高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定中華絨螯蟹中β-受體激動劑西馬特羅殘留量

◎ 劉 真，王玉梅

（南京市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)院，江蘇 南京 211198）

β-受體激動劑（β-興奮劑）屬于腎上腺類神經(jīng)興奮劑，早期用于治療哮喘，可有效松弛支氣管平滑肌，在獸藥治療領(lǐng)域發(fā)揮一定作用[1]。由于其作為飼料添加劑應(yīng)用在羊、肉雞和豬等的養(yǎng)殖中能夠減少動物脂肪的產(chǎn)生，增加肌肉蛋白含量[2-3]，而被錯誤地應(yīng)用于動物養(yǎng)殖中，俗稱“瘦肉精”，導(dǎo)致一系列因食用含有β-受體激動劑的食物而引起的中毒事件。目前，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第250號明確規(guī)定β-興奮劑（β-agonists）及其鹽、酯為食用動物中禁止使用的藥品[4]。西馬特羅（Cimaterol）屬于一種新一代的β-受體激動劑，2015年原國家食藥監(jiān)總局發(fā)布的65批次食品不合格通告中就有一批豬后臀尖檢出禁用藥物西馬特羅。如果長期食用含有西馬特羅的動物源性食品，將會損害身體健康甚至危及生命。

目前，西馬特羅的檢測方法研究主要集中在豬、牛、羊等畜肉產(chǎn)品上。肖雄楓等利用表面增強(qiáng)拉曼技術(shù)快速檢測新鮮豬肉中的β-受體激動劑含量（包括西馬特羅），檢出限為0.005 μg·g-1[5]。張燕等利用酶聯(lián)免疫分析方法測定了動物源性食品（豬肉、雞肉及牛肉樣品）中西馬特羅殘留量，檢出限為0.09 μg·L-1[6]。張連明等構(gòu)建了一種DNA輔助識別的西馬特羅分子印跡傳感器用于豬肉樣品中西馬特羅的檢測，檢出限為3.2×10-14mol·L-1[7]。LIU等用新型分子印跡聚合物萃取法結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀對豬肉組織中的β-受體激動劑進(jìn)行靈敏檢測，檢出限小于0.02 μg·kg-1[8]，但是針對中華絨螯蟹這一基質(zhì)類型中西馬特羅的檢測分析研究較少。本文建立了一種用于針對中華絨螯蟹中β-受體激動劑西馬特羅殘留量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS/MS）檢測方法，并利用該方法對市售實(shí)際樣品進(jìn)行了風(fēng)險監(jiān)測，積累了其西馬特羅殘留量的數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步加強(qiáng)中華絨螯蟹安全監(jiān)管提供了一定的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與標(biāo)準(zhǔn)品

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（Aglient 1290-6470 HPLC-MS/MS）：配有電噴霧離子源（ESI）；pH計(jì)（梅特勒-托利多）；渦旋振蕩器（Thermo Fisher）；離心機(jī)（Thermo Fisher LYNX 4000）；固相萃取柱過柱裝置（CNW 24位）；氮吹儀（萊伯泰科 MV5）；振蕩水浴鍋（金壇精達(dá) SHA-B）；0.22 μm有機(jī)系微孔濾膜（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司）；濾紙及玻璃漏斗。

0.2 mol·L-1乙酸鈉緩沖液：稱取13.6 g三水合乙酸鈉（分析純），溶解于500 mL水中，用適量乙酸調(diào)節(jié)pH值為5.2）。β-葡萄糖醛酸甙酶/芳基硫酸酯酶（≥10 000 units/mg）；5%氨水-甲醇溶液：移取50 mL氨水（分析純）于1 L容量瓶中，用甲醇（色譜級）定容至刻度，混勻）。SCX強(qiáng)陽離子交換柱（月旭科技，500 mg/6 mL。甲醇（色譜級）；0.1 mmol·L-1高氯酸-水溶液（準(zhǔn)確移取8.7 μL高氯酸，用水稀釋至1 L容量瓶中）；標(biāo)準(zhǔn)品：西馬特羅標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：54239-37-1）、克倫特羅-D9標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：129138-58-5）、沙丁胺醇-D3標(biāo)準(zhǔn)品（CAS：1219798-60-3），均購自天津阿爾塔公司。

1.2 樣品提取

1.2.1 提取

稱量2 g（精確到0.01 g）均質(zhì)的中華絨螯蟹樣品（僅均質(zhì)肉及性腺）于50 mL離心管中，加入20 mL 0.2 mol·L-1的乙酸鈉緩沖液及20 ng克倫特羅-D9內(nèi)標(biāo)溶液（即200 μL 100 ng/mL的克倫特羅-D9內(nèi)標(biāo)溶液）后充分渦旋混勻，加入β-葡萄糖醛酸甙酶/芳基硫酸酯酶50 μL，于37 ℃下過夜酶解（16 h），酶解液在10 000 r·min-1轉(zhuǎn)速下離心3 min，經(jīng)濾紙過濾后，定量移取10 mL濾液待凈化。

