(zhì)性耐藥亞群體[33]。

5 總結(jié)與展望

磷霉素由于抑菌作用機(jī)制獨(dú)特而具有廣譜抗菌活性，對(duì)金黃色葡萄球菌和腸球菌等革蘭陽(yáng)性菌、大部分腸桿菌科細(xì)菌和非發(fā)酵菌均有良好的抗菌效果。隨著臨床上多重耐藥菌的播散，以及有效抗菌藥物的缺乏，磷霉素的優(yōu)點(diǎn)日益凸顯，其耐藥情況也受到越來(lái)越多的關(guān)注。磷霉素的耐藥機(jī)制包括murA基因突變、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白突變和缺失、磷霉素修飾酶以及異質(zhì)性耐藥。隨著磷霉素在臨床被越來(lái)越多地重新應(yīng)用，以及蛋白組學(xué)、全基因組測(cè)序等檢測(cè)技術(shù)的不斷成熟，在未來(lái)可能會(huì)發(fā)現(xiàn)更多新的耐藥基因和耐藥相關(guān)基因突變，我們也會(huì)持續(xù)關(guān)注相關(guān)研究。