基于DNA 推斷死亡時(shí)間技術(shù)方法的研究進(jìn)展

楊瀾，王鑫，牛勇

1.山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，山西 晉中 030600；2.淮北市公安局刑偵支隊(duì)，安徽 淮北 235000；3.公安部刑事偵查局，北京 100006

死亡時(shí)間（postmortem interval，PMI），又稱死后間隔時(shí)間或死后經(jīng)歷時(shí)間，是指發(fā)現(xiàn)、檢查尸體時(shí)距死亡發(fā)生時(shí)的時(shí)間間隔。在刑事案件中，準(zhǔn)確推斷PMI 可為案件偵破提供重要線索，幫助確定案件性質(zhì)、劃定偵查范圍、認(rèn)定和排除嫌疑人等。法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，一般根據(jù)尸體現(xiàn)象、胃腸內(nèi)容物消化程度、膀胱尿量等進(jìn)行PMI 推斷，但這些方法易受主觀和環(huán)境因素的影響[1]。因此，更為準(zhǔn)確的PMI 推斷仍是法醫(yī)病理學(xué)研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)問題。通常情況下，同一物種不同器官細(xì)胞核中的DNA 平均含量是相對(duì)恒定的[2]。因此，越來越多的學(xué)者根據(jù)死后DNA 變化規(guī)律進(jìn)行PMI 推斷。近年來，隨著生物化學(xué)與分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)的不斷發(fā)展，基于DNA 推斷PMI 的技術(shù)方法的應(yīng)用也更加廣泛，并取得了一定進(jìn)展。因此，本文擬對(duì)基于DNA 推斷PMI 的技術(shù)研究進(jìn)行綜述，以期為法醫(yī)學(xué)科研和實(shí)踐提供參考。

1 基于DNA 進(jìn)行PMI 推斷的技術(shù)方法

1.1 單細(xì)胞凝膠電泳（single cell gel electrophoresis，SCGE）技術(shù)

SCGE 的電泳圖形似彗星，因此又稱為彗星試驗(yàn)，最初由OSTLING 等[3]提出，后經(jīng)其他學(xué)者逐步完善而發(fā)展起來，可用于檢測分析死后機(jī)體組織細(xì)胞DNA的降解情況[4-5]。SCGE 的基本原理[6-7]是細(xì)胞經(jīng)裂解釋放出的雙鏈DNA 解旋為單鏈，在電泳過程中，降解的小分子DNA 進(jìn)入凝膠，帶負(fù)電荷向正極泳動(dòng)，經(jīng)熒光染色后，可觀察到其按相對(duì)分子質(zhì)量大小在電泳過程中出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，形成彗星尾，未降解的DNA 由于分子量大而保持在原位，形成彗星頭。隨著PMI 的延長，DNA 降解增多，彗星頭會(huì)逐漸變小，彗星尾逐漸變長[8-10]，即DNA 隨著PMI 的延長逐漸降解。有研究[8]將死后0～24 h 的DNA 電泳結(jié)果大致分為3 種：（1）彗星頭大且只有很短的頸尾部，有30%～45%的DNA 降解，一般出現(xiàn)在死后6 h 內(nèi)；（2）彗星頭減小而尾變長，有60%～85%的DNA 降解，由于處于中間階段，并未給出死后時(shí)間估計(jì)區(qū)間；（3）彗星頭頸基本不存在而彗星尾很長，約有98%的DNA 發(fā)生降解，一般出現(xiàn)在死后24 h 之后。

在推斷PMI 時(shí)，可通過SCGE 的多種損傷參數(shù)來綜合判斷。研究表明，彗星拖尾的頭尾長度、面積以及DNA 含量比例等參數(shù)均與PMI 具有相關(guān)性[9，11-16]，并且在腦、心肌等多種組織和細(xì)胞中得到了很好的驗(yàn)證[10，17-18]。SCGE具有所需樣本少、簡便、快捷等特點(diǎn)[19]，適用于樣本含量較少的檢材，如血痕、血滴、組織碎塊等，但在實(shí)驗(yàn)過程中會(huì)受到多種因素的影響[15]，如在制備單細(xì)胞懸液時(shí)，細(xì)胞數(shù)過多或者過少均會(huì)造成難以統(tǒng)計(jì)分析的后果。因此，SCGE 需首先確保實(shí)驗(yàn)質(zhì)量，再結(jié)合專門的分析軟件，使用合適的參數(shù)建立準(zhǔn)確的預(yù)測模型。

