UPLC-MS/MS 法同時測定人血漿中泊沙康唑、氟康唑、伏立康唑的血藥濃度

張飛雨，張瑞霞，高慧兒，張弋

（1.天津醫(yī)科大學(xué)一中心臨床學(xué)院，天津 300192；2.天津市第一中心醫(yī)院藥學(xué)部，南開大學(xué)醫(yī)學(xué)院，天津 300192）

唑類抗真菌藥物的藥代動力學(xué)均受較多因素影響，導(dǎo)致患者服藥后個體間及個體內(nèi)血藥濃度差異較大，如泊沙康唑的吸收與飲食、劑型、患者生理病理狀態(tài)等因素有關(guān)[4]，氟康唑在中樞神經(jīng)系統(tǒng)真菌感染的患者或腎功能不全的患者體內(nèi)血藥濃度會顯著增加[5]，伏立康唑的代謝為非線性藥代動力學(xué)特征，血藥濃度變異性較大[6]。在英國醫(yī)學(xué)真菌學(xué)協(xié)會出版的《抗真菌治療藥物監(jiān)測指南》中推薦FLU、POS 和VRC 均應(yīng)根據(jù)患者實際用藥情況進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測[7]。本研究旨在建立同時測定3 種三唑類抗真菌藥物的LC-MS/MS 方法，節(jié)約成本，并為臨床抗真菌藥物的合理應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器、藥品及試劑

1.1.1 儀器 Waters ACQUITY UPLC I-Class 系統(tǒng)和Xevo TQD 質(zhì)譜儀，BY-G20 普通高速離心機(jī)（北京白洋醫(yī)療器械有限公司）；UMV-2 多管渦旋混合儀（北京優(yōu)晟儀器有限公司）；SB-5200DT 型數(shù)控超聲波清洗器（寧波新芝生物科技股份有限公司）。

1.1.2 藥品及試劑 FLU（中國食品藥品檢定研究院，純度99.8%，批號100314-201906）；POS（美國TRC公司，純度98%，批號3-JLW-13-1）；VRC（中國食品藥品檢定研究院，純度99.8%，批號100862-201903）；泊沙康唑-D4（POS-D4，美國TRC 公司，同位素豐度96.3%，批號12-MRS-161-1）；氟康唑-D4（FLU-D4，美國TRC 公司，同位素豐度99.5%；批號7-MMH-92-2）；伏立康唑-D3（VRC-D3，美國TRC 公司，同位素豐度99.3%，批號5-JUZ-42-1）；乙酸銨（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）；甲酸（上海安譜科學(xué)儀器有限公司）；甲醇（德國默克股份兩合公司）；實驗用水為廣州屈臣氏蒸餾水。

1.2 色譜及質(zhì)譜條件

1.2.1 色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLC BEH C18柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），流動相A 為0.1%甲酸，2 mmol/L 乙酸銨水溶液，流動相B 為0.1%甲酸，2 mmol/L 乙酸銨甲醇溶液，梯度洗脫，流速為0.5 mL/min，進(jìn)樣量10 μL。

1.2.2 質(zhì)譜條件 采用多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM），正離子模式，電噴霧離子源（ESI）掃描。錐孔電壓、碰撞能量、毛細(xì)管電壓、離子源溫度及脫溶劑氣溫度等質(zhì)譜參數(shù)見表1。

根據(jù)腎虛性質(zhì)偏于陰虛或陽虛選用六味地黃丸（仲景宛西制藥有限公司，生產(chǎn)批號：151010）和金匱腎氣片（特一藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，生產(chǎn)批號：20150902），六味地黃丸每次8粒，每日3次，金匱腎氣片每次4片，每日2次?？诜?0天為1個療程，連續(xù)治療3個療程。

表1 POS、FLU、VRC 及其內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜檢測參數(shù)Tab 1 Mass spectrometric detection parameters of posaconazole，voriconazole，fluconazole and their internal standards

1.3 溶液及血樣樣品的配制

1.3.1 POS、FLU 和VRC 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 精密稱取POS 0.041 36 g、FLU 0.164 15 g、VRC 0.040 17 g，分別置于10 mL 棕色容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制濃度為4 136、16 415、4 017 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。取適量儲備液，用甲醇稀釋為質(zhì)量濃度分別為1 641.5、413.6、401.7 μg/mL 的混合對照品溶液。取混合對照品溶液，用甲醇倍比稀釋為梯度工作液，POS 濃度為413.60、165.44、82.72、33.09、15.50、6.62、1.65 μg/mL，F(xiàn)LU 濃度為1 641.50、656.60、328.30、131.32、65.66、26.26、6.57 μg/mL，VRC 濃度為401.70、160.68、80.34、32.14、16.07、6.43、1.61 μg/mL。同時用甲醇配制質(zhì)控樣品溶液，POS、FLU、VRC濃 度 分 別 為330.88、66.18、2.65 μg/mL，1 313.20、262.64、10.51 μg/mL，321.36、64.27、2.57 μg/mL。所有溶液-20 ℃避光保存，臨用時取用。

