HPLC結(jié)合酶解法測定蝦青素軟膠囊中蝦青素的含量

（.浙江創(chuàng)新生物有限公司，浙江 紹興 000；.新昌縣食品藥品檢驗檢測中心，浙江 新昌 500；.浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江 杭州 005；.浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠，浙江 新昌 500）

蝦青素酯由雨生紅球藻中提取，為單酯、雙酯及游離型，主要為3S,3'S異構(gòu)體，雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）是目前發(fā)現(xiàn)的游離蝦青素及其酯類含量最高的天然材料。來益牌雨生紅球藻提取物軟膠囊（又名蝦青素軟膠囊）是以雨生紅球藻提取物（又名蝦青素）為主要成分的保健食品，每100 g含標志性成分蝦青素1.5 g，具有增強免疫力的保健功能?，F(xiàn)代藥理試驗結(jié)果表明，蝦青素軟膠囊具有抗氧化、降血脂等功能[1-2]。目前對于蝦青素含量測定的方法較多[3-5]，但該產(chǎn)品中蝦青素主要為蝦青素酯的形式，常規(guī)高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）無法準確測定其中蝦青素含量，需用膽固醇酯酶水解，使蝦青素酯轉(zhuǎn)換為游離蝦青素進行測定，本文通過實驗研究建立了通過酶水解用HPLC法測定蝦青素軟膠囊中蝦青素含量的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

Agilent 1260型高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；METTLER-TOLEDO XS205DU型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；HC-3018型高速離心機（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）。

甲醇（百靈威科技有限公司，色譜純）、叔丁基甲基醚（百靈威科技有限公司，色譜純）；磷酸（Scharlab S.L，優(yōu)級純）；其余石油醚、丙酮、十水合硫酸鈉、無水硫酸鈉和鹽酸等均為分析純；蝦青素酯對照品（批號：F0J415）為美國藥典委員會提供；胡蘿卜醛（批號：40424）為Dr. Ehrenstorfer GmbH提供；膽固醇酯酶（批號：13M4047V）為SIGMA公司提供；來益牌蝦青素軟膠囊樣品為自制（批號為141001、141002、141003）。

1.2 色譜條件

YMC Carotenoid色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-叔丁基甲基醚-1%磷酸溶液，按表1進行梯度洗脫；采用紫外檢測器檢測，檢測波長為474 nm；流速為1.0 mL·min-1；柱溫25 ℃；進樣量為20 μL。

表1 梯度洗脫程序表

1.3 溶液配制

以下溶液配制需避光操作。

（1）緩沖溶液配制。稱取三（羥甲基）甲胺6.06 g，用750 mL水溶解，用1 mol/L鹽酸（9 mL→100 mL）調(diào)節(jié)pH值=7.0，加水到1 000 mL。

（2）酶解液配制。稱取膽固醇酯酶適量，用緩沖溶液溶解并稀釋制成每1 mL含4 U的溶液，該溶液需用前現(xiàn)配。

（3）內(nèi)標溶液配制。稱取胡蘿卜醛適量，用丙酮溶解并定量稀釋制成每1 mL含37.5 μg的溶液。

（4）對照品溶液配制。精密稱取雨生紅球藻提取的蝦青素酯對照品20 mg（含總蝦青素約2 mg），置于100 mL棕色量瓶中，用丙酮溶解并稀釋至刻度；吸取2.0 mL上述溶液與1.0 mL內(nèi)標溶液，置于離心管中，加入3.0 mL酶解液，混勻，于37 ℃水浴中加熱反應(yīng)45 min，加熱反應(yīng)期間，每隔10 min振搖一次，每次30 s。反應(yīng)完畢后，加1 g十水合硫酸鈉和2 mL石油醚，振搖30 s，然后以3 000 r·min-1離心3 min。將石油醚層轉(zhuǎn)移到玻璃瓶中，加入1 g無水硫酸鈉脫水，室溫下氮氣吹干石油醚，加3 mL丙酮，超聲溶解，過濾。

（5）供試品溶液。精密稱取供試品適量（含總蝦青素約2 mg），置于100 mL棕色量瓶中，用丙酮溶解并稀釋至刻度；吸取2.0 mL上述溶液與1.0 mL內(nèi)標溶液，置于離心管中，加入3.0 mL酶解液，混勻，于37 ℃水浴中加熱反應(yīng)45 min，加熱反應(yīng)期間，每隔10 min振搖一次，每次30 s。反應(yīng)完畢后，加1 g十水合硫酸鈉和2 mL石油醚，振搖30 s，然后以3 000 r·min-1離心3 min。將石油醚層轉(zhuǎn)移到玻璃瓶中，加入1 g無水硫酸鈉脫水，室溫下氮氣吹干石油醚，加3 mL丙酮，超聲溶解，過濾。

1.4 檢測方法

取對照品溶液與供試品溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以峰面積按內(nèi)標法計算供試品中蝦青素的含量。13-cis-蝦青素的保留時間約為9 min，全反式蝦青素的保留時間約為10 min，9-cis-蝦青素的保留時間約為14 min，胡蘿卜醛內(nèi)標物的保留時間約為17 min。按公式（1）計算對照品溶液和供試品溶液中總蝦青素峰面積與內(nèi)標峰面積比值：

