RNA 表達(dá)分析在法醫(yī)學(xué)體液斑鑒定中的應(yīng)用與展望

王守宇，陶瑞旸，侯一平，李成濤

1.復(fù)旦大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，上海 200032；2.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 司法部司法鑒定重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)，上海 200063；3.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)研究所，四川 成都 610041

在法醫(yī)物證學(xué)領(lǐng)域，對(duì)于犯罪現(xiàn)場(chǎng)遺留的生物樣本進(jìn)行DNA 分析已經(jīng)成為案件偵破過(guò)程中不可或缺的一個(gè)環(huán)節(jié)。然而，除確定樣本來(lái)源個(gè)體外，準(zhǔn)確識(shí)別樣本來(lái)源于何種組織或體液對(duì)于犯罪現(xiàn)場(chǎng)的重建同樣具有至關(guān)重要的作用。在性侵害等類型的案件中，犯罪性質(zhì)的確定以及案件的調(diào)查和起訴尤其依賴這類證據(jù)。得益于各類DNA 遺傳標(biāo)記的廣泛應(yīng)用和檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，目前以個(gè)體識(shí)別為目的的法醫(yī)學(xué)檢測(cè)已能夠達(dá)到較為理想的效果，然而與之相比，體液類型鑒定在實(shí)際應(yīng)用中仍面臨很多挑戰(zhàn)[1]。

傳統(tǒng)的基于理化性質(zhì)或細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察的預(yù)實(shí)驗(yàn)以及免疫學(xué)檢測(cè)雖然操作簡(jiǎn)單，但可區(qū)分的體液類型有限，并且存在種屬特異性低及假陽(yáng)性率高等問(wèn)題[2-4]。為了提升體液鑒定的實(shí)際應(yīng)用效能，包括DNA甲基化模式分析、拷貝數(shù)變異分析、微生物特征分析和RNA 表達(dá)模式分析在內(nèi)的一系列新方法在過(guò)去數(shù)十年的諸多法醫(yī)相關(guān)研究中被提出，并逐漸顯現(xiàn)出替代傳統(tǒng)方法的趨勢(shì)[5-8]。在這些方法中，RNA 表達(dá)模式分析在體液斑鑒定領(lǐng)域尤其受到青睞，其相關(guān)應(yīng)用也得到了極大的發(fā)展。由于具有組織特異性表達(dá)的特征，一些信使RNA（messenger RNA，mRNA）、微小RNA（microRNA，miRNA）、環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）和Piwi相互作用RNA（Piwi-interacting RNA，piRNA）被視為十分具有應(yīng)用前景的體液斑鑒定候選分子標(biāo)記[9-11]。本文旨在對(duì)近年來(lái)RNA 分子標(biāo)記在體液斑鑒定領(lǐng)域的研究進(jìn)展進(jìn)行歸納和總結(jié)，對(duì)已發(fā)表研究中得到有效驗(yàn)證的RNA 分子標(biāo)記及相應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)和數(shù)據(jù)分析方法進(jìn)行回顧，以期為相關(guān)的法醫(yī)學(xué)鑒定及研究提供借鑒。

1 RNA 分子標(biāo)記種類及其在法醫(yī)學(xué)體液斑鑒定領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀

1.1 mRNA 分子標(biāo)記

人體由數(shù)十億個(gè)細(xì)胞組成，根據(jù)其生理功能，各類型細(xì)胞內(nèi)的mRNA 表達(dá)均在轉(zhuǎn)錄水平上受到特定的調(diào)控，這種差異也導(dǎo)致了mRNA 在特定細(xì)胞或組織中獨(dú)特的表達(dá)模式[12]。作為基因表達(dá)的中間產(chǎn)物，mRNA 承擔(dān)著重要的生理功能，雖然在總量上其僅占總RNA 的3%～5%，但是在種類上mRNA 卻呈現(xiàn)出極大的多樣性。

在法醫(yī)學(xué)體液斑鑒定領(lǐng)域，mRNA 是最早被提出具有應(yīng)用潛力并進(jìn)行了廣泛評(píng)估的一類分子標(biāo)記。根據(jù)人類轉(zhuǎn)錄組學(xué)相關(guān)研究提供的不同組織轉(zhuǎn)錄模式信息，法醫(yī)學(xué)研究者在最初的研究中篩選并檢驗(yàn)了一些候選分子標(biāo)記在各類組織或體液中的表達(dá)量[13-15]。隨后，針對(duì)法醫(yī)相關(guān)檢材進(jìn)行的mRNA 表達(dá)分析，進(jìn)一步鑒定了一批在相關(guān)體液中穩(wěn)定表達(dá)的分子標(biāo)記[16-17]。附表1 展示了在既往研究中被證明具有較好體液鑒定效能的mRNA 分子標(biāo)記及較早將其用于檢測(cè)體系構(gòu)建的相關(guān)研究[9，16-30]。目前，這些mRNA 分子標(biāo)記的特異性和檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏度已在大量研究中得到廣泛評(píng)估，其中包括歐洲D(zhuǎn)NA 分析組（European DNA Profiling Group，EDNAP）和法醫(yī)RNA 分析組（Forensic RNA Profiling Group，F(xiàn)oRNAP）成員實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展的一系列基于毛細(xì)管電泳[27，29，31-33]和高通量測(cè)序檢測(cè)[34-35]的合作研究。一些法醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室也基于相關(guān)研究結(jié)果構(gòu)建了適用于多種體液類型推斷的mRNA 復(fù)合檢測(cè)體系，并將其應(yīng)用于實(shí)際案件中。

