一測多評法測定升提顆粒中8種成分的含量

畢 夏，遲 靜，劉志民，劉德軍

1. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院臨床藥學(xué)，沈陽 110003；2. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院制劑中心，沈陽 110003；3. 東北制藥集團股份有限公司，沈陽 110026

升提顆粒在臨床主要用于氣虛下陷、勞傷虛損所致的胃下垂、子宮下垂和脫肛等癥的治療，由黨參、黃芪、枳殼、白術(shù)和升麻5味中藥經(jīng)提取并加入適量輔料制備而成。方中黃芪補氣升陽、生津養(yǎng)血，為君藥；健脾益肺的黨參和健脾益氣的白術(shù)為臣藥；理氣寬中、行滯消脹的枳殼為佐藥；使藥升麻入脾經(jīng)、胃經(jīng)，升舉脾胃清陽之氣。諸藥合奏，共達升陽益氣之功效。升提顆粒質(zhì)量標(biāo)準WS-10891(ZD-0891)-2002[1]收載于國家藥品標(biāo)準，僅對枳殼所含柚皮苷進行定量檢測，由于中藥材及其制劑所含成分復(fù)雜多樣，多種成分共同作用，僅檢測1種成分不能全面控制產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量，多種指標(biāo)評價方式已越來越多地應(yīng)用于中藥及其制劑的質(zhì)量監(jiān)控中，但傳統(tǒng)的多種指標(biāo)評價方式存在對照品用量大、檢驗費用較高、個別對照品不易獲取及易分解或降解等缺點。一測多評法(quantitative analysis of multi-components with single-marker, QAMS)[2]建立其他成分與內(nèi)參物間的相對校正因子(relativecorrection factor, RCF)，利用內(nèi)參物含量和RCF計算其他成分的含量，實現(xiàn)對中藥材及其制劑多種指標(biāo)的同步檢測、分析，QAMS越來越多地應(yīng)用于中藥材[3]和中藥制劑[4]的質(zhì)量監(jiān)控中。本實驗采用高效液相QAMS，以升提顆粒方中君藥黃芪、臣藥黨參及佐藥枳殼為研究對象，對它們所含的成分進行分析，以黃芪所含的主要特征性成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花素，黨參所含的主要活性成分黨參炔苷和紫丁香苷以及枳殼所含的主要活性成分蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷為分析指標(biāo)，同時選取價廉易得、質(zhì)量穩(wěn)定的毛蕊異黃酮葡萄糖苷為內(nèi)參物，建立了升提顆粒中8種指標(biāo)成分的同步定量分析方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；Waters 2695型高效液相色譜儀(美國Waters公司)；CPA225D型電子分析天平(德國Sartorius公司)；CH-250型超聲波清洗器(北京創(chuàng)新德超聲電子研究所)；Agilent HC-C18液相反相柱(上海洽姆儀器科技有限公司)；Nucleodur C18液相反相柱(北京英萊克科技發(fā)展有限公司)；Kromasil C18液相反相柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，上海洽姆儀器科技有限公司)。

1.2 試藥

對照品紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷(批號依次為111574-201605、111920-201907、110722-201815、110721-202019和111857-201804，質(zhì)量分數(shù)依次為95.2%、96.8%、91.7%、95.3%和99.4%)，均購自中國食品藥品檢定研究院；對照品黨參炔苷、芒柄花素和蕓香柚皮苷(批號依次為PRF9121002、PRF8091225和PRF9062802，質(zhì)量分數(shù)依次為99.9%、99.9%和99.8%)均購自成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；升提顆粒分別購自金陵藥業(yè)股份有限公司南京金陵制藥廠(批號200419、200601和200812)和南京恒生制藥有限公司(批號09200601、09200902和09200905)，規(guī)格為每袋裝10 g；乙腈為色譜級(批號188670，美國Fisher公司)；水為純凈水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

選用Agilent HC-C18液相色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。柱溫設(shè)定為30 ℃。流動相為乙腈(A)-1 mL·L-1甲酸水溶液(B)。流速為1.0 mL·min-1。梯度洗脫(0～10 min，17.0%A；10～25 min，17.0%→50.0%A；25～50 min，50.0%A→80.0%A；50～60 min，80.0%A→17.0%A)。波長切換：0～25 min在254 nm處測定黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和芒柄花素[5-16]，25～60 min在283 nm處測定蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷[17-21]。進樣量10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備 精密稱取黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷對照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.598、0.106、0.272、0.418、0.974、4.890、0.362和2.508 mg·mL-1的儲備液。精密吸取上述儲備液2.5 mL，用甲醇稀釋20倍制成對照品溶液(黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的質(zhì)量濃度依次為29.9、5.3、13.6、20.9、48.7、244.5、18.1和125.4 μg·mL-1)。

