紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)耐低溫相關(guān)微衛(wèi)星標(biāo)記的初步篩選

袁晨浩, 劉志峰, 馬愛軍

紅鰭東方鲀()耐低溫相關(guān)微衛(wèi)星標(biāo)記的初步篩選

袁晨浩1, 3, 劉志峰2, 3, 馬愛軍2, 3

(1. 浙江海洋大學(xué), 浙江 舟山 316000; 2. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室, 山東 青島 266071; 3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實驗室, 山東 青島 266237)

采用微衛(wèi)星結(jié)合混合群體分離分析法技術(shù)(SSR-BSA)對紅鰭東方鲀?nèi)后w進(jìn)行耐低溫相關(guān)微衛(wèi)星標(biāo)記的篩選。首先對300尾紅鰭東方鲀幼魚進(jìn)行低溫處理, 分別獲得34尾耐低溫(S組)和不耐低溫個體(D組)。分別在兩組中隨機挑選15尾提取基因組DNA, 構(gòu)建耐低溫和不耐低溫DNA混池, 然后用148對微衛(wèi)星引物對其進(jìn)行掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)4個標(biāo)記(fms45、fms82、fms100和fms182)在耐低溫和不耐低溫DNA混池中擴增出差異條帶。用S組和D組全部個體對4個標(biāo)記進(jìn)行單個體驗證, 結(jié)果顯示由fms100擴增, 攜帶有116 bp條帶的個體在S組和D組的出現(xiàn)頻率分別是53%和18%, 132 bp條帶的出現(xiàn)頻率分別是59%(S組)、24%(D組); 由fms182擴增, 攜帶有125 bp的個體在S組和D組出現(xiàn)的頻率分別是12%和35%, 經(jīng)卡方檢驗值均小于0.05, 差異顯著。本文關(guān)于紅鰭東方鲀耐低溫分子標(biāo)記的報道, 為研究紅鰭東方鲀耐低溫的遺傳基礎(chǔ)以及相關(guān)分子機制提供了依據(jù), 也為開展紅鰭東方鲀耐低溫分子標(biāo)記輔助選育提供了良好的基礎(chǔ)。

紅鰭東方鲀; 耐低溫; 微衛(wèi)星標(biāo)記; SSR-BSA

紅鰭東方鲀()是一種重要的海水養(yǎng)殖魚類, 隸屬于鲀形目(Telraodontiformes)、鲀科(Tetradontidae)、東方鲀屬(), 是暖溫性、廣鹽性底棲肉食性魚類, 主要分布在日本沿海, 在朝鮮半島、俄羅斯也有分布, 中國自然數(shù)量主要分布在黃海、渤海和東海, 是我國北方海水養(yǎng)殖和出口創(chuàng)匯的重要魚類。其適宜生長溫度為16～25 ℃, 過低的溫度會造成生長性能的下降甚至死亡現(xiàn)象[1], 然而在我國北方養(yǎng)殖紅鰭東方鲀時, 陸海接力以及越冬過程必然會遇到溫度降低的狀況, 另外使用加熱提高水溫的方式也會遇到成本升高和環(huán)保壓力等問題, 因此通過選育具有耐寒性狀的品系可減少因溫度降低而造成的經(jīng)濟損失。

水產(chǎn)動物耐溫品種的選育工作已取得一定的進(jìn)展, 在大菱鲆、暗紋東方鲀、中國明對蝦、凡納濱對蝦、刺參以及大黃魚都有相關(guān)的研究[2-7], 針對耐溫性狀, 目前的選育方式多采用傳統(tǒng)群體選育和家系選育等方式。分子標(biāo)記輔助育種(molecular marker- assisted breeding, MAS)是借助與性狀緊密相關(guān)的分子標(biāo)記對具有性狀優(yōu)勢的等位基因或基因型的個體進(jìn)行直接選擇育種, 是分子生物學(xué)和基因組學(xué)的研究結(jié)果應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖品種選育的技術(shù)。分子標(biāo)記技術(shù)作為一種常規(guī)輔助選育手段具有選擇強度大、準(zhǔn)確率高、遺傳穩(wěn)定的特點[8], 在水產(chǎn)、畜牧、作物等很多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[9-11]。在常見的分子標(biāo)記技術(shù)中, 微衛(wèi)星分子標(biāo)記(simple sequence repeats, SSR)作為分析與重要經(jīng)濟性狀的遺傳連鎖關(guān)系理想的分子標(biāo)記, 已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物的育種[12-14]。

