長牡蠣電壓門控鈣離子通道β亞基的無標(biāo)簽親和層析純化

劉鳳華, 王 淏, 賈喬雅, 畢允晨

長牡蠣電壓門控鈣離子通道β亞基的無標(biāo)簽親和層析純化

劉鳳華1, 2, 3, 王 淏1, 3, 賈喬雅1, 3, 畢允晨1, 2, 3

(1.中國科學(xué)院海洋研究所 中國科學(xué)院海洋大科學(xué)研究中心, 中國科學(xué)院和山東省實驗海洋生物學(xué)重點實驗室, 山東 青島 266071; 2. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049; 3. 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室 海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實驗室, 山東 青島 266237)

親和層析是一種廣泛使用的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù), 常用的親和標(biāo)簽包括谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)標(biāo)簽、多組氨酸(polyhistidine)標(biāo)簽等。然而, 外源親和標(biāo)簽可能會影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能, 通常需要酶切去除, 造成實驗流程加長、產(chǎn)率降低。某些蛋白質(zhì)具有與親和標(biāo)簽相似的氨基酸序列特征, 利用這種序列特征嘗試無標(biāo)簽純化可有效避免上述問題。本研究選取C端天然富含組氨酸殘基的長牡蠣電壓門控鈣離子通道(VGCC) β亞基進行無標(biāo)簽親和層析純化, 結(jié)果顯示, 氨基三乙酸鎳(Ni-NTA)能夠特異性地結(jié)合無標(biāo)簽的β亞基, 且結(jié)合能力與多組氨酸標(biāo)簽相當(dāng)。對β亞基C端組氨酸殘基分組突變后發(fā)現(xiàn), 隨著組氨酸殘基突變的增多, 各突變型β亞基與Ni-NTA的結(jié)合能力逐步下降。免疫印跡實驗結(jié)果表明, β亞基C端(HG)7序列在針對多組氨酸標(biāo)簽的抗體識別中發(fā)揮關(guān)鍵作用。VGCC β亞基的這種天然序列特征也可應(yīng)用于該膜蛋白復(fù)合體提取過程關(guān)鍵步驟的監(jiān)測。綜上, 本研究對氨基酸序列中具有親和標(biāo)簽特征的蛋白質(zhì)進行了無標(biāo)簽親和層析純化, 為具有相似特征蛋白質(zhì)的分離純化提供了參考。

電壓門控鈣離子通道; β亞基; 蛋白純化; 親和層析; 多組氨酸

蛋白質(zhì)是維持細胞結(jié)構(gòu)和功能完整的生物大分子, 許多疾病的發(fā)病機制均與關(guān)鍵蛋白質(zhì)的錯誤折疊、功能紊亂相關(guān)[1-2]。因此, 蛋白質(zhì)相關(guān)研究是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的重要研究方向[3], 獲得高純度的蛋白質(zhì)是首要和關(guān)鍵步驟。常用的蛋白質(zhì)分離純化方法有等電點沉淀[4]、離子交換層析[5]、分子排阻層析[6]、親和層析[7]、疏水作用層析[8]、電泳[9]等。其中, 親和層析具有特異性高、穩(wěn)定性好、成本低等優(yōu)點[10], 是蛋白質(zhì)分離純化的首選方法。

親和標(biāo)簽是一些對特定的生物或化學(xué)配體具有高度親和力的多肽, 選擇合適的親和標(biāo)簽將其融合到目的蛋白的N端或C端[11], 并與相應(yīng)的載有固定化配體的親和柱配合使用, 能在未去除核酸或其他細胞組分的情況下將目的蛋白的純度提升數(shù)百倍甚至數(shù)千倍[12]。親和標(biāo)簽與親和柱的結(jié)合往往是可逆的, 洗脫條件也比較溫和, 對純化條件敏感的蛋白質(zhì)以及蛋白質(zhì)復(fù)合體尤為適用[12]。目前, 常用的親和標(biāo)簽有多組氨酸(polyhistidine)標(biāo)簽, Flag標(biāo)簽, 谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)標(biāo)簽, 鏈霉親和素結(jié)合肽(SBP)標(biāo)簽, 麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)標(biāo)簽等等。需要注意的是, 雖然部分親和標(biāo)簽可以增加重組蛋白的溶解性、提高產(chǎn)量、甚至在一定條件下促進蛋白折疊[13], 但親和標(biāo)簽尤其是分子量較大的親和標(biāo)簽也容易給目的蛋白的結(jié)構(gòu)與功能帶來不利因素, 影響下游應(yīng)用[14]。以GST標(biāo)簽為例, 它是一種天然存在于真核細胞中發(fā)揮重要作用的轉(zhuǎn)移酶, 與目的蛋白融合后能提高重組蛋白溶解性, 但該標(biāo)簽的分子量較大(約26 kDa)且容易形成同型二聚體, 可能影響重組蛋白功能, 需要通過酶切的方式去除[15], 去除后常殘留額外的氨基酸殘基并伴隨樣品損失[16]。因此, 低分子量標(biāo)簽受到了一些研究者的青睞[3, 17]。最常用的低分子量標(biāo)簽是多組氨酸標(biāo)簽, 固定化的Co2+、Cu2+、Ni2+、Zn2+、Ca2+和Fe3+均可與多組氨酸標(biāo)簽融合蛋白結(jié)合, 其親和作用有賴于組氨酸的咪唑基與金屬離子的配位作用[18-19]。然而, 多組氨酸親和標(biāo)簽也存在諸多問題, 如影響重組蛋白的熱穩(wěn)定性[20], 降低重組蛋白活性[21]等。