2.2.2供試品溶液的制備 精密稱取升提顆粒細粉2.0 g，置于25 mL量瓶中，加甲醇適量，超聲處理30 min，放冷并用甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，續(xù)濾液即為升提顆粒供試品溶液。按照升提顆粒質(zhì)量標(biāo)準中的處方工藝分別制備缺少黨參、缺少黃芪、缺少枳殼的陰性樣品適量，再按照升提顆粒供試品溶液制備步驟制成黨參陰性供試品溶液、黃芪陰性供試品溶液和枳殼陰性供試品溶液。

2.3 方法學(xué)驗證

2.3.1系統(tǒng)適用性考察 精密吸取對照品溶液和供試品溶液，按照2.1項下色譜條件進樣分析，見圖1。升提顆粒中黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷與相鄰峰的分離度均符合要求(>1.5)；理論板數(shù)以目標(biāo)成分色譜峰計均>6 000；黨參陰性供試品溶液、黃芪陰性供試品溶液和枳殼陰性供試品溶液對指標(biāo)成分的檢測無干擾。

注：A.混合對照品溶液；B.升提顆粒供試品溶液；C.黨參陰性溶液；D.黃芪陰性溶液；E.枳殼陰性溶液；1.黨參炔苷；2.紫丁香苷；3.毛蕊異黃酮葡萄糖苷；4.芒柄花素；5.蕓香柚皮苷；6.柚皮苷；7.橙皮苷；8.新橙皮苷。

2.3.2線性關(guān)系及RCF考察 精密吸取2.2.1項下對照品儲備液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，稀釋制得6個系列質(zhì)量濃度的對照品溶液，依法進樣檢測，以對照品黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷峰面積為縱坐標(biāo)(y)，以質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)(x)，進行回歸，見表1；以毛蕊異黃酮葡萄糖苷為內(nèi)參物，建立其與黨參炔苷、紫丁香苷、芒柄花素、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷間的RCFs，見表2。fk/s=fk/fs=(Ck×As)/(Cs×Ak)(其中f、C和A分別表示RCF、質(zhì)量濃度和峰面積，k和s分別表示其他待測成分和內(nèi)參物)。

2.3.3精密度考察 吸取2.2.1項下對照品溶液連續(xù)進樣6次，計算得黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷峰的相對峰面積(relative standard deviation，RSD)分別為1.18%、1.30%、1.21%、1.04%、0.99%、0.56%、1.10%、0.67%，表明儀器精密度良好。

表1 升提顆粒中黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的回歸方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)

2.3.4穩(wěn)定性考察 取1份升提顆粒(批號200419)供試品溶液，于制備0、2、5、9、14和24 h分別進樣進行檢測，計算得升提顆粒供試品溶液中黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷峰的RSD值分別為1.27%、1.36%、1.29%、1.11%、1.06%、0.72%、1.23%、0.75%，表明供試品溶液于制備后24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.5重復(fù)性考察 精密稱取升提顆粒(批號200419)樣品6份制備供試品溶液并進樣進行檢測分析，計算得黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷含量的RSD值依次為1.60%、1.87%、1.81%、1.75%、1.69%、1.02%、1.58%、1.35%。

2.3.6加樣回收率考察 精密稱取已知黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷含量的升提顆粒(批號200419)1.0 g各9份，每組分別精密加入混合對照品溶液(黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的質(zhì)量濃度分別為0.392、0.049、0.153、0.272、0.531、3.181、0.216、1.712 mg·mL-1)0.8、1.0和1.2 mL，再按2.2.2項下方法處理得加樣供試品溶液，進樣檢測，結(jié)果黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的平均加樣回收率(RSD值)分別為99.02%(0.58%)、98.13%(1.46%)、99.35%(1.51%)、96.78%(1.40%)、99.39%(0.76%)、100.08%(0.62%)、97.71%(1.27%)、99.36%(0.85%)。

表2 毛蕊異黃酮葡萄糖苷對黨參炔苷、紫丁香苷、芒柄花素、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的RCFs

