亞甲藍對阿爾茨海默癥大鼠認知功能障礙及RhoA/ROCK2通路的影響

趙慶利，吳 師，周裕凱

阿爾茨海默癥（Alzheimer's disease，AD）是一種進行性腦疾病，以細胞外β淀粉樣蛋白（β-amyloid，Aβ）沉積、細胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結和線粒體功能障礙為特征，導致不可逆轉的記憶缺陷、異常行為和人格改變［1］。目前，AD還沒有治愈的方法，治療只能改善癥狀，并不影響疾病的進展。RhoA/Rho相關的卷曲螺旋蛋白激酶2（Rho-associated coiled coilforming protein kinase 2，ROCK2）信號通路與神經(jīng)系統(tǒng)的生理作用密切相關，抑制RhoA/ROCK2信號通路，可改善老年小鼠的認知功能障礙［2］。亞甲藍（methylene blue）是一種具有悠久臨床應用歷史的雜環(huán)芳香族化合物，先前的研究表明，亞甲藍對多種神經(jīng)退行性疾病具有神經(jīng)保護作用，可明顯改善AD大鼠的記憶力退化［3］。多奈哌齊作為第2代膽堿酯酶抑制劑，在臨床上對輕中度阿爾茨海默癥有較好療效。因此本研究擬通過Aβ誘導，構建AD大鼠模型，以多奈哌齊為陽性藥物，探究不同劑量亞甲藍對AD大鼠的神經(jīng)保護作用以及對RhoA/ROCK2信號通路的影響。

1 材料及方法

1.1動物 成年雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量（250±20）g左右，購自蘭州大學實驗動物中心，許可證號：SYXK（甘）2018-0002。實驗開始前，將大鼠置于室溫（22±1）℃、明暗周期12 h、濕度60%的環(huán)境中，在通風良好的地方適應性飼養(yǎng)1周，自由采食飲水。本研究中使用的所有程序都是在實驗動物的指導原則下進行的，并得到本院倫理委員會的批準。

1.2主要試劑 亞甲藍，純度≥98%，貨號：M8030，購自北京索萊寶生物科技有限公司。鹽酸多奈哌齊片，國藥準字H20070181，購自衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司。丙二醛（MDA）檢測試劑盒（S0131），超氧化物歧化酶（SOD）活性檢測試劑盒（S0101），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（PT516），白細胞介素1β（IL-1β）ELISA試劑盒（PI303）均購自上海碧云天科技有限公司。乙酰膽堿酯酶（Ache）測試盒（A024）購自南京建成生物工程研究所。RhoA抗體 （ab187027）、ROCK2抗體（ab125025）及β-肌動蛋白抗體（ab8226）均購自美國Abcam公司。

1.3實驗儀器 腦立體定位儀（美國Stoelting公司），全自動生化分析儀（上海帝博思生物科技有限公司），光學顯微鏡（日本尼康公司），蛋白電泳儀、半干轉膜儀（美國Bio-Rad公司）；凝膠成像儀（Miulab公司）等。

1.4實驗方法

1.4.1AD動物模型的制備 按照文獻［4］的方法，在大鼠側腦室注射Aβ1-42寡聚物誘導AD大鼠模型。首先將大鼠麻醉并置于腦立體定向儀中，通過不銹鋼套管將Aβ1-42寡聚物注入雙側腦室中，每側5μl，位置為前囟點后1.1 mm，矢狀縫線外側2.2 mm，硬腦膜以下3.0 mm處。手術7 d后采用行為學測試以判斷AD模型是否構建成功。空白對照組大鼠通過使用上述坐標，在雙側腦室中注入同劑量媒介體作為對照。實驗過程中，若動物死亡，則進行補充，以保障每組不少于10只。

1.4.2動物分組及樣本采集 造模成功后，將AD大鼠分成模型組、亞甲藍低劑量組、亞甲藍高劑量組和多奈哌齊（陽性對照）組，每組10只。另外10只大鼠為空白對照組。分別給予亞甲藍低劑量組、高劑量組2和8 mg/kg的劑量腹腔注射，多奈哌齊組給予1.5 mg/kg的劑量腹腔注射［5］?？瞻讓φ战M和模型組給予等量生理鹽水腹腔注射，連續(xù)28 d。各組大鼠于給藥后第29～33 d進行Morris水迷宮檢測。然后收集尾靜脈血清置于-20℃中保存。從每組大鼠中隨機選擇5只，先用生理鹽水進行灌注，然后用10%甲醛快速固定海馬組織。每組中另外5只大鼠處死后分離海馬組織，液氮冷凍保存于-80℃進行生化分析。

