MSS4在缺血再灌注損傷大鼠腎臟中的表達(dá)及作用*

譚 微，鄧軍輝，吳志芬，鄭盧權(quán)，付碧瓊，楊聚榮

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院腎內(nèi)科 401120)

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是全球的公共健康問題，每年約1 300萬人發(fā)生AKI，我國成人AKI的發(fā)病率約為11.6%，兒童20.0%，嚴(yán)重AKI患者病死率高達(dá)50%，全球每年約200萬人因AKI死亡[1-2]，如何改善AKI預(yù)后是當(dāng)前全球面臨的挑戰(zhàn)。

MSS4，又名PIP5K1B，屬于磷脂酰肌醇4-磷酸5-激酶(phosphatidylinositol-4-phosphate 5-kinase，PIP5K)家族成員，廣泛分布于哺乳動(dòng)物體內(nèi)。通過與小G蛋白結(jié)合在體內(nèi)代謝中發(fā)揮廣泛的重要作用[3-4]。既往研究報(bào)道MSS4與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)密切相關(guān)[5-8]，EMT是AKI后腎小管上皮細(xì)胞修復(fù)和腎纖維化的重要因素，其表型及標(biāo)志物的改變?cè)贏KI后早期即可檢測(cè)[9-10]。目前MSS4在AKI后的表達(dá)及作用均未知。因此，本研究擬通過大鼠缺血再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury，IRI)構(gòu)建AKI模型，檢測(cè)MSS4及其相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)變化，了解MSS4在AKI腎臟中的表達(dá)變化及作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

30只無特殊病原體(SPF)級(jí)雄性SD大鼠，8周齡，體重220 g左右，購買并飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，環(huán)境溫度為(25±2) ℃，濕度為50%～70%，12 h光照陰暗交替。

1.1.2試劑與儀器

RIPA裂解液、PMSF、脫脂奶粉、抗體稀釋液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠制備試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自碧云天生物有限公司；Schiff染液、蘇木素染液、DAPI購自中山金橋生物有限公司；一抗：MSS4(1∶200，SC-514169，美國Santa公司)，波形蛋白(Vimentin，1∶200，#5741，美國Cell Signaling Technology公司)，α-SMA(1∶500，#19245，美國Cell Signaling Technology公司)，β-actin(1∶5 000，AC004，武漢愛博泰克生物科技有限公司)；二抗：抗鼠IgG(H+L,Alexa Fluor?594 Conjugate,1∶1 000，#8890，美國Cell Signaling Technology公司)；抗兔IgG(H+L，Alexa Fluor?488 Conjugate，1∶1 000，#4412，美國Cell Signaling Technology公司)；lipofectamin 3000(美國Thermo Fisher公司)。

1.2 方法

1.2.1大鼠IRI模型構(gòu)建

30只大鼠分為假手術(shù)組(5只)和IRI組(25只)。大鼠予以腹腔注射3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)麻醉，IRI組做背部兩側(cè)切口，游離雙側(cè)腎蒂，使用血管夾夾閉雙側(cè)腎蒂，觀察腎臟顏色變黑后計(jì)時(shí)45 min，移去血管夾，確認(rèn)腎臟顏色變鮮紅后，縫合兩側(cè)切口；假手術(shù)組大鼠做背部兩側(cè)切口，游離雙側(cè)腎蒂后縫合切口。IRI組術(shù)后0、12、24、48、72 h再次腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，經(jīng)大鼠眼眶采血2 mL，并打開胸腔行心臟灌注后，取腎組織標(biāo)本，去除腎臟包膜，部分腎臟固定于4%多聚甲醛，用于腎臟病理組織染色或免疫熒光染色，剩余部分保存于-80 ℃冰箱，用于Western blot檢測(cè)。

1.2.2細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型構(gòu)建

采用大鼠腎小管上皮細(xì)胞NKR-52E細(xì)胞構(gòu)建缺氧/復(fù)氧模型，NKR-52E細(xì)胞生長至80%，分為對(duì)照組和復(fù)氧組，對(duì)照組繼續(xù)原培養(yǎng)基培養(yǎng)，復(fù)氧組更換為無糖無血清培養(yǎng)基，于1% O2、94% N2、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱(Thermo SCIENTIFIC)中培養(yǎng)6 h，然后更換為上述正常培養(yǎng)基，置正常培養(yǎng)箱中，分別繼續(xù)培養(yǎng)0、12、24、48、72 h。

1.2.3腎功能檢測(cè)

采集的血液于離心機(jī)離心(3 000 r/min，10 min)后取上清液，采用自動(dòng)分析儀(德國Beckman 5800)檢測(cè)大鼠血尿素氮、血肌酐水平。