目前關(guān)于紅鰭東方鲀分子標(biāo)記的研究多涉及遺傳評估與系譜認(rèn)證[15], 有關(guān)紅鰭東方鲀耐低溫相關(guān)的微衛(wèi)星分子標(biāo)記的研究在國內(nèi)尚未報道。本研究采用SSR結(jié)合混合群體分離分析法(bulked segregant analysis) 技術(shù), 篩選與耐低溫性狀相關(guān)的分子標(biāo)記, 以期為紅鰭東方鲀經(jīng)濟性狀的間接選擇提供參考數(shù)據(jù), 為培育紅鰭東方鲀耐低溫品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用的紅鰭東方鲀樣品來自大連天正實業(yè)有限公司, 在室內(nèi)養(yǎng)殖池中挑選300尾體格健壯、無損傷、活力好的幼魚, 體長(15.1±0.5) cm, 體重(150±9) g, 于6個實驗桶(2 000 L)中暫養(yǎng), 暫養(yǎng)2周, 水溫(23±0.5) ℃, 同暫養(yǎng)前保持一致, 使用加熱棒維持溫度。該群體已在本課題組進(jìn)行過遺傳多樣性分析, 其期望雜合度(Excepted heterozygosity,e)大于0.7, 遺傳多樣性豐富。

1.2 實驗設(shè)計

暫養(yǎng)結(jié)束后, 通過自然海水流水(水溫5 ℃)降溫的方式, 每天降溫3 ℃, 持續(xù)降溫6 d (23 ℃, 20 ℃, 17 ℃, 14 ℃, 11 ℃, 8 ℃, 5 ℃), 最終達(dá)到5 ℃后維持。在降溫期間每隔20 min觀察實驗魚的狀態(tài), 發(fā)現(xiàn)瀕死魚及時取出, 剪尾鰭置于無水乙醇后凍于?40 ℃冰箱中備用。在溫度降至8 ℃后陸續(xù)有死魚出現(xiàn), 在溫度維持5 ℃經(jīng)2 d后, 死亡數(shù)量達(dá)到50% (150尾)時停止實驗, 存活個體剪尾鰭置于無水乙醇后凍于?40 ℃冰箱中備用。在死亡個體中選取最早死亡的34尾幼魚記為不耐低溫組(D組), 在存活個體中選取34尾狀態(tài)活躍的幼魚記為耐低溫組(S組)。

1.3 微衛(wèi)星引物

根據(jù)Takagi等[16]和古川聡史[17]報道的紅鰭東方鲀微衛(wèi)星位點, 選取148個能夠覆蓋整個微衛(wèi)星圖譜的位點, 根據(jù)其側(cè)翼保守序列設(shè)計引物, 由上海生工公司合成。

1.4 基因組DNA制備

利用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的海洋動物DNA提取試劑盒, 提取紅鰭東方鲀S組和D組的尾鰭DNA。采用1%瓊脂糖凝膠電泳測定提取DNA的質(zhì)量及完整性, 采用紫外分光光度計進(jìn)行濃度測定, 最后用雙蒸水稀釋至質(zhì)量濃度為5×10–2g/L左右, 保存于?40 ℃冰箱。

1.5 BSA基因池的建立

從D組選取最先開始死亡的15個個體和S組選取更具活力的15個個體, 每個個體取等量5 μL DNA溶液, 分別構(gòu)成耐低溫DNA池和不耐低溫DNA池。

1.6 PCR擴增和聚丙烯酰胺凝膠電泳

利用148對微衛(wèi)星引物分別對耐低溫DNA池和不耐低溫DNA池進(jìn)行PCR擴增, 尋找差異條帶。PCR反應(yīng)體系為20 μL: 1 μL DNA溶液, 1 μL上游引物, 1 μL下游引物, 10 μL 2 × Taq PCR Mix, 7 μL滅菌雙蒸水。PCR擴增反應(yīng)條件: 94 ℃預(yù)變性10min; 94 ℃變性5 s, 按每對引物實際退火溫度反應(yīng)50 s, 72 ℃延伸50 s, 共35個循環(huán); 72 ℃延伸10 min。在擴增出來的20 μL產(chǎn)物中加入5 μL 6 × LoadingBuffer, 95 ℃ 5 min, 立即冰浴10 min。產(chǎn)物在5%的非變性聚丙烯酰胺凝膠(30%丙烯酰胺預(yù)混液83.3 mL、尿素 210.2 g、10 × TBE 50 mL, 加蒸餾水定容至500 mL), 上樣量4 μL, 恒壓100 V, 電泳6 h。電泳結(jié)束后, 采用銀染法(4 g硝酸銀, 2 000 mL蒸餾水)對PAGE膠進(jìn)行搖床染色10 min, 用雙蒸水沖洗1 min, 減少背景色, 用顯影液(30 g 氫氧化鈉, 4 mL甲醛, 2 000 mL蒸餾水)進(jìn)行搖床顯影, 待出現(xiàn)淺色條帶, 立即停止顯色并用大量雙蒸水沖洗1 min, 然后立即在白光下進(jìn)行拍照保存電泳結(jié)果。