為了減少樣品消耗并簡(jiǎn)化工作流程，一些研究組也提出了RNA 和DNA 共同提取的方法[36-39]。共提取方法使得對(duì)同一份樣本進(jìn)行RNA 分析以識(shí)別體液類型的同時(shí)，也可行DNA 分析對(duì)檢材來(lái)源進(jìn)行個(gè)體識(shí)別。在檢測(cè)效果方面，盡管有研究在一些污染或陳舊樣本中成功獲取了RNA 分析結(jié)果[19，40]，然而在實(shí)際案件中，許多法醫(yī)物證樣本的檢測(cè)結(jié)果并不夠理想，難以進(jìn)行有效的mRNA 表達(dá)分析。這主要是因?yàn)樯餀z材中的mRNA 除了面臨內(nèi)源性降解之外，其他一些環(huán)境因素如紫外線照射、高濕度與高溫環(huán)境以及微生物等也會(huì)影響其穩(wěn)定性[41]。

1.2 miRNA 分子標(biāo)記

miRNA 是法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中另一類獲得廣泛研究的潛在RNA 分子標(biāo)記，其在體液斑鑒定中的應(yīng)用最早由HANSON等[10]提出。miRNA的長(zhǎng)度通常為21～25個(gè)核苷酸，作為一類參與基因表達(dá)調(diào)控的非編碼小RNA，其主要通過(guò)與特定序列mRNA 的3′非翻譯區(qū)（3′-untranslated region，3′-UTR）結(jié)合誘導(dǎo)目標(biāo)基因在翻譯水平上的調(diào)控[42]。針對(duì)miRNA 表達(dá)譜的相關(guān)研究[43]表明，人體不同組織和細(xì)胞中miRNA 的表達(dá)情況存在一定差異。此外，目前已有近2 000 種人類miRNA序列在相關(guān)研究中被識(shí)別[44]。由于豐富的多樣性以及較短的長(zhǎng)度，miRNA 可能特別適合對(duì)污染或陳舊樣本等降解程度較為嚴(yán)重的檢材進(jìn)行法醫(yī)學(xué)分析[45-46]。

在體液斑鑒定方面，目前對(duì)于miRNA 分子標(biāo)記最全面的研究是由SAUER 等[47]完成的。該課題組使用微陣列芯片技術(shù)檢測(cè)了miRBase v18.0 中所有人類miRNA 在體液中的表達(dá)情況。去除表現(xiàn)出高于背景信號(hào)強(qiáng)度的miRNA 后，在不到20%的樣品中剩下的743 個(gè)miRNA 被納入進(jìn)一步分析。隨后，36 個(gè)在芯片數(shù)據(jù)中顯示出不同樣本間最高表達(dá)量差異的候選miRNA 分子標(biāo)記被用于實(shí)時(shí)定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）驗(yàn)證。最終研究者提出了一種僅使用4 個(gè)miRNA（hsa-miR-891a-5p、hsamiR-144-3p、hsa-miR-203a-3p 和hsa-miR-124-3p）的決策算法來(lái)識(shí)別血液、精液、唾液、陰道分泌物和月經(jīng)血。此外，該研究還在保存長(zhǎng)達(dá)36年的陳舊體液斑中檢測(cè)到了部分miRNA 分子標(biāo)記，這一發(fā)現(xiàn)也進(jìn)一步驗(yàn)證了miRNA 表達(dá)分析在降解檢材中的應(yīng)用潛力。

除此之外，其他一些法醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室也對(duì)常見(jiàn)體液如血液、唾液、精液、陰道分泌物和月經(jīng)血中具有特異性表達(dá)的miRNA 進(jìn)行了篩選和評(píng)估[48-53]，然而從目前的研究結(jié)果來(lái)看，許多miRNA 分子標(biāo)記的特異性表達(dá)并非嚴(yán)格意義上的體液特異性，而是在一組不同類型的樣本中呈現(xiàn)出的差異表達(dá)，這意味著其并非在目標(biāo)體液之外的樣本中不表達(dá)，而是在目標(biāo)體液中表達(dá)量更高。盡管許多miRNA 在篩選實(shí)驗(yàn)中看起來(lái)很有應(yīng)用潛力，但在使用RT-qPCR 等方法進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)卻無(wú)法得到良好的結(jié)果。此外，不同研究篩選出的候選miRNA 分子標(biāo)記往往并不一致，這可能是由不同的檢測(cè)方法和引物設(shè)計(jì)導(dǎo)致的。目前，不同實(shí)驗(yàn)室對(duì)于最佳miRNA 分子標(biāo)記及檢測(cè)方法的選擇，乃至如何根據(jù)檢測(cè)結(jié)果解釋和預(yù)測(cè)法醫(yī)樣本的體液類型等問(wèn)題均未達(dá)成共識(shí)。