1.2 計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)

計(jì)算機(jī)圖像分析技術(shù)通過對(duì)DNA 進(jìn)行特殊染色，采用涂片或自動(dòng)化計(jì)算機(jī)圖像分析等手段分析DNA 降解情況[20]。其中Feulgen 染色技術(shù)是PMI 推斷中運(yùn)用時(shí)間較長且較成熟的一項(xiàng)技術(shù)[14]，自1924 年FEULGEN 等建立Feulgen 染色法以來，該方法就成為DNA 圖像定量分析的“金標(biāo)準(zhǔn)”[21]。對(duì)于Feulgen 染色后DNA 圖像分析的參數(shù)主要分為幾何參數(shù)和灰度參數(shù)[14，22]。幾何參數(shù)包括面積、等效直徑和異形指數(shù)，主要定量反映細(xì)胞或細(xì)胞核形態(tài)（形狀、大小及輪廓）規(guī)則程度的變化；灰度參數(shù)包括平均光密度、積分光密度和平均灰度，主要反映細(xì)胞或細(xì)胞核顏色的深淺程度。因此，在進(jìn)行DNA 定量時(shí)需要選擇合適的參數(shù)[23]。

對(duì)于計(jì)算機(jī)圖像分析參數(shù)的選擇，積分光密度、平均光密度及平均灰度這3 個(gè)指標(biāo)適用于PMI 推斷研究[24-26]，且平均光密度和平均灰度對(duì)溫度特別敏感。基于此項(xiàng)技術(shù)對(duì)大鼠骨骼肌[27]、肝細(xì)胞[28]、腎細(xì)胞[22]和腦組織[29]等多種來源的樣本進(jìn)行研究，結(jié)果均表明DNA 含量的變化與PMI 相關(guān)。計(jì)算機(jī)圖像分析具有可操作性強(qiáng)、結(jié)果客觀等優(yōu)勢，但在制備切片的過程中，取材、染色、固定等操作步驟均可能影響圖像呈現(xiàn)及結(jié)果分析。同時(shí)由于此技術(shù)不能區(qū)分原核細(xì)胞和真核細(xì)胞的DNA[30]，特異性較低，適用于保存較好的組織檢材，導(dǎo)致計(jì)算機(jī)圖像分析在日常法醫(yī)學(xué)鑒定實(shí)踐中存在一定的局限性。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）

FCM 是通過流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞DNA 含量進(jìn)行分析的一項(xiàng)技術(shù)。將核酸熒光染料插入DNA 的堿基中，F(xiàn)CM 通過捕獲被激發(fā)的熒光測定DNA 含量。在染料飽和的前提下，每個(gè)細(xì)胞內(nèi)熒光數(shù)量的多少取決于其 中的DNA 含量[31]。

1994 年，CINA[32]首次基于FCM分析DNA 降解細(xì)胞數(shù)與完整細(xì)胞數(shù)的比值推測PMI。通過FCM 對(duì)不同溫度條件下死后組織細(xì)胞的DNA 進(jìn)行定量研究發(fā)現(xiàn)，相較于其他影響死后DNA 降解的因素，環(huán)境溫度對(duì)DNA降解有重要影響[33-35]。FCM 通過熒光標(biāo)記進(jìn)行DNA 檢測，能夠更好地發(fā)現(xiàn)不同組織檢材的DNA 含量隨著PMI 延長的變化。研究[36]發(fā)現(xiàn)，在相同的環(huán)境條件下，相對(duì)于肋軟骨細(xì)胞的DNA 降解曲線，隨著PMI的延長，人牙髓細(xì)胞的DNA 降解曲線在0～4 d 存在一個(gè)降解平臺(tái)期，在應(yīng)用人牙髓細(xì)胞DNA 推斷PMI 時(shí)，可以此作為參考。另外，機(jī)體死亡后，肝、腎、心、脾細(xì)胞核DNA 含量隨PMI 延長而逐漸減少，具有一定的變化規(guī)律[37-39]，其中脾細(xì)胞核DNA 含量的變化趨勢與PMI 最具相關(guān)性。WILLIAMS 等[40]研究了其他器官到腸道的距離與死后DNA 降解量之間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)尸體腦組織中DNA 降解率較脾組織低，或更適用于FCM 的檢測，但在頭部創(chuàng)傷、頭部槍傷或溺死等情況下，使用腦組織作為評(píng)估PMI 的樣本將存在局限性。