1.2.2 凈化

SCX凈化柱依次經(jīng)6 mL 5%氨水-甲醇溶液、6 mL甲醇、6 mL水、6 mL 0.1 mmol·L-1高氯酸-水溶液活化，將上述10 mL待凈化濾液上柱凈化，依次用2 mL甲醇及2 mL水分別淋洗，并徹底抽干小柱，最后用6 mL 5%氨水-甲醇溶液洗脫待測物，接收洗脫液，在40 ℃水浴下氮?dú)獯蹈?，定容? mL 10%甲醇-水溶液中，渦旋混勻，經(jīng)0.22 μm有機(jī)濾膜過濾后經(jīng)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀上機(jī)測定，內(nèi)標(biāo)法定量。

1.3 HPLC-MS/MS分析

1.3.1 色譜條件

色 譜 柱：Aglient Exlipse C18色 譜 柱（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；進(jìn)樣體積：1 μL；流速：0.3 mL·min-1；色譜柱溫：40 ℃；流動相：A（0.1%甲酸-水溶液）、B（甲醇）；流動相梯度洗脫程序?yàn)?～1 min，95%～75%A；1～2 min，75%～60%A；2～3 min，60%～95%A；3～5 min，95%A。

1.3.2 質(zhì)譜條件

干燥氣溫度：300 ℃；干燥氣流速：11 L·min-1；霧化氣壓力：35 psi；鞘氣溫度：325 ℃；鞘氣流速：11 L·min-1；毛細(xì)管電壓：4 000 V；電離方式：正模式掃描（ESI+）；監(jiān)測方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）；監(jiān)測離子對：西馬特羅（219.8/202.0、219.8/159.7、219.8/143.1、219.8/116.1），克倫特羅-D9（286/204.1、286/133.1）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

標(biāo)準(zhǔn)溶液及待測樣品溶液通過高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進(jìn)行分離測定，以西馬特羅及內(nèi)標(biāo)克倫特羅-D9的濃度比值作為橫坐標(biāo)，以西馬特羅及內(nèi)標(biāo)克倫特羅-D9的峰面積比值作為縱坐標(biāo)繪制西馬特羅的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用該標(biāo)準(zhǔn)曲線對待測樣品溶液中的目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性及定量離子的確定

西馬特羅及克倫特羅-D9的結(jié)構(gòu)式如圖1所示，西馬特羅及克倫特羅-D9的質(zhì)量數(shù)分別為219.28及286.248。利用安捷倫液質(zhì)聯(lián)用儀Optimizer軟件在ESI正模式條件下對兩種物質(zhì)的離子對進(jìn)行自動優(yōu)化，得到表1所示定量離子對及定性離子對，其中西馬特羅選取了響應(yīng)最佳的4對離子對，克倫特羅-D9選取了響應(yīng)最佳的2對離子對，其中西馬特羅選取4對離子對，是為了避免實(shí)際樣品檢測中假陽性的出現(xiàn)，當(dāng)實(shí)際樣品中4對離子對均出現(xiàn)，且保留時間及離子豐度比均與相當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品出峰情況相符合時，才判定實(shí)際樣品中西馬特羅的陽性檢出。西馬特羅及克倫特羅-D9的質(zhì)譜圖如圖2所示。