1.3.2 內(nèi)標(biāo)工作液的配制 精密稱取POS-D4、FLU-D4、VRC-D3 各1.0 mg 分別置于100 mL 棕色容量瓶中，甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，配制成含POS-D4、FLU-D4、VRC-D3 均為10μg/mL 的內(nèi)標(biāo)儲備液。取適量儲備液，100 μL 甲酸，用甲醇稀釋為濃度分別為0.2、1.0、0.2 μg/mL 的混合內(nèi)標(biāo)工作液。-20°C 避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品的配制 分別精密量取“1.3.1”項下梯度工作液各10 μL，加入空白人血漿190 μL，渦旋1 min，制成POS 濃度范圍為0.083~20.680 μg/mL，F(xiàn)LU 0.328~82.075 μg/mL，VRC 0.080~20.085 μg/mL 的混合血漿樣品。分別精密量取“1.3.1”項下質(zhì)控樣品溶液各10 μL，加入空白人血漿190 μL，渦旋1 min，制成POS、FLU、VRC 濃度分別為0.132、3.309、16.544 μg/mL，0.525、13.132、65.660 μg/mL，0.129、3.214、16.068 μg/mL 低、中、高3 個濃度的混合質(zhì)控血漿樣品。

1.3.4 血漿樣品預(yù)處理 取血漿樣品200 μL，加入600 μL 內(nèi)標(biāo)工作液，渦旋1 min，13 000 r/min 離心10 min，上清液過0.22 μm 微孔濾膜后取300 μL，加入900 μL 純水，混勻置于進(jìn)樣小瓶中，取10 μL 進(jìn)樣分析。

1.4 方法學(xué)驗證

1.4.1 專屬性 分別取空白血漿，空白血漿加入POS、FLU、VRC 標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)溶液，患者服用POS、FLU、VRC 后的血漿樣品，按照“1.3.4 項”處理后進(jìn)樣。

1.4.2 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 用不同來源的空白血漿制備POS、FLU、VRC 低、中、高3 個濃度的質(zhì)控樣品，按照“1.3.4 項”處理，將對照品與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值記為A；用甲醇替代上述過程中的血漿，加入內(nèi)標(biāo)，將混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備液稀釋為與A 中質(zhì)量濃度相同的3 個濃度的質(zhì)控樣品，將對照品與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值記為B；取不同來源的空白血漿按照“1.3.4 項”步驟處理后加入混合標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，用甲醇稀釋為與上述質(zhì)量濃度相同的3 個濃度質(zhì)控樣品，對照品和內(nèi)標(biāo)峰面積比值記為C。A/C 值為各化合物的提取回收率，C/B 為基質(zhì)效應(yīng)。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和最低定量限 取含POS 濃度范圍為0.083~20.680 μg/mL，F(xiàn)LU 為0.328~82.075 μg/mL，VRC 為0.080~20.085 μg/mL 的混合血漿樣品，每一濃度各制備3 份，按照“1.3.4 項”處理后進(jìn)樣。分別以待測物與對應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積比值（Y）對POS、FLU、VRC 質(zhì)量濃度（X）作線性回歸分析（W=1/C）。

1.4.4 精密度和準(zhǔn)確度 分別取POS、FLU、VRC 低、中、高3 個濃度的質(zhì)控樣品，每個濃度平行制備5 份，按照“1.3.4 項”處理，連續(xù)3 d 每天制備一批并進(jìn)樣分析，計算批內(nèi)及批間精密度（RSD）和準(zhǔn)確度（RE）。

1.4.5 穩(wěn)定性 配制POS、FLU、VRC 低、中、高3個濃度的質(zhì)控樣品，每個濃度平行制備3 份，分別考察室溫放置24 h、進(jìn)樣器（10℃）放置8 h、4℃放置24 h、-20℃凍融循環(huán)3 次和-20℃放置30 d 后的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 專屬性 進(jìn)樣后色譜圖顯示，F(xiàn)LU、VRC 、POS的保留時間分別為1.34、2.15、2.40 min?？瞻籽獫{中的內(nèi)源性物質(zhì)在相應(yīng)藥物及內(nèi)標(biāo)色譜峰保留時間內(nèi)均無干擾峰，各物質(zhì)色譜圖見圖1。

圖1 POS、FLU、VRC 和內(nèi)標(biāo)POS-D4、FLU-D4、VRC-D3 在血漿中的色譜圖Fig 1 Representative chromatography of POS FLU，VRC and POS-D4，F(xiàn)LU-D4，VRC-D3 in plasma

2.2 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 各待測物3 種濃度的基質(zhì)效應(yīng)為94.5%~148.8%，RSD<14.2%；提取回收率在59.7%~77.5%，RSD<14.0%。結(jié)果見表2。

表2 POS、FLU、VOC 標(biāo)準(zhǔn)人血漿樣品內(nèi)標(biāo)歸一化的提取回收率及基質(zhì)效應(yīng)（n=6）Tab 2 The normalized extraction recovery rate and matrix effect of the internal standard of POS，F(xiàn)LU，VOC standard human plasma samples（n=6）