FCM 具有檢測準(zhǔn)確、靈敏、可定量的特點(diǎn)，但不適用于已經(jīng)發(fā)生自溶的組織，因DNA 降解[35]會(huì)導(dǎo)致結(jié)果產(chǎn)生偏差，此外，在操作過程中對(duì)DNA 的人為破壞也可能對(duì)結(jié)果及模型構(gòu)建產(chǎn)生影響。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 通過實(shí)時(shí)檢測PCR 每個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)對(duì)起始模板質(zhì)量進(jìn)行定量及定性分析。目標(biāo)核酸的起始拷貝數(shù)越高，觀察到熒光的時(shí)間也越早[41]。

目前，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)在結(jié)合DNA 推斷PMI 研究中的應(yīng)用逐漸受到法醫(yī)學(xué)者的廣泛關(guān)注。研究[42]發(fā)現(xiàn)，可通過SD 大鼠死后心血總DNA 含量變化及大腸桿菌LacZ基因濃度變化情況推斷早期PMI；對(duì)于晚期PMI 的推斷，基于大鼠腦、肝、腎和肌肉樣本的研究[43]發(fā)現(xiàn)，腦組織適用于腐敗尸體的DNA 分析?；趯?duì)豬的骨骼肌[44]、人的牙齒[45-46]等的研究提出，時(shí)間和環(huán)境溫度是影響DNA 降解的主要因素。另外，也可運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)檢測昆蟲的特異性基因來推斷PMI[47]。相較于傳統(tǒng)PCR技術(shù)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)可以更加靈敏和準(zhǔn)確地觀察到DNA 含量的動(dòng)態(tài)變化，也便于開展結(jié)合環(huán)境等因素的PMI 相關(guān)研究，同時(shí)還可以區(qū)分原核生物和真核生物的DNA。但實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)只能檢測已知的目標(biāo)序列，目前應(yīng)用該技術(shù)檢測DNA 以實(shí)現(xiàn)對(duì)PMI 準(zhǔn)確推斷的相關(guān)研究較少。

1.5 高通量測序技術(shù)

近年來，隨著高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展，其高準(zhǔn)確性、高通量、高靈敏度等優(yōu)點(diǎn)促使微生物研究進(jìn)入了第三個(gè)黃金時(shí)期。與傳統(tǒng)微生物分離培養(yǎng)模式不同的是，高通量測序技術(shù)可將環(huán)境中的全部微生物看作一個(gè)整體，對(duì)其總的基因組進(jìn)行監(jiān)測分析，通過物種注釋等對(duì)環(huán)境微生物的多樣性及變化規(guī)律開展系統(tǒng)性研究[48]。人體內(nèi)含有多種細(xì)菌，這些細(xì)菌在人體死亡后可呈現(xiàn)出種類和豐度的變化，因此，基于高通量測序技術(shù)研究機(jī)體死后體內(nèi)菌群的變化規(guī)律推斷PMI 成為近年來的研究熱點(diǎn)。

高通量測序技術(shù)可獲得高通量的物種豐度、測序信息，為基于微生物的PMI 推斷研究提供了新技術(shù)手段。在死亡原因?yàn)槟缢赖腜MI 研究中，通過菌落變化推斷PMI 具有較高的適用性[49-51]。對(duì)掩埋的骨骼樣本及其所處環(huán)境中土壤樣本里的微生物進(jìn)行16S rDNA 測序[52]，也證實(shí)了利用菌落變化推斷PMI 具有一定的可行性。除了對(duì)機(jī)體表面微生物群落變化的研究，機(jī)體內(nèi)的微生物由于不受或極少受到外界環(huán)境的影響，其變化規(guī)律在PMI 推斷中更有價(jià)值。其中，腸道微生物組成及豐度與PMI 的相關(guān)性是重要的研究方向之一[53-55]。研究發(fā)現(xiàn)，微生物群落的相似性與PMI（60 d 內(nèi)）之間存在顯著線性關(guān)系[56]，結(jié)合偏最小二乘法、隨機(jī)森林等機(jī)器學(xué)習(xí)算法模型研究，可實(shí)現(xiàn)更為準(zhǔn)確的PMI 推斷[55-57]，且通過土壤、直腸和皮膚微生物推斷PMI 的預(yù)測模型準(zhǔn)確率可達(dá)80%以上。高通量測序技術(shù)在測序過程中需要注意測序深度，避免低深度測序時(shí)出現(xiàn)測序錯(cuò)誤等問題影響最終結(jié)果的準(zhǔn)確性[58]，同時(shí)需要對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)量控制以避免錯(cuò)誤[59]。