1.3 circRNA 分子標(biāo)記

circRNA 是一類單鏈共價(jià)閉合環(huán)狀非編碼RNA，最早在關(guān)于類病毒、病毒和四膜蟲的研究中被發(fā)現(xiàn)[54-56]，近幾年才確定了其在人體細(xì)胞中的表達(dá)[57]。circRNA 與其編碼基因在相應(yīng)位置上轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生線性RNA 共享外顯子，并且通常由前體mRNA 的反向剪接形成[58-59]。由于RNA 分子的環(huán)形結(jié)構(gòu)在很大程度上可以抵抗核酸外切酶的水解，circRNA 通常被認(rèn)為具有較高的穩(wěn)定性，而這一點(diǎn)也被其在細(xì)胞中較長(zhǎng)的半衰期所證實(shí)[60]。此外，circRNA 的序列高度保守且具有組織特異性，在生物體各種細(xì)胞中大量存在，且部分circRNA 的表達(dá)水平明顯超過(guò)mRNA 的表達(dá)水平[61]，因此，理論上circRNA 具有成為良好體液斑鑒定分子標(biāo)記的潛質(zhì)。

MEMCZAK 等[62]在針對(duì)血液樣本circRNA表達(dá)情況的研究中發(fā)現(xiàn)了數(shù)百種容易通過(guò)RT-qPCR 檢測(cè)到的circRNA 亞型，但卻未發(fā)現(xiàn)其相應(yīng)的線性基因產(chǎn)物，因此認(rèn)為，對(duì)血液中circRNA 的表達(dá)進(jìn)行分析可能會(huì)獲得其他類型RNA 表達(dá)情況無(wú)法反映的疾病相關(guān)信息。而在體液斑鑒定方面，SONG 等[63]使用微陣列芯片技術(shù)檢測(cè)了circRNA 在血液、唾液、精液、陰道分泌物和月經(jīng)血中的表達(dá)譜，分析結(jié)果顯示，不同體液中circRNA 的表達(dá)模式存在可區(qū)分的差異，但該研究未能夠篩選出可用于進(jìn)一步驗(yàn)證的分子標(biāo)記；ZHANG 等[11，64-65]分別通過(guò)毛細(xì)管電泳和RT-qPCR 檢測(cè)成功鑒定出與PRM2、TGM4、KLK3等14 個(gè)體液特異性mRNA 共享外顯子的主要circRNA，并設(shè)計(jì)了用于同時(shí)檢測(cè)線性和環(huán)狀轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的引物組，其構(gòu)建的F18plex 復(fù)合檢測(cè)體系可在低至1 μL 的血液、精液、唾液，或總RNA 低至1 ng 的陰道分泌物、月經(jīng)血、尿液樣本中獲得完整的檢測(cè)結(jié)果。以上研究充分說(shuō)明了將circRNA 與mRNA 表達(dá)分析相結(jié)合，可在不影響體液特異性的前提下，成為一種提升體液斑鑒定檢測(cè)靈敏度和結(jié)果穩(wěn)定性的有效策略。

1.4 piRNA 分子標(biāo)記

piRNA 是一類非編碼小RNA，其長(zhǎng)度通常為24～32 nt，并在多種類型的細(xì)胞及外泌體中表達(dá)[66-68]。piRNA 的序列多樣性較高，目前在人類基因組中鑒定出的piRNA 已超過(guò)30 000 種[69]，并且其中一些的表達(dá)具有組織差異性[70]。更為重要的是，piRNA 的3′端核苷酸上具有一個(gè)特征性的2′-O-甲基，有研究[71]表明，這種在其他大多數(shù)小RNA 中都不存在的結(jié)構(gòu)有助于提升RNA 分子的穩(wěn)定性?；谝陨咸卣鳎琾iRNA 也被視為繼miRNA 之后又一類具有良好體液斑鑒定潛力的小RNA 分子標(biāo)記。