1.2.4腎組織PAS染色

腎組織用4%多聚甲醛固定過夜，沖洗、脫水、石蠟包埋后切片，行PAS染色觀察腎臟病理損傷程度。將切片浸入高碘酸氧化液中10～20 min，蒸餾水洗2次；Schiff液染色10～30 min，流水沖洗5 min；蘇木素染細(xì)胞核3～5 min，在鹽酸乙醇中分化，自來水洗至細(xì)胞核變藍(lán)；然后脫水、透明、封固。雙盲情況下由2名腎臟病理醫(yī)師在200倍光學(xué)顯微鏡下觀察并評(píng)分，每個(gè)標(biāo)本至少觀察10個(gè)不重復(fù)視野。腎小管損傷的嚴(yán)重程度由組織學(xué)評(píng)分系統(tǒng)量化：0分代表沒有損傷，1分(0%～<11%)和2分(11%～<21%)為輕度損傷，3分(21%～<41%)和4分(41%～<61%)為中度損傷，5分(61%～75%)和6分(>75%)為重度損傷。

1.2.5免疫熒光染色

大鼠腎臟組織直接OCT包埋，冰凍切片機(jī)切片6 μm，空氣干燥2 min后，-20 ℃儲(chǔ)存。染色前自-20 ℃取出，室溫放置使其干燥后，用冷丙酮于4 ℃固定10 min，0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后加入1.2%過氧化氫作用30 min，PBS清洗后加入0.3% Triton X-100作用30 min，加入稀釋至工作濃度的一抗，4 ℃過夜，次日清洗后加入熒光二抗，室溫避光孵育1 h，清洗后DAPI 染核5 min，抗淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

大鼠腎小管上皮細(xì)胞爬片后行免疫熒光染色。4%多聚甲醛(PBS配制)固定20 min，除去多聚甲醛清洗后加入0.5% Triton X-100室溫通透20 min，清洗后3% H2O2孵育15 min，清洗后3% H2O2孵育15 min，清洗后10%與二抗同源的血清封閉0.5 h，滴加足夠量適宜濃度的一抗，4 ℃孵育過夜，次日清洗后加入熒光二抗，室溫避光孵育1 h，清洗后DAPI 染核5 min，取出爬片吸干其上液體，抗淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察。使用ImageJ軟件對(duì)免疫熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量。各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6Western blot檢測(cè)

各組大鼠腎組織經(jīng)充分碾磨后，加入含1% PMSF的RIPA(碧云天)冰上裂解40～60 min，4 ℃ 13 400 r/min離心15 min，取上清液采用BCA法測(cè)定蛋白濃度后，將上清液與SDS緩沖液混勻，100 ℃加熱6 min至蛋白變性。采用SDS-PAGE電泳法從每個(gè)樣品中分離出80 μg蛋白，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上，使用5%脫脂牛奶常溫封閉1.5 h，4 ℃孵育一抗過夜。次日洗膜后加入相應(yīng)的二抗，室溫避光孵育2 h。再次避光洗膜后，采用雙色紅外激光成像系統(tǒng)(Odyssey CLX，Gene Company Limited)顯影。使用ImageJ軟件對(duì)蛋白條帶的強(qiáng)度進(jìn)行定量。各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.7轉(zhuǎn)染siRNA

NKR-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)染小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA) MSS4沉默MSS4，siRNA MSS4正向序列5′-GCU UUA CUC AAA CAG CAA ATT-3′，作為對(duì)照的NKR-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA negative control(NC)，siRNA NC正向序列5′-UUU GCU GUU UGA GUA AAG CTT-3′。隨后，分別將NKR-52E細(xì)胞接種貼壁，密度達(dá)到70%無血清饑餓12 h，將稀釋的siRNA和Lipo 3000試劑混合后室溫放置，形成siRNA/lipo 3000混合物，每個(gè)6孔板中加入1.9 mL無血清培養(yǎng)基及100 μL siRNA/lipofectamin 3000混合液，37 ℃溫育24 h后再缺氧6 h復(fù)氧48、72 h，免疫熒光染色以α-SMA表達(dá)水平變化來表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 IRI后腎功能及PAS染色腎損傷情況

與假手術(shù)組比較，IRI組血尿素氮、血肌酐水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，12 h最高，72 h恢復(fù)正常。腎組織PAS染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組腎小管上皮細(xì)胞排列緊密整齊，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，刷狀緣完整，管腔清晰；IRI組12 h后可見腎小管上皮細(xì)胞大量壞死、脫落，基底膜裸露，至72 h仍可見少部分小管上皮細(xì)胞排列紊亂、間質(zhì)增寬。腎小管損傷評(píng)分12 h最高，72 h仍高于假手術(shù)組，見圖1。