1.6 其他相關(guān)方法

除了上述主流方法外，激光共焦顯微拉曼光譜術(shù)、由末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTPbiotin nick end labeling assay，TUNEL）[60]技術(shù)也應(yīng)用于基于DNA 變化的PMI 研究中。通過激光共焦顯微拉曼光譜技術(shù)對(duì)置于特定環(huán)境中的腎和肝組織進(jìn)行研究[61-62]，發(fā)現(xiàn)人死亡后腎、肝組織細(xì)胞DNA 含量隨著PMI 延長呈線性下降趨勢。而TUNEL 法將脫氧尿苷三磷酸（deoxyuridine triphosphate，dUTP）結(jié)合到大鼠肝、腎、脾組織DNA 的3′末端[63]，發(fā)現(xiàn)dUTP 的剩余量隨PMI 延長而減少，可用于早期PMI 的推測。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）對(duì)尸體長骨的皮質(zhì)骨數(shù)據(jù)進(jìn)行分析[64]，發(fā)現(xiàn)腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和Ⅰ型膠原多肽等在死后20 年明顯減少。此外，基于分光光度計(jì)和微芯片電泳技術(shù)對(duì)凋亡和（或）壞死細(xì)胞中的游離DNA 進(jìn)行分析[65]，發(fā)現(xiàn)尸體的游離DNA 濃度明顯高于健康人群和心臟病患者，窒息死亡者的血清游離DNA 濃度隨PMI 的延長略有升高，并認(rèn)為血清游離DNA 濃度和片段大小具有推斷PMI 和死因的潛力，為后續(xù)分析提供了研究思路。

2 總結(jié)及展望

在法醫(yī)學(xué)鑒定工作中，常常會(huì)遇到質(zhì)量不佳的檢材，生物大分子多因機(jī)體死亡而發(fā)生降解。DNA 作為人體中較為穩(wěn)定的分子，針對(duì)其死后變化規(guī)律與PMI 的相關(guān)研究也較多，發(fā)現(xiàn)隨著PMI 的延長，體內(nèi)的DNA 會(huì)不斷降解，且不同器官組織細(xì)胞中的DNA降解程度不同。除了不同組織的影響外，環(huán)境條件[43，66]同樣會(huì)對(duì)DNA 降解產(chǎn)生影響。研究[67]表明，在考慮環(huán)境變量建立模型時(shí)，可提升預(yù)測準(zhǔn)確度[68]。目前大部分研究主要通過建立相關(guān)動(dòng)物模型[5，42，53-54，57]來檢測DNA 降解量，進(jìn)而進(jìn)行PMI 推斷，然而對(duì)于動(dòng)物模型的準(zhǔn)確性，還需后續(xù)加以驗(yàn)證。此外，SCGE、計(jì)算機(jī)圖像分析和FCM 等方法需要進(jìn)一步規(guī)范操作流程及質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，避免人為因素影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由于環(huán)境條件、組織器官降解情況等因素差異較大，具體的方法和待測組織的選擇仍需要根據(jù)實(shí)際工作中的樣本條件及個(gè)體差異而決定。

近年來，芯片技術(shù)[65]、高通量測序技術(shù)[57，69]、宏基因組學(xué)測序[56，70]等技術(shù)的應(yīng)用，使得多組學(xué)技術(shù)研究人體生物大分子以及微生物菌群的變化成為可能，從而獲得更為準(zhǔn)確的PMI 推斷模型，但也需要建立系統(tǒng)的新技術(shù)方法體系并驗(yàn)證技術(shù)的準(zhǔn)確性，提升數(shù)據(jù)分析能力，以具備高通量數(shù)據(jù)分析研判的素質(zhì)。相信隨著技術(shù)的發(fā)展，將基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、宏基因組學(xué)等新理論與高通量測序技術(shù)結(jié)合，通過建立機(jī)器學(xué)習(xí)、深度學(xué)習(xí)和強(qiáng)化學(xué)習(xí)等新算法模型，能顯著推動(dòng)PMI 推斷的研究進(jìn)展，實(shí)現(xiàn)多組學(xué)層面的指標(biāo)篩選以及更精準(zhǔn)的推斷模型構(gòu)建，促使PMI 推斷技術(shù)盡早成熟并應(yīng)用于實(shí)踐。