圖1 西馬特羅及克倫特羅-D9結(jié)構(gòu)式圖

表1 西馬特羅及克倫特羅-D9監(jiān)測離子對匯總表

圖2 西馬特羅及克倫特羅-D9質(zhì)譜圖

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 提取試劑及凈化柱的選擇

由于β-受體激動劑類物質(zhì)在動物源性食品中，易與動物體內(nèi)某些成分，如葡萄糖醛苷酸、硫酸等結(jié)合成為非游離態(tài)，所以對中華絨螯蟹中西馬特羅進(jìn)行提取時先進(jìn)行酶解反應(yīng)，利用β-葡萄糖醛酸甙酶/芳基硫酸酯酶將西馬特羅釋放為游離態(tài)，再進(jìn)行凈化測定[9-10]。已有研究表明β-葡萄糖醛酸甙酶/芳基硫酸酯酶最佳使用的溫度為37 ℃，最佳pH值為5.2，因此本實(shí)驗(yàn)參考已有文獻(xiàn)于37 ℃下酶解16 h，研究了用乙酸調(diào)節(jié)pH值為5.2的0.2 mol·L-1乙酸鈉-乙酸緩沖液及0.2 mol·L-1乙酸銨-乙酸緩沖液的提取效果，同時考察了兩款陽離子交換固相萃取柱（分別為強(qiáng)陽離子交換SCX固相萃取柱及混合型陽離子交換MCX固相萃取柱）的凈化效果，結(jié)果如圖3所示[9,11]。由圖3中柱狀圖可知，同樣的加標(biāo)水平條件下，使用乙酸鈉緩沖液及SCX凈化柱時提取得到的目標(biāo)物質(zhì)響應(yīng)最佳，且6次獨(dú)立重復(fù)性實(shí)驗(yàn)之間平行性最好；圖3（a）是經(jīng)過乙酸鈉緩沖液提取后，分別經(jīng)MCX凈化柱及SCX凈化柱凈化后，1 mL10%甲醇-水溶液復(fù)溶后的溶液對比，可見SCX凈化后的復(fù)溶液為無色，凈化效果更好，結(jié)合圖3（b），本實(shí)驗(yàn)選取乙酸鈉緩沖液作為提取試劑，選取SCX凈化柱進(jìn)行凈化實(shí)驗(yàn)。

圖3 提取試劑及凈化柱效果比對圖

此外，本實(shí)驗(yàn)對是否使用β-葡萄糖醛酸甙酶/芳基硫酸酯酶對加標(biāo)后的中華絨螯蟹樣品進(jìn)行酶解的檢測結(jié)果進(jìn)行了考察，兩組實(shí)驗(yàn)加標(biāo)量相同，均在37 ℃下孵育16 h，一組酶解，一組未加酶，上機(jī)后測定回收的西馬特羅峰面積，如圖4所示，酶解后目標(biāo)物質(zhì)響應(yīng)更佳，且6次重復(fù)性實(shí)驗(yàn)平行性更好。因此，本實(shí)驗(yàn)決定在前處理過程中采取酶解方案。

圖4 酶解及未酶解條件下的西馬特羅峰面積對比圖

2.2.2 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品的選擇

在β-受體激動劑的檢測中，最常使用的兩種內(nèi)標(biāo)分別是克倫特羅-D9及沙丁胺醇-D3[12]，本實(shí)驗(yàn)研究了這兩種內(nèi)標(biāo)對定量結(jié)果的影響。如圖5所示，保持兩種內(nèi)標(biāo)在樣品復(fù)溶液中的濃度均為10 ng·mL-1，外標(biāo)加標(biāo)水平為5.0 μg·kg-1時，內(nèi)標(biāo)法定量結(jié)果遠(yuǎn)比外標(biāo)法要好，均大于80%，比較而言，選擇回收率效果更好的克倫特羅-D9作為內(nèi)標(biāo)使用。

圖5 兩種內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果及外標(biāo)法定量結(jié)果比較圖（n=6）

2.2.3 洗脫溶劑的選擇

由于西馬特羅目標(biāo)物質(zhì)是在偏酸性環(huán)境下與強(qiáng)陽離子交換凈化柱結(jié)合從而保留在凈化柱上，因此選取了堿性有機(jī)溶劑進(jìn)行洗脫收集，本實(shí)驗(yàn)研究了不同體積比的氨水-甲醇溶液對目標(biāo)物質(zhì)的洗脫效果。氨水-甲醇溶液的比例分別為甲醇、2%氨水-甲醇、5%氨水-甲醇、8%氨水-甲醇、10%氨水-甲醇、20%氨水-甲醇，對比了內(nèi)標(biāo)法（內(nèi)標(biāo)為克倫特羅-D9）定量方式下（加標(biāo)濃度為7.968 ng·mL-1）不同洗脫溶劑的中華絨螯蟹中西馬特羅回收率情況，重復(fù)測定3次，結(jié)果如圖6所示。用內(nèi)標(biāo)法定量時，5%比例下洗脫效果最好，因此本實(shí)驗(yàn)決定采用5%氨水-甲醇溶液進(jìn)行洗脫。

圖6 內(nèi)標(biāo)法定量情況下不同體積比氨水-甲醇溶液洗脫效果圖

2.3 線性方程、測定低限及回收率、精密度

取適量西馬特羅（Cimaterol）標(biāo)準(zhǔn)溶液及克倫特羅-D9內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，結(jié)果表明，西馬特羅在0.498 0～199.200 0 ng·mL-1范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，見圖7，線性方程為y=2.760x+0.530 4，線性相關(guān)系數(shù)大于0.99，其中內(nèi)標(biāo)濃度均為10.00 ng·mL-1，測定低限為0.5 μg·kg-1，測定低限處西馬特羅信噪比大于10，滿足分析要求。