1.7 差異條帶個體驗證

通過2個混池DNA的PCR擴增情況, 初步篩選出能在2個池中能擴增出差異等位基因片段的微衛(wèi)星位點, 按照上述PCR擴增反應(yīng)條件對所有68個紅鰭東方鲀DNA樣本進(jìn)行PCR擴增, 分析差異等位基因片段在個體上具體的擴增情況。

1.8 數(shù)據(jù)分析

通過Bandscan軟件對電泳結(jié)果進(jìn)行分析, 獲取差異條帶的分布情況、堿基數(shù)以及泳動位置。用SPSS 18.0軟件對微衛(wèi)星引物在S組、D組個體中所擴增出的差異條帶頻率進(jìn)行卡方檢驗, 若卡方檢驗< 0.05 就認(rèn)為這個條帶在紅鰭東方鲀耐、不耐低溫個體中分布差異顯著。

2 實驗結(jié)果

2.1 BSA分池PCR擴增結(jié)果分析

用148對微衛(wèi)星引物對所構(gòu)建的耐低溫和不耐低溫DNA池進(jìn)行PCR擴增, 擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測, 均能發(fā)現(xiàn)擴增產(chǎn)物。對擴增產(chǎn)物用5%聚丙烯酰胺凝膠電泳并銀染, 有4個微衛(wèi)星位點(fms45、fms82、fms100和fms182)在S組、D組基因池間擴增出差異條帶(圖1)。使用Bandscan軟件計算出了差異條帶堿基數(shù), 其中位點fms45的差異條帶堿基數(shù)為125 bp和137 bp, 位點fms82差異條帶堿基數(shù)為98 bp和102 bp, 位點fms100差異條帶堿基數(shù)為116 bp和132 bp, 位點fms182差異條帶堿基數(shù)為125 bp。

2.2 差異條帶在個體中的擴增驗證

針對上述4個微衛(wèi)星位點, 在所有68個紅鰭東方鲀DNA樣本(包括混池樣本)進(jìn)行PCR擴增, 分析差異等位基因片段在個體上具體的擴增情況。4個微衛(wèi)星位點在紅鰭東方鲀驗證的個體擴增情況如圖2—圖5, 經(jīng)卡方檢驗, 只有引物fms100和fms182的擴增結(jié)果具有顯著差異, fms100擴增的116 bp和132 bp 的值分別為0.001和0.003, fms182擴增的125 bp條帶的值為0.045(圖6)。

圖1 微衛(wèi)星位點fms45、fms82、fms100、fms182在耐低溫和不耐低溫基因池擴增情況

注: M: 50 bp Marker; S: 耐低溫基因池; D: 不耐低溫基因池

圖2 微衛(wèi)星位點fms100的個體擴增驗證情況

注: M: 50 bp Marker; S: 耐低溫基因池; D: 不耐低溫基因池

3 討論

紅鰭東方鲀是我國重要的經(jīng)濟魚類, 由于其不耐低溫的特點, 目前北方多采用室外池塘和網(wǎng)箱養(yǎng)殖結(jié)合室內(nèi)池塘越冬的方式, 而越冬的成本偏高制約了紅鰭東方鲀產(chǎn)業(yè)的發(fā)展, 因此紅鰭東方鲀抗寒選育的需求愈發(fā)強烈。分子標(biāo)記輔助育種是借助與性狀緊密相關(guān)的分子標(biāo)記對具有性狀優(yōu)勢的等位基因或基因型的個體進(jìn)行直接選擇育種, 是分子生物學(xué)和基因組學(xué)的研究結(jié)果應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖品種選育的技術(shù)[8-11], 與傳統(tǒng)的表現(xiàn)型選擇相比, 不受等位基因間的顯隱性關(guān)系、其他基因效應(yīng)和環(huán)境因素的影響, 選擇結(jié)果可靠, 能夠提高選擇效率縮短育種年限, 克服了很多常規(guī)育種方法中的困難。