在法醫(yī)物證學(xué)領(lǐng)域，WANG 等[72]首先通過(guò)RTqPCR 檢測(cè)對(duì)piRNA 在體液斑鑒定中的潛在用途進(jìn)行了初步探索，研究結(jié)果證實(shí)了piR-55521 的表達(dá)具有良好的精液特異性以及較高的檢測(cè)靈敏度和穩(wěn)定性。在此基礎(chǔ)上，后續(xù)研究通過(guò)高通量測(cè)序揭示了piRNA在6 種類型的法醫(yī)相關(guān)生物樣本（靜脈血、月經(jīng)血、唾液、精液、陰道分泌物和皮膚）中的表達(dá)模式，并篩選出37 個(gè)在測(cè)序數(shù)據(jù)中顯示出相對(duì)較高體液區(qū)分潛能的候選piRNA 分子標(biāo)記?；诤蜻xpiRNA 表達(dá)矩陣的偏最小二乘-判別分析（partial least squarediscriminant analysis，PLS-DA）結(jié)果表明，在選取最佳PLS 成分?jǐn)?shù)的前提下，數(shù)量精簡(jiǎn)的分子標(biāo)記足以構(gòu)建分類效能良好的PLS-DA 模型[73]。該研究不僅提示了piRNA 分子標(biāo)記具有區(qū)分生殖細(xì)胞系相關(guān)體液與非生殖細(xì)胞系相關(guān)體液方面的優(yōu)勢(shì)，也充分強(qiáng)調(diào)了適當(dāng)?shù)臄?shù)據(jù)分析方法對(duì)于小RNA 相對(duì)表達(dá)差異正確解讀的重要性。

2 法醫(yī)學(xué)常用的RNA 表達(dá)分析方法

2.1 毛細(xì)管電泳

毛細(xì)管電泳是檢測(cè)mRNA 分子標(biāo)記的常用方法之一。在檢測(cè)過(guò)程中，首先需要將mRNA 逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（complementary DNA，cDNA），然后使用特異性引物對(duì)cDNA 進(jìn)行終點(diǎn)PCR，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳以獲得體液特異性分子標(biāo)記的檢測(cè)結(jié)果。毛細(xì)管電泳在體液斑鑒定方面的應(yīng)用最早由BAUER等[13]提出，隨后被廣泛應(yīng)用于多項(xiàng)研究中。毛細(xì)管電泳不僅可應(yīng)用于mRNA 分子標(biāo)記的檢測(cè)，也可用于檢測(cè)miRNA 和circRNA分子標(biāo)記[11，74]。由于毛細(xì)管電泳檢測(cè)平臺(tái)被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)與分析法醫(yī)學(xué)常用的DNA 遺傳標(biāo)記（如STR 和SNP），因此，相較于依靠其他平臺(tái)的RNA 分子標(biāo)記檢測(cè)手段，毛細(xì)管電泳更易于普及。此外，通過(guò)對(duì)不同分子標(biāo)記設(shè)計(jì)長(zhǎng)度不同的擴(kuò)增子，毛細(xì)管電泳方法可在同一復(fù)合擴(kuò)增體系中同時(shí)檢測(cè)多種分子標(biāo)記，這些分子標(biāo)記的目標(biāo)體液既可以是單一類型，也可以是多種類型[18，20，24，75-79]。

雖然毛細(xì)管電泳方法具有上述優(yōu)勢(shì)，但作為一種半定量的檢測(cè)手段，其在檢測(cè)cDNA 時(shí)目的產(chǎn)物峰高與起始模板量并不存在明確的線性相關(guān)。在分析一些靈敏度較低的分子標(biāo)記時(shí)，這種二元化檢測(cè)結(jié)果能夠提供的信息量十分有限。因此，不同實(shí)驗(yàn)室可能會(huì)對(duì)同樣的檢測(cè)結(jié)果做出不同的判讀和解釋。為了解決這一問(wèn)題，LINDENBERGH 等[80]基于檢測(cè)結(jié)果的可重復(fù)性以及觀察到的峰（x）與可能存在的峰（n）之間的比例開(kāi)發(fā)了一種簡(jiǎn)易的結(jié)果解讀方法。當(dāng)一類體液特異性分子標(biāo)記在所有可能存在峰的位置上出現(xiàn)了至少一半的陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果（x≥n/2）時(shí)，該類型體液將被判定為“觀察到”。在這種方法中，每種體液的全部mRNA 分子標(biāo)記在結(jié)果判斷中都具有相同的權(quán)重。而ROEDER 等[81]則提出了另一種評(píng)分方法，其根據(jù)表達(dá)特異性為每個(gè)mRNA 分子標(biāo)記賦予了一個(gè)權(quán)重值，將樣本中檢測(cè)到的分子標(biāo)記的權(quán)重值相加可得到一個(gè)體液得分。在這種方法中，僅當(dāng)樣本的體液得分達(dá)到一定閾值時(shí)才可對(duì)其進(jìn)行體液類型判定，因此可在很大程度上降低樣本類型的誤判概率。