2.4 相對校正因子耐用性考察及各種成分色譜峰定位

2.4.1儀器和色譜柱 精密吸取2.2.1項下對照品溶液，按照2.1項下色譜條件進樣分析，對比考察了Agilent 1260型及Waters 2695型高效液相色譜儀，Agilent HC-C18、Nucleodur C18和Kromasil C18色譜柱(規(guī)格均為4.6 mm×250 mm，5 μm)對RCFs的影響。結(jié)果見表3。

表3 不同儀器、色譜柱對RCFs的影響

2.4.2流速 精密吸取2.2.1項下對照品溶液，按照2.1項下色譜條件進樣分析，分別考察了不同流速(0.8、0.9、1.0、1.1、1.2 mL·min-1)對RCFs的影響。結(jié)果見表4。

2.4.3柱溫 精密吸取2.2.1項下對照品溶液，在2.1項色譜條件下進樣分析，分別考察了不同柱溫(28、29、30、31、32 ℃)對RCFs的影響。結(jié)果見表5。

2.4.4目標(biāo)化合物色譜峰的定位 考察相對保留時間值(其他目標(biāo)化合物與內(nèi)參物毛蕊異黃酮葡萄糖苷保留時間的比值)在不同儀器和不同品牌色譜柱條件下的重復(fù)性，對目標(biāo)化合物進行色譜峰定位。結(jié)果見表6。

2.5 QAMS與外標(biāo)法測定結(jié)果的對比

取3批升提顆粒樣品，分別按2.2.2項下方法處理制得升提顆粒供試品溶液，按照2.1項下色譜條件進樣分析，采用外標(biāo)法(external standard method, ESM)和QAMS計算各成分的含量。結(jié)果見表7。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

為使待檢測的黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷得到良好的分離，本實驗重點考察了流動相乙腈-水[5-6,9-11]、乙腈-1 mL·L-1甲酸水溶液[7,19-20]、乙腈-1 mL·L-1磷酸水溶液[8,17-18]，結(jié)果顯示，用乙腈-水洗脫時，紫丁香苷含量因基線漂移無法正常檢測；用乙腈-1 mL·L-1磷酸水溶液洗脫時，柚皮苷色譜峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，無法準確積分。綜合色譜圖中基線噪音、目標(biāo)成分分離度、色譜峰形等因素，最終采用乙腈-1 mL·L-1甲酸水溶液[7,19-20]作為流動相。

表4 不同流速對RCFs的影響

表5 不同柱溫對RCFs的影響

表6 不同儀器、色譜柱對相對保留時間值的影響

3.2 提取方法的選擇

在制備升提顆粒供試品溶液時，以黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷綜合提取率為指標(biāo)，同時考慮雜質(zhì)干擾造成的影響，首先對提取溶劑(體積分數(shù)為70%的乙醇[5]、體積分數(shù)為95%的乙醇[11]、甲醇[6-7]、體積分數(shù)為75%的甲醇[8]和體積分數(shù)為50%的甲醇[9])進行了對比考察。結(jié)果見表8和圖2。結(jié)果顯示，以甲醇為提取溶劑時，8種成分含量相對較高，含量總和最高，故選取甲醇為提取溶劑。繼而對不同的提取方式(超聲提取和加熱回流提取)和提取時間(20、30、40和50 min)進行了摸索，最終確定使用甲醇超聲處理30 min制備升提顆粒供試品溶液。

表7 QAMS與ESM測得升提顆粒中各活性成分的含量 (n=3)

表8 提取溶劑對8種成分含量的影響

注：A. 體積分數(shù)70%乙醇；B. 體積分數(shù)95%乙醇；C. 甲醇；D. 體積分數(shù)75%甲醇；E. 體積分數(shù)50%甲醇；1. 黨參炔苷；2.紫丁香苷；3. 毛蕊異黃酮葡萄糖苷；4. 芒柄花素；5. 蕓香柚皮苷；6. 柚皮苷；7. 橙皮苷；8. 新橙皮苷。

本實驗建立了升提顆粒中黨參炔苷、紫丁香苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素、蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷含量的同步檢測方法。該方法簡單易操作、結(jié)果準確、重復(fù)性好，可為完善升提顆粒的質(zhì)量標(biāo)準、確保該藥品的質(zhì)量提供依據(jù)。