圖3 微衛(wèi)星位點fms45的個體擴增驗證情況

注: M: 50 bp Marker; S: 耐低溫基因池; D: 不耐低溫基因池

圖4 微衛(wèi)星位點fms82的個體擴增驗證情況

注: M: 50 bp Marker; S: 耐低溫基因池; D: 不耐低溫基因池

圖5 微衛(wèi)星位點fms182的個體擴增驗證情況

注: M: 50 bp Marker; S: 耐低溫基因池; D: 不耐低溫基因池

圖6 差異條帶在多個體驗證中的出現(xiàn)頻率統(tǒng)計

注: a1, a2分別為由fms100擴增的116 bp和132 bp條帶統(tǒng)計情況; b1, b2分別為由fms45擴增的125 bp和137 bp條帶統(tǒng)計情況; c1, c2分別為由fms82擴增的98 bp和102 bp條帶的統(tǒng)計情況; d1為由fms182擴增125b p條帶統(tǒng)計情況; S, D分別為耐低溫基因池和不耐低溫基因池

SSR分子標(biāo)記作為分析與重要經(jīng)濟性狀的遺傳連鎖關(guān)系理想的分子標(biāo)記, 在水產(chǎn)動物的育種方面也得到了廣泛的應(yīng)用[18-19]。李彩娟等[20]基于第二代測序技術(shù)對大鱗副泥鰍轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析獲得了15 106 個核心序列大于 12 bp 的 SSR, 并隨從中機選取400對SSR標(biāo)記, 91%有擴增產(chǎn)物。于洋等[21]使用微衛(wèi)星和線粒體控制區(qū)標(biāo)記用來對凡納濱對蝦新品種進(jìn)行鑒定, 準(zhǔn)確率達(dá)到了89%。關(guān)于紅鰭東方鲀SSR的研究也有部分報道, 多集中在篩選性別差異標(biāo)記和分析遺傳多樣性方面[22-23]。本研究針對紅鰭東方鲀耐低溫性狀, 篩選與之顯著相關(guān)的SSR分子標(biāo)記, 以期為后期的耐低溫選育工作提供科學(xué)的依據(jù)。

為了更好地獲得與紅鰭東方鲀耐低溫顯著相關(guān)的SSR分子標(biāo)記, 本研究根據(jù)Takagi等[16]和古川聡史[17]的報道, 選取了148個微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行篩選, 這些標(biāo)記能夠完全覆蓋紅鰭東方鲀微衛(wèi)星連鎖圖譜的23個連鎖群, 目前已有的相關(guān)研究大多涉及的標(biāo)記量較少或者缺少染色體的覆蓋信息[24-26], 而本研究中使用大量的覆蓋所有連鎖群的SSR標(biāo)記進(jìn)行篩選, 能夠使標(biāo)記的篩選工作更加細(xì)致全面, 更大概率獲得顯著性相關(guān)標(biāo)記。另一方面, 這樣的篩選方式也導(dǎo)致標(biāo)記數(shù)量較多, 若按照普通的微衛(wèi)星標(biāo)記篩選方案逐一進(jìn)行驗證, 工作量會非常大, 耗時耗力。而分群分離分析法BSA的運用大大減少了聚丙烯酰胺凝膠電泳的重復(fù)過程, 有效減少了工作量, 提升了工作效率。BSA是Michelmore等針對SSR標(biāo)記技術(shù)開發(fā)了分群分析法, 它首先利用具有表型差異的分離群體構(gòu)建具有目標(biāo)性狀差異的DNA池, 然后選擇合適的分子標(biāo)記對兩DNA池進(jìn)行目標(biāo)標(biāo)記的篩選, 最后用該分子標(biāo)記進(jìn)行單個體驗證[27]。此方法具有效率高、耗費少等優(yōu)點, 被廣泛應(yīng)用于相關(guān)標(biāo)記的篩選[27]。在作物培育領(lǐng)域, 陳艷萍[28]等利用SSR-BSA技術(shù)篩選出2個可能與玉米粗縮病抗性相關(guān)的分子標(biāo)記。高軼靜[29]等利用高抗和感病親本雜交的后代群體為材料, 采用SSR-BSA技術(shù)篩選出一個與甘蔗抗黑穗病性基因連鎖的SSR標(biāo)記。在魚類選育方面, 黃智慧等[30]采用SSR-BSA技術(shù)分析大菱鲆()耐高溫相關(guān)特性, 發(fā)現(xiàn)了3個與大菱鲆耐高溫性狀存在負(fù)相關(guān)性微衛(wèi)星位點, 并將獲得的兩個分子標(biāo)記 Sam-Usc27和saml-125INRA用于構(gòu)建耐大菱鲆品系, 顯著提高了大菱鲆整體的耐溫性能。鄒杰等[31]采用SSR-BSA技術(shù)對暗紋東方鲀生長性狀相關(guān)微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行篩選, 經(jīng)驗證實驗后獲得與生長性狀顯著相關(guān)的fms15、fms75兩個位點。