EDNAP 在2011—2015 年開(kāi)展的mRNA 分子標(biāo)記合作研究[27，29，31-33]也是在毛細(xì)管電泳平臺(tái)上進(jìn)行的。該研究集合了多個(gè)法醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)結(jié)果，對(duì)用于血液、唾液、精液、陰道分泌物、月經(jīng)血和皮膚鑒定的多種mRNA 分子標(biāo)記的穩(wěn)定性和可重復(fù)性進(jìn)行了全面評(píng)估。研究結(jié)果表明，基于毛細(xì)管電泳技術(shù)的mRNA 表達(dá)分析可以成功地與STR 分析相結(jié)合并納入法醫(yī)學(xué)實(shí)際案件的常規(guī)處理流程中。

2.2 RT-qPCR

在涉及基因表達(dá)定量的相關(guān)研究中，RT-qPCR通常被視為金標(biāo)準(zhǔn)并廣泛應(yīng)用于候選基因表達(dá)量差異的確認(rèn)[82-83]。正是由于RT-qPCR 定量結(jié)果的準(zhǔn)確性，該檢測(cè)方法在體液斑鑒定領(lǐng)域也被廣泛應(yīng)用于miRNA 分子標(biāo)記的表達(dá)分析。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌琑T-qPCR 可以選擇一步測(cè)定法或兩步測(cè)定法進(jìn)行。一步測(cè)定法在單個(gè)反應(yīng)體系中結(jié)合了逆轉(zhuǎn)錄和PCR過(guò)程，僅能夠使用序列特異性引物。而在兩步測(cè)定法中，逆轉(zhuǎn)錄和PCR 在不同的步驟進(jìn)行，因此可選擇使用具有通用接頭的隨機(jī)引物。

目前，在法醫(yī)學(xué)研究中常用的RT-qPCR 主要包括基于熒光染料檢測(cè)的SYBR Green RT-qPCR 和基于熒光探針檢測(cè)的TaqMan RT-qPCR，雖然在熒光染料結(jié)合方式與特異性方面存在一定差異，但兩種方法本質(zhì)上都是在每個(gè)循環(huán)之后通過(guò)對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量計(jì)算出目標(biāo)基因與內(nèi)參基因之間的表達(dá)量差異，即ΔCq（或ΔCt）值[23]。由于ΔCq 值可能會(huì)受到不同引物PCR 擴(kuò)增效率的影響，WANG 等[84]在2012 年發(fā)表的一項(xiàng)研究中，通過(guò)建立擴(kuò)增效率校準(zhǔn)模型的方式為體液特異性miRNA 表達(dá)差異數(shù)據(jù)的分析提供了一種有效的方法。

在使用RT-qPCR 這類相對(duì)定量法檢測(cè)目標(biāo)基因的表達(dá)量時(shí)，內(nèi)參基因的表達(dá)情況也會(huì)對(duì)最終的檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生影響。既往研究中，普遍存在于所有類型細(xì)胞中的管家基因常被作為內(nèi)參基因用于數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)化處理[9]。然而，近年來(lái)的多項(xiàng)研究[20，40，76]表明，不同管家基因在各類體液中的表達(dá)水平和穩(wěn)定性也存在一定差異，因此在選擇內(nèi)參基因時(shí)也應(yīng)當(dāng)考慮樣本類型可能產(chǎn)生的影響。針對(duì)法醫(yī)常見(jiàn)類型的體液樣本，已有多項(xiàng)研究[48，85-87]通過(guò)表達(dá)水平和穩(wěn)定性分析對(duì)一些小RNA 內(nèi)參基因的適用性進(jìn)行了評(píng)估，但納入比較的內(nèi)參基因不同導(dǎo)致這些研究之間缺乏橫向比對(duì)。在最近的一項(xiàng)研究中，WANG 等[88]對(duì)其進(jìn)行了匯總，通過(guò)檢測(cè)18 個(gè)已報(bào)道的小RNA 候選內(nèi)參基因在我國(guó)漢族個(gè)體五類常見(jiàn)體液斑中的表達(dá)情況，最終將miR-191、miR-423、miR-93、miR-484 和let-7 確定為比較理想的內(nèi)參基因。

HAAS 等[75]對(duì)基于毛細(xì)管電泳與RT-qPCR 檢測(cè)得到的結(jié)果進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)與終點(diǎn)PCR 結(jié)合毛細(xì)管電泳檢測(cè)相比，RT-qPCR 法并沒(méi)有顯示出更高的靈敏度。此外，由于受到可檢測(cè)熒光染料數(shù)量的限制，RT-qPCR 在單個(gè)反應(yīng)體系中可進(jìn)行靶向擴(kuò)增的分子標(biāo)記數(shù)量有限，這一缺點(diǎn)也使得復(fù)合檢測(cè)體系的構(gòu)建變得更加困難。