圖7 西馬特羅線性標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖

根據(jù)《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測》（GB/T 27404—2008）附錄F檢測方法的確認(rèn)要求，對食品中的禁用物質(zhì)，回收率考察應(yīng)在方法測定底限、2倍方法測定低限和10倍方法測定低限進(jìn)行3水平試驗(yàn)[13]。因此，針對農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第250號公告中的禁用物質(zhì)西馬特羅[4]，配制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線濃度范圍為0.498～9.960 ng·mL-1，線性方程為y=2.786x+0.009 7（R＞0.99），進(jìn)行了中華絨螯蟹基質(zhì)中1倍（0.5 μg·kg-1）、2倍（1.0 μg·kg-1）、10倍（5.0 μg·kg-1）方法測定低限上的3水平6平行方法學(xué)考察，具體結(jié)果見表2。由表2可知，不同加標(biāo)水平下的中華絨螯蟹基質(zhì)中西馬特羅的回收率范圍為87.06%～94.10%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為1.92%～8.03%，表明所構(gòu)建方法重復(fù)性好，回收率佳，可用于中華絨螯蟹中西馬特羅殘留量的準(zhǔn)確定量分析。

表2 中華絨螯蟹基質(zhì)中西馬特羅的平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的影響

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）具有選擇性高、靈敏度高，前處理方法多不需要衍生等優(yōu)勢特點(diǎn)，但是HPLC-MS/MS對大多檢測物質(zhì)而言具有一定的基質(zhì)效應(yīng)[14-15]，一般表現(xiàn)為較強(qiáng)的基質(zhì)抑制效應(yīng)，強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)會導(dǎo)致定量結(jié)果的偏離。本文采用文獻(xiàn)報道的基質(zhì)效應(yīng)計(jì)算方法[16]，計(jì)算公式為基質(zhì)效應(yīng)=(1-Am/A0)×100%，其中A0代表純?nèi)軇┲心繕?biāo)物質(zhì)的峰面積，Am代表中華絨螯蟹樣品基質(zhì)中同等濃度目標(biāo)物質(zhì)的峰面積，如果計(jì)算結(jié)果的絕對值大于50%，表明存在強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)；計(jì)算結(jié)果為負(fù)表明存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)；計(jì)算結(jié)果為正表明存在基質(zhì)抑制效應(yīng)[12,17]。本實(shí)驗(yàn)考察了中華絨螯蟹樣品中西馬特羅含量為10.0 μg·kg-1的基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)=(1-9 882/62 635)×100%=84.22%，表明中華絨螯蟹中西馬特羅的HPLC-MS/MS檢測存在很強(qiáng)的基質(zhì)抑制效應(yīng)，定量時需要采用內(nèi)標(biāo)法校正曲線或者基質(zhì)匹配校正曲線修正定量結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)采用克倫特羅-D9內(nèi)標(biāo)法定量。

2.5 實(shí)際樣品的檢測

使用本實(shí)驗(yàn)中的方法對江蘇省內(nèi)各地湖區(qū)和市場隨機(jī)抽樣購買的57批次中華絨螯蟹樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)57批次樣品中有3批次中檢出西馬特羅，檢出值質(zhì)量濃度范圍為1.70～2.86 μg·kg-1，陽性檢出率為5.26%，表明市場中可能存在中華絨螯蟹養(yǎng)殖過程中西馬特羅違規(guī)使用的風(fēng)險，需要引起重視和關(guān)注。

3 結(jié)語

本文研究了中華絨螯蟹中西馬特羅檢測的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，通過過夜酶解和乙酸鈉-乙酸緩沖液提取目標(biāo)物質(zhì)，經(jīng)強(qiáng)陽離子交換凈化柱凈化，氮吹復(fù)溶后上機(jī)，內(nèi)標(biāo)法定量。通過前處理?xiàng)l件的優(yōu)化，線性關(guān)系、測定低限、回收率、精密度及基質(zhì)效應(yīng)的考察，建立了一種中華絨螯蟹中西馬特羅準(zhǔn)確定量的HPLC-MS/MS方法，方法滿足檢測檢驗(yàn)分析的要求。按照所構(gòu)建方法對市場上57批次實(shí)際樣品進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)3批次陽性風(fēng)險樣品，檢出率為5.26%，含量為1.70～2.86 μg·kg-1，表明市售中華絨螯蟹存在西馬特羅違規(guī)使用的風(fēng)險，應(yīng)當(dāng)引起關(guān)注。本方法的建立可用于中華絨螯蟹中β-受體激動劑西馬特羅的風(fēng)險監(jiān)測和數(shù)據(jù)積累分析，有利于進(jìn)行相關(guān)的安全性評估。