在我們的實驗結(jié)果中發(fā)現(xiàn), 通過對148個微衛(wèi)星位點在耐低溫和不耐低溫DNA池中的差異分析, 只有4個SSR標(biāo)記出現(xiàn)差異, 但進(jìn)一步的個體驗證后, 僅有2個標(biāo)記出現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異。這可能是由于我們選擇的群體來自養(yǎng)殖群體, 并非家系群體, 個體遺傳背景不同, 遺傳差異較大。一般說來遺傳背景單一的群體更容易獲得性狀相關(guān)的分子標(biāo)記, 這一點在很多魚類的家系內(nèi)分子標(biāo)記篩選中有所體現(xiàn), 但篩選到的標(biāo)記往往是家系內(nèi)特異的, 并不具有廣泛的適用性。本實驗選用的群體來自養(yǎng)殖群體, 遺傳多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn), 其e大于0.7, 遺傳多樣性豐富。從遺傳差異較大的群體中篩選得到的分子標(biāo)記具有更廣泛的適用性, 也就意味著本實驗篩選到的標(biāo)記可能具有更大的育種潛力。

綜上, 本研究采用SSR-BSA技術(shù), 初步獲得了兩個與紅鰭東方鲀耐低溫相關(guān)的分子標(biāo)記。這是國內(nèi)第一次關(guān)于紅鰭東方鲀耐低溫分子標(biāo)記的報道, 這為研究紅鰭東方鲀耐低溫的遺傳基礎(chǔ)以及相關(guān)分子機制提供了依據(jù), 也為開展紅鰭東方鲀耐低溫分子標(biāo)記輔助選育提供了良好的基礎(chǔ)。

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Screening and identification of microsatellite markers related to low temperature tolerance in

YUAN Chen-hao1, 3, LIU Zhi-feng2, 3, MA Ai-jun2, 3

(1. Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316000, China; 2. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China; 3. Laboratory for Marine Biology and BiotechnologyPilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao),Qingdao 266237China)

Microsatellites, combined with bulked segregation analysis (BSA), were used to screen for markers of low temperature tolerance in. A total of 68 individuals comprising 34 individuals from the low temperature tolerant group (S group) and 34 from the non-tolerant group (D group) were used in this study. Two DNA pools were constructed using 15 individuals each from the S and the D groups. The DNA pools were screened for low temperature tolerance markers using 148 pairs of microsatellite primers. Four primers pairs (fms45, fms82, fms100, and fms182) amplified differential bands in the S and the D groups. All 68 individuals were used to perform a single experience certificate for 4 markers. The results showed that the frequencies of the 116bp band from the fms100 primer in the S and the D groups were 53% and 18%, respectively The frequencies of the 132bp band from the fms100 primer were 59% (S Group) and 24% (D Group). The frequencies of the 125bp band from the fms182 primer in the S and the D groups were 12% and 35%, respectively. All p values from the chi-square test were 0.05, indicating significant differences among the band frequencies. This is the first report on molecular markers of low temperature tolerance in, which provides a baseline for (1) studying the genetic basis and related molecular mechanisms of low temperature tolerance inand (2) molecular marker–assisted breeding of the species.

; low temperature tolerance; microsatellite markers; SSR-BSA

Sep. 18, 2020

S917.4

A

1000-3096(2022)02-0097-08

10.11759/hykx20200918001

2020-09-18;

2020-10-30

國家重點研發(fā)計劃子課題-紅鰭東方鲀耐低溫的遺傳基礎(chǔ)(2018YFD0900301-12);中國水產(chǎn)科學(xué)研究院科技創(chuàng)新團隊(2020TD25)

[The Key Research and Development Plan of Nation, Genetic basis of low temperature tolerance in, No. 2018YFD0900301-12; The Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund, CAFS, No. 2020TD25]

袁晨浩(1995—), 男, 浙江紹興人, 學(xué)士, 研究方向為魚類遺傳育種, 電話: 18868018166, E-mail: 625029259@qq.com; 馬愛軍(1971—),通信作者, 研究方為魚類種質(zhì)創(chuàng)制與遺傳改良, E-mail: maaj@ysfri.ac.cn; 劉志峰(1987—), 通信作者, 博士, 研究方向為魚類繁育與育種, E-mail: liuzf@ysfri.ac.cn

(本文編輯: 楊 悅)