2.3 高通量測(cè)序

高通量測(cè)序是近年來(lái)發(fā)展十分迅速的一項(xiàng)應(yīng)用技術(shù)。隨著測(cè)序通量的不斷提升以及實(shí)驗(yàn)成本的降低，高通量測(cè)序在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域相關(guān)研究中的使用范圍也在擴(kuò)大，尤其是在STR 和SNP 等DNA 遺傳標(biāo)記的檢測(cè)與分析方面顯示出了良好的發(fā)展勢(shì)頭。迄今為止，已有數(shù)個(gè)基于高通量測(cè)序的商業(yè)化STR 和SNP 試劑盒被開(kāi)發(fā)并投入實(shí)際應(yīng)用[89-91]。

在體液斑鑒定領(lǐng)域，高通量測(cè)序的應(yīng)用仍處于起步階段。LIN 等[92]最早在其研究中對(duì)來(lái)自陳舊體液斑樣本中的高度降解RNA 進(jìn)行了完整的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，實(shí)現(xiàn)了高通量測(cè)序技術(shù)在分析降解RNA 中的應(yīng)用。在隨后的一項(xiàng)研究中，ZUBAKOV 等[93]開(kāi)發(fā)了一種基于平行靶向DNA 及RNA 測(cè)序同時(shí)分析STR 和mRNA 的方 法，成功 整合了9 個(gè)STR 遺傳標(biāo)記、12 個(gè)體液特異性mRNA 分子標(biāo)記（可檢測(cè)血液、唾液、精液、陰道分泌物、月經(jīng)血和皮膚）以及2 個(gè)mRNA 內(nèi)參基因。HANSON 等[26]在2018 年發(fā)表的一項(xiàng)研究中進(jìn)一步增加了高通量測(cè)序體系中mRNA 分子標(biāo)記的數(shù)量，其基于Illumina 測(cè)序平臺(tái)開(kāi)發(fā)的包含33 個(gè)mRNA分子標(biāo)記的靶向測(cè)序體系（MiSeq/FGx 33plex）可用于血液、精液、唾液、陰道分泌物、月經(jīng)血和皮膚的鑒定。根據(jù)其實(shí)驗(yàn)結(jié)果，這些分子標(biāo)記在各自的目標(biāo)體液中均顯示出較高的特異性，并且與非目標(biāo)體液的交叉反應(yīng)極小（或無(wú)）。D?RUM 等[94]隨后在包含模擬案件檢材在內(nèi)的183 例體液或組織樣本中對(duì)MiSeq/FGx 33plex 的應(yīng)用效果進(jìn)行了更加全面的評(píng)估，并在數(shù)據(jù)分析過(guò)程中建立了一個(gè)預(yù)測(cè)樣本類型的全新統(tǒng)計(jì)學(xué)模型。與傳統(tǒng)模型相比，該模型的不同之處在于其可將測(cè)序數(shù)據(jù)中的定量信息也作為一個(gè)因子納入分析，而不僅是基于有或無(wú)的二元化判定結(jié)果，這一提升使體液類型的預(yù)測(cè)效果得到了很大的改善。而在最近的EDNAP 合作研究[34]中，17 個(gè)成員實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步評(píng)估了MiSeq/FGx 33plex 與另一個(gè)基于Ion torrent 測(cè)序平臺(tái)構(gòu)建的包含29 個(gè)mRNA 分子標(biāo)記的靶向測(cè)序體系（PGM/S5 29plex）在體液斑鑒定中的實(shí)際使用效果。總體而言，雖然不同實(shí)驗(yàn)室由于測(cè)序數(shù)據(jù)量的差異導(dǎo)致各分子標(biāo)記測(cè)序讀數(shù)存在一定的差異，但是整體所反映的趨勢(shì)是相同的：各類型分子標(biāo)記均可在其目標(biāo)體液中檢測(cè)到中等或較高的讀數(shù)值，而在非目標(biāo)體液中的讀數(shù)值很少甚至沒(méi)有。此外，該研究還對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行了偏最小二乘（partial least square，PLS）分析，結(jié)果顯示，血液、月經(jīng)血、唾液和精液分子標(biāo)記按樣本類型呈現(xiàn)出良好的聚類。這項(xiàng)協(xié)作研究的結(jié)果再次證實(shí)了靶向mRNA 測(cè)序可作為一種可靠的方法應(yīng)用到未來(lái)的體液類型鑒別相關(guān)研究中。