式（1）中：P13-cis為13-cis-蝦青素峰面積；Ptrans為全反式蝦青素峰面積；P9-cis為9-cis-蝦青素峰面積；Pis為胡蘿卜醛內(nèi)標物峰面積。

以下式計算總蝦青素含量（以反式蝦青素計）：

式（2）中：RU為供試品溶液色譜圖中總蝦青素峰面積與內(nèi)標峰面積比值；RS為對照品溶液色譜圖中總蝦青素峰面積與內(nèi)標峰面積比值；CS為對照品溶液中蝦青素濃度，mg·mL-1；CU為供試品溶液濃度，mg·mL-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 專屬性試驗

取不含蝦青素的輔料按照供試品處理方法配制空白輔料溶液，再分別取內(nèi)標溶液、對照品溶液及供試品溶液進樣并記錄色譜圖，各響應(yīng)峰之間的分離度均大于1.5，空白輔料溶液及內(nèi)標溶液無干擾，結(jié)果見表2。空白溶液圖譜見圖1，對照品溶液圖譜見圖2，供試品溶液圖譜見圖3。

圖1 空白溶液圖譜

圖2 對照品溶液圖譜

圖3 供試品溶液圖譜

表2 專屬性試驗數(shù)據(jù)表

2.2 精密度試驗

取同一對照品溶液，連續(xù)進樣10次，記錄色譜圖，結(jié)果總蝦青素峰面積與內(nèi)標峰面積比值的RSD為1.3%，表明儀器精密度良好。取同一批樣品，依法平行操作制備6份供試品溶液，分別測定，結(jié)果蝦青素含量分別為2.05%、2.11%、2.06%、2.08%、2.11%和2.14%，平均值為2.09%，RSD為1.7%。不同分析員在不同時間使用不同儀器對同一批樣品進行測定，蝦青素含量分別為2.11%、2.09%、2.11%、2.18%、2.12%和2.18%，平均值為2.13%，RSD為1.8%，結(jié)果一致，表明方法精密度良好。

2.3 標準曲線的繪制和線性關(guān)系的考察

配 制 蝦 青 素 濃 度 分 別 為0.010 mg·mL-1、0.016 mg·mL-1、0.002 mg·mL-1、0.024 mg·mL-1和0.030 mg·mL-1的溶液，分別進樣并記錄色譜圖，以總蝦青素峰面積與內(nèi)標峰面積比值為縱坐標、濃度為橫坐標進行線性回歸，計算線性方程和相關(guān)系數(shù)，得到線性方程為Y=48.492 24X+0.012 06，線性相關(guān)系數(shù)為0.999 61，結(jié)果表明蝦青素在線性范圍內(nèi)與峰面積比值呈良好的線性關(guān)系。結(jié)果見表3。

表3 線性數(shù)據(jù)表

2.4 加樣回收率試驗

分別在供試品中加入限度水平50%、100%和150%的蝦青素，按照供試品溶液配制方法，每個濃度依法平行操作制備3份加標溶液，依法處理并測定，計算加樣回收率，結(jié)果見表4。結(jié)果表明該方法具有較好的準確度。

2.5 溶液穩(wěn)定性試驗

配制對照品溶液和供試品溶液，分別在避光冷藏的條件下放置4 h、8 h、12 h、和24 h后進樣檢測，放置后與0 h檢測結(jié)果相比，對照品溶液峰面積比值變化最大值為2%，軟膠囊樣品測定結(jié)果變化最大差值為0.04%，基本一致，表明溶液在避光冷藏的條件下24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 耐用性試驗

分別改變測試條件，如改變流動相的比例（甲醇 初 始 比 例81±1）、柱 溫（25±2）℃、流 速（1.0±0.2）mL·min-1及更換儀器色譜柱，依法測定，系統(tǒng)適應(yīng)性均符合要求，軟膠囊中蝦青素測定結(jié)果與標準條件下測定結(jié)果最大差值為0.08%，表明本方法具有良好的耐用性。

2.7 樣品含量測定

取來益牌蝦青素軟膠囊樣品，依法測定，結(jié)果見表5，均符合規(guī)定。

表5 來益牌蝦青素軟膠囊樣品中蝦青素含量測定結(jié)果表（單位：g/100 g）

3 結(jié)論

本品供試品與對照品均為蝦青素酯，為消除實驗過程中可能產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差，供試品與對照品的前處理過程完全一致，均為經(jīng)丙酮溶液提取、膽固醇酯酶水解，使其中的蝦青素酯轉(zhuǎn)化為游離態(tài)的蝦青素，經(jīng)HPLC條件優(yōu)化及色譜分離后，再用配有紫外檢測器的液相色譜儀進行測定，檢測時再供試品及對照品溶液中均添加胡蘿卜醛作為內(nèi)標物質(zhì)，以內(nèi)標法定量計算供試品中游離蝦青素的含量，結(jié)果準確可靠。

方法學(xué)驗證表明，建立的HPLC結(jié)合酶解法測定蝦青素軟膠囊中蝦青素含量的方法，具有良好的專屬性、精密度、線性和準確度，方法較為簡便，準確可靠，能夠比較好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，易于推廣應(yīng)用，適用于蝦青素軟膠囊中蝦青素含量的質(zhì)量控制。