1.4.3Morris水迷宮 Morris水迷宮實驗在一個直徑94 cm，深31 cm的圓形白色水池中進行，水深30 cm，溫度為25℃，用25 cm2的有機玻璃正方形作為逃生平臺，放置在水池中心距水池邊緣15 cm處，淹沒在水面以下1 cm處。將池分成4個相等的象限，先將大鼠在平臺上放置30 s，然后放置在起始點。如果這些大鼠在90 s內(nèi)到達平臺，它們將被允許在平臺上停留30 s。如果在90 s未能到達平臺，則將大鼠引導至平臺并停留30 s，訓練5 d，每天3次，每隔10 min進行1次訓練。隱藏平臺測試完成后，先將平臺移出水池。然后將大鼠放在距離最初平臺最遠的象限，記錄大鼠穿越原平臺位置的次數(shù)和在目標象限游泳的時間。

1.4.4生化指標的檢測 利用試劑盒檢測大鼠血清中丙二醛（MDA）和超氧化物歧化酶（SOD）水平。利用乙酰膽堿酯酶（Ache）比色法檢測大鼠海馬組織中Ache活性。利用ELISA試劑盒檢測海馬組織勻漿中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素1β（IL-1β）濃度。具體操作根據(jù)試劑盒說明書進行。

1.4.5海馬組織病理學檢測 大鼠海馬組織在10%甲醛中放置24 h后，脫水透明，制作石蠟切片，厚度為4μm，然后使用蘇木精-伊紅（HE）染色，然后將海馬切片固定在玻片上風干，在光學顯微鏡下觀察海馬組織的形態(tài)學變化。

1.4.6TUNEL染色觀察海馬神經(jīng)細胞凋亡 對1.4.5制備的石蠟切片進行TUNEL染色，凋亡細胞的細胞核呈棕色，凋亡指數(shù)以隨機選取的100個神經(jīng)細胞中凋亡細胞的百分比計算。用圖像分析系統(tǒng)計算凋亡細胞陽性率。

1.4.7Western blot檢測大鼠海馬組織中RhoA、ROCK2蛋白表達水平 取-80℃中保存的0.25 g海馬組織，用含蛋白酶抑制劑的500μl RIPA裂解緩沖液制備總蛋白裂解液，在4°C下12 000 r/min離心5 min得到上清液。同時，提取總蛋白并用BCA法測定總蛋白濃度。將50μg蛋白裂解產(chǎn)物煮沸5 min，SDS-PAGE分離后轉移到PVDF膜上。然后，使用硫代巴比妥酸緩沖液封閉膜，并與RhoA、ROCK2一抗（稀釋倍數(shù)1：1 000）在4℃下過夜孵育。接下來，將膜與辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗孵育2 h，用ECL試劑盒顯影，以β-肌動蛋白為內(nèi)參，分析蛋白條帶相對表達量。

1.5統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，統(tǒng)計數(shù)據(jù)以（±s）表示，Morris水迷宮用重復測量的方差分析，組間多重比較用Games-Howell法；其余數(shù)據(jù)用單因素方差分析，組間多重比較用LSD法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1亞甲藍對AD大鼠認知功能的影響 與空白對照組相比，AD大鼠表現(xiàn)出明顯延長的逃避潛伏期，減少的跨平臺次數(shù)和目標象限內(nèi)游泳時間，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組相比，亞甲藍低、高劑量組和多奈哌齊組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，跨平臺次數(shù)和目標象限內(nèi)游泳時間顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。亞甲藍高劑量組和多奈哌齊組大鼠的水迷宮測試結果的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 Wistar大鼠莫里斯水迷宮測試結果（±s）

表1 Wistar大鼠莫里斯水迷宮測試結果（±s）

注：與對照組相比，a P＜0.05；與模型組相比，b P＜0.05；與亞甲藍低劑量組相比，c P＜0.05

?