除了mRNA 分子標(biāo)記的檢測(cè)，高通量測(cè)序也被廣泛應(yīng)用于miRNA 分子標(biāo)記的篩選和表達(dá)分析中。WANG 等[49]在2016 年發(fā)表的研究中使用Ion torrent PGM 平臺(tái)檢測(cè)了2 588個(gè)成熟體miRNA 在血液和唾液樣本中的表達(dá)情況，并分別篩選出了6 個(gè)在血液中特異性表達(dá)、19個(gè)在唾液中特異性表達(dá)的miRNA 分子標(biāo)記。隨后，SEASHOLS-WILLIAMS 等[48]使用Illumina HiSeq 平臺(tái)檢測(cè)了miRNA 在8 種類型的法醫(yī)相關(guān)生物樣本（血液、精液、陰道分泌物、月經(jīng)血、唾液、尿液、糞便和汗液）中的表達(dá)量，結(jié)果顯示，陰道分泌物、唾液和糞便這些含菌量相對(duì)較高的體液測(cè)序數(shù)據(jù)在序列匹配與注釋后獲得的miRNA 讀數(shù)相對(duì)較低，這可能是由于內(nèi)源性細(xì)菌中的小RNA 過(guò)度飽和所導(dǎo)致。此外，該研究也成功鑒定出一系列體液特異性miRNA分子標(biāo)記與最佳內(nèi)參基因，為后續(xù)研究提供了一定參考。D?RUM 等[50]在2019 年發(fā)表的一項(xiàng)針對(duì)體液斑的miRNome 測(cè)序研究中，直接應(yīng)用PLS 和線性判別分析（linear discriminant analysis，LDA）根據(jù)miRNA 的整體表達(dá)模式對(duì)體液類型進(jìn)行了預(yù)測(cè)。通過(guò)調(diào)整分子標(biāo)記篩選閾值，評(píng)估了其建立的統(tǒng)計(jì)學(xué)模型在面對(duì)包含不同數(shù)量miRNA 分子標(biāo)記的子集時(shí)預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性的差異，從而確定了足夠的預(yù)測(cè)效能所需的最小分子標(biāo)記數(shù)量。雖然分析結(jié)果顯示，由100 個(gè)miRNA 分子標(biāo)記組成的模型預(yù)測(cè)效果明顯優(yōu)于由9 個(gè)miRNA 分子標(biāo)記組成的模型，甚至與包含全部1 034 個(gè)miRNA分子標(biāo)記的模型預(yù)測(cè)效果相當(dāng)，但為了減少數(shù)據(jù)分析中的變量，該研究最終仍選定由9 個(gè)miRNA 分子標(biāo)記組成的預(yù)測(cè)模型并計(jì)算了其中各分子標(biāo)記在對(duì)6 種生物樣本（血液、唾液、精液、陰道分泌物、月經(jīng)血和皮膚）的類型進(jìn)行預(yù)測(cè)時(shí)的重要性指數(shù)。在某種程度上，這項(xiàng)研究為今后分子標(biāo)記的篩選提供了新的思路，因?yàn)槠浞治鼋Y(jié)果提示，在體液斑鑒定模型中，能夠?yàn)槎喾N體液的區(qū)分提供有效信息的分子標(biāo)記可能比僅在一種體液中具有表達(dá)特異性的分子標(biāo)記更加重要。

2.4 其他方法

高分辨率熔解（high-resolution melting，HRM）曲線分析是在RT-qPCR 的基礎(chǔ)上，根據(jù)單核苷酸熔解溫度不同而形成不同形態(tài)熔解曲線的特征對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行分析的方法[95-97]。在熔解過(guò)程中，通過(guò)監(jiān)測(cè)目標(biāo)片段的熒光變化來(lái)獲得專一的HRM 曲線和解鏈溫度（melting temperature，Tm），根據(jù)HRM 圖譜的特點(diǎn)來(lái)區(qū)分特異性序列的差異，具有成本低、速度快及閉管操作可避免污染等優(yōu)點(diǎn)?；贖RM 方法，HANSON等[98]構(gòu)建的mRNA 復(fù)合體系可在一定程度上區(qū)分血液、精液、唾液、陰道分泌物、月經(jīng)血和皮膚樣本。

基因芯片檢測(cè)通過(guò)微陣列（microarray）技術(shù)將高密度DNA 片段通過(guò)高速機(jī)器人或原位合成方式以一定的順序或排列方式使其附著在膜、玻璃片等固相表面，以同位素或熒光標(biāo)記的DNA 探針，借助堿基互補(bǔ)雜交原理，根據(jù)設(shè)計(jì)芯片時(shí)的探針位置和熒光強(qiáng)度分布比對(duì)分析得出樣本的核酸序列?；蛐酒臋z測(cè)準(zhǔn)確性高、通量大，在法醫(yī)學(xué)中常用于DNA、RNA 等分子標(biāo)記的篩選[99-100]。

基于顏色編碼的NanoString?基因定量法針對(duì)每個(gè)mRNA 標(biāo)記分別設(shè)計(jì)35～50 個(gè)堿基的報(bào)告探針和捕獲探針[101]，其多重檢測(cè)體系可包含20～800個(gè)mRNA靶標(biāo)探針對(duì)。報(bào)告探針攜帶信號(hào)，由與mRNA 的5′末端結(jié)合的熒光分子條形碼組成；捕獲探針與mRNA 的3′末端結(jié)合后，可將整個(gè)探針與mRNA 的復(fù)合體黏附在玻片表面以進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)和數(shù)據(jù)收集。DANAHER等[102]應(yīng)用NanoString?基因定量法對(duì)23 個(gè)mRNA 靶標(biāo)進(jìn)行探針雜交，用于識(shí)別血液、精液、唾液、陰道分泌液和汗液。然而，其中唾液、陰道分泌物和汗液標(biāo)志物缺乏液體特異性。此外，識(shí)別體液需要的樣品量較大、雜交時(shí)間冗長(zhǎng)。