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和最低定量限 結(jié)果表明，人血漿中POS、FLU、VRC 濃度分別在0.083~20.680、0.328~82.075、0.080~20.085 μg/mL 范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2。

圖2 POS、FLU、VRC 在血漿樣品中的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 2 The standard curve for the plasma sample of POS，F(xiàn)LU，VRC

2.4 精密度和準(zhǔn)確度 各待測物的批內(nèi)及批間RE為-8.61%~10.16%，RSD<7.60%，見表3。

表3 POS、FLU、VRC 在血漿中的批內(nèi)及批間RSD、RE（n=5）Tab 3 The RSD and RE within and between batches for POS，F(xiàn)LU and VRC in plasma sample（n=5）

2.5 穩(wěn)定性 各待測物3 個不同濃度的質(zhì)控樣品分別在室溫放置24 h、進(jìn)樣器（10℃）放置8 h、4℃冰箱放置24 h、凍融循環(huán)3 次、-20℃冰箱冷凍30 d 后依然能夠保持穩(wěn)定，RSD 均<10.69%，見表4。

表4 POS、FLU、VRC 在不同條件下的穩(wěn)定性（n=3）Tab 4 Stability of POS，F(xiàn)LU，VRC at different storage conditions（n=3）

3 討論

POS、FLU、VRC 均呈弱堿性，為改善使用純水、純甲醇作為流動相的色譜峰拖尾及響應(yīng)強(qiáng)度弱等現(xiàn)象，兩相中均加入0.1%甲酸、2 mmol/L 乙酸銨以調(diào)節(jié)流動相pH，促進(jìn)分析物在ESI 源下以正離子形式存在，響應(yīng)強(qiáng)度增加，峰形良好。流動相中若甲醇比例過高時，最先被分離出峰的FLU 峰形較寬，而增加水相比例則導(dǎo)致出峰慢，分析時間較長，綜合考慮選用梯度洗脫。

考慮到同位素內(nèi)標(biāo)作為LC-MS/MS 定量分析方法的首選，本方法選用了POS-D4、FLU-D4、VRC-D3 3 種同位素內(nèi)標(biāo)，與待測物POS、FLU、VRC 的化學(xué)性質(zhì)極為相似。同位素內(nèi)標(biāo)與待測物在前處理過程中，色譜分離、離子化過程中變化完全相同，只有在質(zhì)譜的質(zhì)量分析器中才可將它們分離，可最大限度的消除基質(zhì)效應(yīng)等分析方法的誤差。方法學(xué)驗證結(jié)果顯示可將內(nèi)標(biāo)與待測物色譜峰完全分離且峰形較好。

由于POS、FLU、VRC 均含三唑基團(tuán)，具有一定的堿性，本實驗選用適用于堿性化合物分析的ESI 正離子源，結(jié)合自動及手動調(diào)諧結(jié)果，分別選擇3 種待測物及其相應(yīng)內(nèi)標(biāo)化合物響應(yīng)最強(qiáng)的離子對作為MRM掃描模式中的掃描離子對，分別手動優(yōu)化各離子對的碰撞能量及錐孔能量使其靈敏度最高。

患者血漿樣本中含有大量蛋白質(zhì)，進(jìn)樣前需進(jìn)行血漿樣品前處理去除蛋白，以免污染堵塞色譜柱。目前常用的生物樣本前處理方法有固相萃取法、液-液萃取法、蛋白沉淀法等。因固相萃取法成本較高、批次間重現(xiàn)性較差，液-液萃取法操作繁瑣費(fèi)時且需要消耗大量有機(jī)溶劑，本方法選擇了操作簡便的蛋白沉淀法，該法常用的沉淀劑有甲醇、乙腈、高氯酸等，因甲醇成本較低且方法學(xué)考察結(jié)果顯示，患者血漿樣本經(jīng)甲醇沉淀蛋白處理后，待測物的液相圖譜中無干擾峰存在，可達(dá)到生物樣本分析要求。

筆者分別比較了加入600、800、1 000 μL 內(nèi)標(biāo)溶液后的色譜峰，最終選取響應(yīng)強(qiáng)度最高的600 μL作為本實驗中內(nèi)標(biāo)溶液的加入量，同時可達(dá)到較好的蛋白沉淀效果。因樣品溶劑甲醇與流動相初始梯度中的高比例水相極性相差較大，導(dǎo)致最先出峰的FLU 出現(xiàn)前沿峰，故在進(jìn)樣前于樣品中加入與初始流動相同比例的純凈水，混勻后進(jìn)樣，前沿峰消失。

本研究建立的液質(zhì)方法可同時測定POS、FLU、VRC 3 種三唑類抗真菌藥在人血漿中的藥物濃度，既節(jié)約成本，又操作便捷，凡服用以上3 種藥物的患者均可采用本方法進(jìn)行血藥濃度的測定，無需切換實驗方法，節(jié)省了平衡色譜柱、配制新的流動相等時間；準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好、專屬性強(qiáng)，可滿足POS、FLU、VRC藥動學(xué)研究的需求，為臨床藥學(xué)服務(wù)提供參考。