2.2亞甲藍對AD大鼠血清中MDA和SOD水平的影響 與空白對照組相比，模型組大鼠血清中SOD水平顯著降低，MDA活性顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組相比，亞甲藍低、高劑量組和多奈哌齊組大鼠血清中SOD水平顯著升高，MDA活性顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。亞甲藍高劑量組和多奈哌齊組大鼠血清中MDA和SOD水平的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 亞甲藍對AD大鼠血清中MDA和SOD水平的影響（±s）

表2 亞甲藍對AD大鼠血清中MDA和SOD水平的影響（±s）

注：與對照組相比，a P＜0.05；與模型組相比，b P＜0.05；與亞甲藍低劑量組相比，c P＜0.05

?

2.3亞甲藍對AD大鼠海馬組織中的Ache活性、TNF-α和IL-1β水平的影響 與空白對照組相比，模型組大鼠海馬組織中Ache活性、TNF-α和IL-1β水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組相比，亞甲藍低、高劑量組和多奈哌齊組大鼠海馬組織中Ache活性、TNF-α和IL-1β水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。亞甲藍高劑量組和多奈哌齊組大鼠海馬組織中Ache活性、TNF-α和IL-1β水平的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 亞甲藍對AD大鼠海馬組織中的Ache活性、TNF-α和IL-1β水平的影響（±s）

表3 亞甲藍對AD大鼠海馬組織中的Ache活性、TNF-α和IL-1β水平的影響（±s）

注：與對照組相比，a P＜0.05；與模型組相比，b P＜0.05；與亞甲藍低劑量組相比，c P＜0.05

?

2.4亞甲藍對AD大鼠海馬組織病理變化的影響空白對照組大鼠海馬組織結構正常，細胞排列緊密有序，細胞核大而圓，染色淺，核仁清晰，無明顯神經(jīng)細胞變性和損傷的跡象。模型組AD大鼠神經(jīng)細胞排列疏松，數(shù)量減少，梭形，形態(tài)不規(guī)則，胞漿凝聚導致細胞體積縮小，核固縮，染色深染。亞甲藍低、高劑量組和多奈哌齊組大鼠海馬組織中細胞排列較為緊密有序，細胞數(shù)量增加，核仁較為清晰，有明顯的改善。見圖1。

圖1 Wistar大鼠海馬組織HE染色圖（200×）

2.5亞甲藍對AD大鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡的影響 與空白對照組（8.15±2.43）%相比，模型組大鼠海馬組織中細胞凋亡率顯著升高 （65.82±10.59）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組相比，亞甲藍低、高劑量組和多奈哌齊組大鼠海馬組織中細胞凋亡率顯著降低（40.73±11.61）%、（15.24±8.45）%、（17.47±9.02）%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。亞甲藍高劑量組和多奈哌齊組大鼠海馬組織中細胞凋亡率的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.6亞甲藍對AD大鼠海馬組織中RhoA、ROCK2蛋白表達水平的影響 與空白對照組相比，模型組大鼠海馬組織中RhoA、ROCK2蛋白表達水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與模型組相比，亞甲藍低、高劑量組和多奈哌齊組大鼠海馬組織中RhoA、ROCK2蛋白表達水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。亞甲藍高劑量組核和多奈哌齊組大鼠海馬組織中RhoA、ROCK2蛋白表達水平的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 亞甲藍對AD大鼠海馬組織中RhoA、ROCK2蛋白表達水平的影響（±s）

表4 亞甲藍對AD大鼠海馬組織中RhoA、ROCK2蛋白表達水平的影響（±s）

注：與對照組相比，a P＜0.05；與模型組相比，b P＜0.05；與亞甲藍低劑量組相比，c P＜0.05

?