實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）技術(shù)由USHIO 等[103]開(kāi)發(fā)，廣泛用于寄生蟲、疾病的快速檢測(cè)和鑒定等[104-105]。RT-LAMP 通過(guò)DNA 聚合酶介導(dǎo)的自循環(huán)進(jìn)行DNA 擴(kuò)增，該酶取代目標(biāo)鏈DNA 并在擴(kuò)增時(shí)產(chǎn)生新的目標(biāo)，因此，該過(guò)程比傳統(tǒng)PCR 更具特異性。此外，RT-LAMP 反應(yīng)速度快，僅需加熱塊保持在單一溫度，無(wú)需專用設(shè)備。在法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，SU等[106]及JACKSON 等[107]將RT-LAMP應(yīng)用于血液、精液、唾液、陰道分泌液等體液中特異性mRNA 標(biāo)記的檢測(cè)，盡管研究結(jié)果體現(xiàn)出RT-LAMP 快速區(qū)分單一類型體液的能力與較高的檢測(cè)靈敏度，但由于該方法對(duì)于mRNA 分子完整度要求較高，其在降解檢材中的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值仍需要進(jìn)一步評(píng)估。

3 展 望

經(jīng)過(guò)多年的探索和發(fā)展，RNA 表達(dá)模式分析在體液斑鑒定領(lǐng)域已獲得絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室的認(rèn)可。在實(shí)際應(yīng)用中，根據(jù)現(xiàn)有的RNA 分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果對(duì)樣本質(zhì)量較高的單一成分體液進(jìn)行體液類型鑒定通?？色@得較為可靠的結(jié)果，然而在面對(duì)高度降解的低質(zhì)量樣本或混合樣本時(shí)，目前仍然沒(méi)有較好的解決策略。因此，未來(lái)的研究重點(diǎn)也將聚焦于如何解決這兩個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題。

鑒于小RNA 在既往針對(duì)降解程度較為嚴(yán)重的檢材的研究中顯示出較高的穩(wěn)定性，未來(lái)法醫(yī)學(xué)研究若能夠鑒識(shí)出其他類型具有穩(wěn)定化學(xué)結(jié)構(gòu)的小RNA分子標(biāo)記，并將其與miRNA 和piRNA 分析相結(jié)合，可能對(duì)小RNA 表達(dá)分析在體液鑒定中的整體應(yīng)用效果起到很大的提升作用。而在混合樣本的鑒定方面，HANSON 等[108]最早提出了將基因編碼區(qū)SNP（coding region SNP，cSNP）應(yīng)用于mRNA 分子標(biāo)記來(lái)源個(gè)體識(shí)別的設(shè)想。作為DNA 的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，RNA 分子不僅具備來(lái)自其模板DNA 序列的遺傳多態(tài)性，還具有體液特異性表達(dá)的特征，若能夠通過(guò)cSNP 的檢測(cè)將個(gè)體識(shí)別相關(guān)的多態(tài)信息與體液類型相關(guān)的表達(dá)信息相關(guān)聯(lián)，理論上可以使混合樣本的鑒定效能得到質(zhì)的提升。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外一系列研究[109-114]已通過(guò)高通量測(cè)序和SNaPshot 檢測(cè)等手段探索了根據(jù)cSNP 分析結(jié)果將體液類型與具有特定基因型的個(gè)體相連鎖的可行性。此外，由于一些體液特異性mRNA 分子標(biāo)記在部分外觀和細(xì)胞成分相似的樣本（如唾液和陰道分泌物）中存在交叉表達(dá)的特征，在一些案情復(fù)雜的情況下，即使對(duì)單一類型的體液樣本進(jìn)行溯源也可能出現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的錯(cuò)誤解讀。cSNP 的相關(guān)研究亦可能為解決體液鑒定中的交叉反應(yīng)提供新的實(shí)驗(yàn)手段。

綜上，無(wú)論是新型RNA 分子標(biāo)記的探索還是現(xiàn)有RNA 分子標(biāo)記檢測(cè)體系與檢測(cè)方法的優(yōu)化，在未來(lái)研究中均有很大的提升空間。盡管目前RNA 表達(dá)分析在體液斑鑒定和其他法醫(yī)學(xué)鑒定的實(shí)踐過(guò)程中仍面臨一些問(wèn)題，但隨著有效分子標(biāo)記數(shù)量的不斷增加以及檢測(cè)和分析方法的逐漸完善，這些問(wèn)題均有望通過(guò)進(jìn)一步研究得到解決，而RNA 證據(jù)也必然在法庭科學(xué)領(lǐng)域呈現(xiàn)出更高的應(yīng)用價(jià)值。