A:血尿素氮；B:血肌酐；C:腎小管損傷評(píng)分；D:腎臟PAS染色(×200)；a：P<0.05，與假手術(shù)組比較。

2.2 IRI后腎臟中MSS4的表達(dá)變化

與假手術(shù)組比較，IRI組48、72 h的MSS4表達(dá)水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

A:Western blot蛋白條帶；B:MSS4灰度值與β-actin灰度值的比值柱形圖；a：P<0.05，與假手術(shù)組比較。

2.3 IRI后腎臟MSS4的定位及表達(dá)情況

腎組織免疫熒光顯示，與Vimentin定位一致，MSS4主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞，且IRI組48、72 h的MSS4及Vimentin表達(dá)水平高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。

A:免疫熒光染色(×400)；B：免疫熒光強(qiáng)度分析；a：P<0.05，與假手術(shù)組比較。

2.4 NKR-52E細(xì)胞缺氧/復(fù)氧后MSS4、α-SMA的表達(dá)情況

細(xì)胞免疫熒光顯示，隨復(fù)氧時(shí)間的延長，復(fù)氧組MSS4、α-SMA表達(dá)水平增加，復(fù)氧組72 h明顯高于0 h(P<0.05)。對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間與復(fù)氧組72 h一致，復(fù)氧組72 h MSS4、α-SMA表達(dá)仍高于對(duì)照組(P<0.05)，見圖4。

A：免疫熒光染色(×800)；B:免疫熒光強(qiáng)度分析；a：P<0.05，與復(fù)氧組0 h比較。

2.5 沉默MSS4對(duì)NKR-52E細(xì)胞缺氧/復(fù)氧后α-SMA表達(dá)的影響

轉(zhuǎn)染siRNA MSS4的NKR-52E細(xì)胞MSS4蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。細(xì)胞免疫熒光染色顯示，NKR-52E細(xì)胞缺氧6 h復(fù)氧48、72 h后，轉(zhuǎn)染siRNA MSS4的NKR-52E細(xì)胞α-SMA表達(dá)水平降低(P<0.05)，見圖5。

A:Western blot蛋白條帶;B:MSS4灰度值與β-actin灰度值的比值柱形圖;C:α-SMA免疫熒光強(qiáng)度分析;D:免疫熒光染色(×1 000)；a：P<0.05，與siRNA NC比較。

3 討 論

臨床上AKI的最常見病因是IRI，以雙側(cè)受累為主。動(dòng)物模型中可采取單側(cè)或雙側(cè)腎動(dòng)脈夾閉構(gòu)建AKI模型[12]，本研究中采用夾閉雙側(cè)腎動(dòng)脈45 min成功構(gòu)建了IRI誘導(dǎo)的大鼠AKI模型，IRI組大鼠血尿素氮、血肌酐水平在術(shù)后12 h明顯升高，72 h恢復(fù)。

腎小管上皮細(xì)胞是AKI時(shí)關(guān)鍵的靶細(xì)胞，也是修復(fù)的主要參與者。AKI后腎小管上皮細(xì)胞的修復(fù)分為完全修復(fù)和不完全修復(fù)，前者腎臟功能、結(jié)構(gòu)完全恢復(fù)，后者腎小管上皮細(xì)胞修復(fù)障礙，啟動(dòng)纖維化[11]。EMT是指腎小管上皮細(xì)胞失去上皮細(xì)胞的表型和特性，成為間充質(zhì)細(xì)胞，從而具有強(qiáng)大的增殖和多向分化潛能。在完全修復(fù)中，AKI后腎小管上皮細(xì)胞首先受累發(fā)生去分化，細(xì)胞骨架的完整性和極性破壞，上皮細(xì)胞標(biāo)志(E-鈣黏蛋白、急性單核細(xì)胞等)消失，出現(xiàn)Vimentin及其他間充質(zhì)細(xì)胞的表型，隨后在各種修復(fù)機(jī)制的作用下發(fā)生去分化的腎小管上皮細(xì)胞增殖、移行，并進(jìn)行再分化，從而再生修復(fù)，Vimentin等隨即消失，而E-鈣黏蛋白重新表達(dá)，腎小管結(jié)構(gòu)重建，腎臟功能恢復(fù)。而在不完全修復(fù)中，腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT后不能恢復(fù)上皮細(xì)胞表型，從而轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞，分泌大量膠原蛋白、層粘連蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)，參與腎間質(zhì)纖維化[12-13]。既往研究表明，AKI后早期即可觀察到EMT表型及細(xì)胞形態(tài)的改變。在小鼠缺血再灌注AKI模型中，再灌注72 h上皮表型E-鈣黏蛋白表達(dá)降低，間質(zhì)細(xì)胞表型α-SMA表達(dá)明顯升高，在HK-2細(xì)胞的缺氧/復(fù)氧24 h后也觀察到α-SMA的表達(dá)上調(diào)[9]；盲腸結(jié)扎穿刺48 h及脂多糖處理HK-2細(xì)胞48 h模擬體內(nèi)外膿毒血癥AKI模型，亦觀察到α-SMA、Vimentin升高，E-鈣黏蛋白表達(dá)降低，腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)分支及間隙增加、紡錘形等間質(zhì)細(xì)胞形態(tài)[10]。本研究在缺血再灌注體內(nèi)和缺氧/復(fù)氧體外模型中均觀察到AKI后72 h α-SMA、Vimentin的表達(dá)明顯升高，證實(shí)了腎小管上皮細(xì)胞EMT的發(fā)生。