3 討論

AD是一種進行性神經(jīng)退行性疾病，表現(xiàn)為大腦功能障礙，影響語言、認知和情緒［6］。在過去的幾十年里，AD的研究取得了巨大的進展，但其確切病因仍不清楚，目前還沒有有效的治療或預防策略。亞甲藍是一種歷史悠久的藥物，藥理復雜，已證實，亞甲基對AD、帕金森病、中風、神經(jīng)病變以及體外星形膠質(zhì)細胞和肝細胞缺氧性損傷模型具有神經(jīng)保護作用［7］。另外，亞甲藍可以減少淀粉樣斑塊和神經(jīng)原纖維纏結的形成，并能部分保護線粒體功能［8］。本研究在大鼠雙側腦室注射Aβ1-42寡聚物后發(fā)現(xiàn)，AD大鼠神經(jīng)細胞排列疏松，形態(tài)不規(guī)則，海馬神經(jīng)元凋亡率增加，水迷宮檢測結果顯示大鼠逃避潛伏期延長，跨平臺次數(shù)和目標象限內(nèi)游泳時間減少，揭示AD大鼠模型構建成功。AD大鼠在亞甲藍給藥后，認知能力明顯改善，鏡下可見海馬神經(jīng)細胞數(shù)量增加，細胞凋亡率降低，表明亞甲藍對AD大鼠具有明顯的神經(jīng)保護作用。

乙酰膽堿是一種膽堿能神經(jīng)遞質(zhì)，被認為與學習和記憶密切相關［9］。Ache是乙酰膽堿水解的關鍵酶，Ache活性增強導致乙酰膽堿的水解增加，從而導致膽堿能神經(jīng)傳遞的下降，這與AD呈正相關［10］。在AD大鼠海馬組織中，Ache活性升高，經(jīng)亞甲藍和多奈哌齊給藥后，明顯逆轉了這種現(xiàn)象。其中，高劑量亞甲藍與多奈哌齊對AD大鼠的治療效果相當。氧化應激是AD發(fā)生和發(fā)展的重要因素。自由基的過量產(chǎn)生會導致生物大分子的氧化損傷，導致神經(jīng)元損傷和認知障礙［11］。此外，氧化應激參與神經(jīng)病理改變，包括神經(jīng)元凋亡、神經(jīng)原纖維纏結、線粒體功能障礙和淀粉樣蛋白沉積，這些都參與了AD的發(fā)病機制［12］。在本研究中，亞甲藍減輕了AD大鼠血清中的SOD活性，提高了MDA水平，表明亞甲藍減輕了AD大鼠體內(nèi)的氧化應激反應。神經(jīng)炎癥是AD的早期事件，在AD的發(fā)病機制中起著關鍵作用，同樣參與淀粉樣蛋白沉積、神經(jīng)元損傷、膽堿能功能障礙和死亡［13］。在本研究中，亞甲藍可顯著降低AD大鼠海馬組織中TNF-α和IL-1β水平。IL-1β和TNF-α是腦內(nèi)最常被研究的促炎細胞因子，導致AD學習和記憶障礙［14］。此外，神經(jīng)炎癥被認為是慢性氧化應激的結果，繼發(fā)于神經(jīng)元損傷。自由基的過度產(chǎn)生可能會影響轉錄因子的數(shù)量，導致促炎細胞因子的過度產(chǎn)生［15］。因此，推測抗氧化和/或抗炎治療可被認為是治療AD的潛在策略。

RhoA屬于Rho家族，是一種GTP酶。當小膠質(zhì)細胞受到受損神經(jīng)元和促炎因子的刺激時，它們會激活RhoA及其下游效應激酶ROCK（兩種亞型ROCK1和ROCK2）。ROCK2主要存在于神經(jīng)中樞并高度表達［16］。ROCK2在抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)生長中起關鍵作用，并被多種抑制性受體激活［17］。因此，ROCK2相關信號通路的抑制對于改善神經(jīng)炎癥具有十分重要的作用。本研究中，AD大鼠海馬組織中RhoA、ROCK2蛋白表達水平升高，表明大鼠腦組織受到損傷后，RhoA/ROCK2信號通路被激活。而AD大鼠在亞甲藍給藥治療后，RhoA、ROCK2蛋白表達水平明顯降低，表明亞甲藍可抑制RhoA/ROCK2信號通路，減輕AD大鼠的神經(jīng)炎癥。

綜上所述，亞甲藍對AD大鼠具有明顯的神經(jīng)保護作用，可能是通過抑制RhoA/ROCK2信號通路，減輕神經(jīng)炎癥和氧化應激反應。然而，AD的發(fā)病機制十分復雜，尚不完全清楚，因此，亞甲藍對AD大鼠的藥效作用仍有待于進一步研究。