進(jìn)一步探究MSS4的表達(dá)及其與EMT的關(guān)系，免疫熒光雙染色MSS4和Vimentin，發(fā)現(xiàn)兩者均定位于腎小管上皮細(xì)胞，表達(dá)水平具有一致性，均在AKI后72 h明顯增加。體外實(shí)驗(yàn)中，缺氧/復(fù)氧后MSS4與α-SMA的表達(dá)高峰一致，利用siRNA沉默MSS4，可抑制大鼠腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)α-SMA。證實(shí)MSS4參與調(diào)控AKI后腎小管上皮細(xì)胞EMT，但其機(jī)制尚不清楚。

MSS4是1988年在酵母中發(fā)現(xiàn)的，其與哺乳動(dòng)物體內(nèi)的PIP5K同源，是具有雙重底物特異性的一種脂質(zhì)激酶，除了可將PI(4)P轉(zhuǎn)換為PI(4，5)P2、PI(3)P轉(zhuǎn)換為PI(3,4)P2以外，還為磷酸肌醇代謝與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架之間提供了聯(lián)系，若MSS4缺乏，細(xì)胞在極化細(xì)胞生長過程中無法形成肌動(dòng)蛋白，且無法正確定位其細(xì)胞骨架。EMT以細(xì)胞骨架的重塑為基礎(chǔ)，在此過程中，MSS4調(diào)控肌動(dòng)蛋白絲裝配在維持細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)中起著重要作用。EMT發(fā)生時(shí)，一旦細(xì)胞受到上皮向間質(zhì)形態(tài)轉(zhuǎn)變信號(hào)， 接收的信息以力的形式發(fā)生傳遞，細(xì)胞內(nèi)骨架開始重新排列，細(xì)胞需要承受嚴(yán)重的變形，細(xì)胞形狀的改變導(dǎo)致內(nèi)部骨架網(wǎng)絡(luò)重新排列。上皮細(xì)胞的角蛋白逐漸減少直至被骨架蛋白、波形蛋白代替。在關(guān)于腫瘤細(xì)胞的研究中已明確，可通過調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架重塑來調(diào)節(jié)EMT[5-8]。MSS4還參與凋亡的調(diào)控[15]，具有明顯的抗凋亡作用。受外界刺激后，細(xì)胞內(nèi)MSS4的表達(dá)水平迅速改變，上調(diào)的MSS4通過與真核細(xì)胞翻譯起始復(fù)合物的成員及具有明顯促凋亡特性的蛋白質(zhì)相互作用，來防止細(xì)胞程序性死亡。而對(duì)凋亡的抵抗與EMT的發(fā)生密切相關(guān)[16-17]。早期的研究還發(fā)現(xiàn)，MSS4還可以通過驅(qū)動(dòng)MT1-MMP/整合素蛋白復(fù)合物的協(xié)同作用，調(diào)節(jié)MT1-MMP在新形成的絲狀偽足和片狀脂質(zhì)體中的表達(dá)和激活。這促進(jìn)了前MMPs向MMPs的轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致ECM蛋白的裂解和重塑[18]。M1-MMP的激活進(jìn)一步誘導(dǎo)EMT的發(fā)生[19]。但上述MSS4與EMT的相關(guān)機(jī)制均是在腫瘤細(xì)胞中研究的，在腎臟中MSS4對(duì)EMT的調(diào)控機(jī)制還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究尚存在一定局限性，僅證實(shí)了MSS4與EMT的相關(guān)性，未能明確其宏觀作用為促修復(fù)還是纖維化。在今后的實(shí)驗(yàn)中，需構(gòu)建不同損傷程度的動(dòng)物模型，并延長AKI后觀察時(shí)間，以進(jìn)一步明確MSS4在AKI后的作用。

綜上所述，在IRI所致大鼠AKI腎臟中，MSS4表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞，AKI后72 h明顯增加，參與調(diào)控腎小管上皮細(xì)胞EMT，但其調(diào)節(jié)機(jī)制及在AKI遠(yuǎn)期進(jìn)程中的作用尚待進(jìn)一步研究。