馬曉川等[22]對PDB數(shù)據(jù)庫中蛋白質(zhì)的分析結(jié)果顯示, 天冬氨酸和谷氨酸的羧基、組氨酸的咪唑基以及半胱氨酸的巰基較多地參與了同金屬離子的配位。這些氨基酸多為極性氨基酸, 一般分布在蛋白質(zhì)的表面, 并且上述一種或幾種氨基酸可在某些蛋白質(zhì)特定結(jié)構(gòu)域富集[23-24]。目前, 可以利用特定氨基酸與金屬離子結(jié)合能力進行純化的蛋白通常含有極為豐富的組氨酸, histidine rich protein 2 ()即屬此類, 該蛋白共有326個殘基, 其中組氨酸殘基112個, 占34.4%[25-27]。除上述報道外, 少見基于蛋白質(zhì)天然序列的無標(biāo)簽純化。綜上, 本研究借助固定相金屬離子親和層析對C端富含組氨酸殘基的長牡蠣()電壓門控鈣離子通道(VGCC) β亞基進行了無標(biāo)簽親和層析純化, 通過多個組氨酸突變體的構(gòu)建進一步確定了該純化方法的序列基礎(chǔ), 并利用天然β亞基的這種序列特性, 輔助了VGCC蛋白復(fù)合體的原位提取關(guān)鍵步驟的監(jiān)測, 為具有相似特征的蛋白純化提供了參考。

1 材料與方法

1.1 序列分析

基于NCBI的非冗余蛋白序列數(shù)據(jù)庫, 對長牡蠣電壓門控鈣離子通道β亞基的氨基酸序列進行搜索, 并下載該蛋白在部分軟體動物、模式動物中的同源序列進行多序列比對分析。多序列比對借助BioEdit軟件[28]完成, 然后通過EMBOSS Needle(版本6.6.0)計算各同源序列與長牡蠣電壓門控鈣離子通道β亞基氨基酸序列的相似性[29]。

1.2 基因序列獲取

以長牡蠣為實驗動物對其閉殼肌進行分離, 研磨后, 使用Invitrogen的TRIzol? Reagent提取總RNA。接著, 用Vazyme公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)將得到的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA, 并以此為模板選用引物B1-F、B1-R(表1)進行PCR擴增。隨后, 使用Vazyme公司的5 min TM TA/Blunt-Zero Cloning Kit將PCR產(chǎn)物連接到pCE2載體中。取適量連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞, 涂布平板后37 ℃培養(yǎng)過夜, 挑取單菌落進行DNA測序鑒定獲得陽性克隆。

表1 PCR引物序列

注: 下劃線標(biāo)注的為組氨酸突變后的氨基酸殘基編碼的核苷酸序列

1.3 野生型表達載體構(gòu)建

選取1.2中獲得的陽性克隆為模板, 參照Ana Paula Jacobus等的同源重組方法[30], 使用表1中引物B2-F、B2-R進行PCR擴增, 將目的片段與線性化的pET-28a載體按一定比例混合并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α完成同源重組。通過對載體插入片段測序鑒定獲得大腸桿菌陽性克隆。

1.4 突變型表達載體構(gòu)建

為探究長牡蠣VGCC β亞基中參與Ni-NTA結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基, 本研究對多個不同位置的組氨酸殘基進行分組突變。突變型β亞基分別命名為M1 (包含的突變位點是H441S, H443S, H445S, H447A, H449S, H451A, H452A, H454A, H456A), M2(在突變型M1的基礎(chǔ)上增加突變位點H469G, H472A, H474S, H475S), M3(在突變型M2的基礎(chǔ)上增加突變位點H533A, H537G, H539S)。表1的引物序列中包含對相應(yīng)組氨酸突變后氨基酸殘基編碼的核苷酸序列, 用下劃線標(biāo)注。突變型表達載體構(gòu)建方法是, 突變型M1以1.3中的陽性克隆為模板, 使用引物M1-F、M1-R進行PCR擴增, 后續(xù)與1.3中野生型表達載體構(gòu)建相同。突變型M2的構(gòu)建選取M1的陽性克隆為模板, 引物使用M2-F、M2-R; 突變型M3的構(gòu)建選取M2的陽性克隆為模板, 引物使用M3-F、M3-R。

1.5 表達菌株的培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達

從已完成測序鑒定的陽性克隆中提取構(gòu)建成功的表達載體, 轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞BL21(DE3), 37 ℃培養(yǎng)過夜并挑取單克隆, 接種至卡那抗性的LB(lysogeny broth)液體培養(yǎng)基中, 37 ℃, 220 r/min培養(yǎng)8 h后, 按照1%的比例將表達菌株轉(zhuǎn)接至1 L的 LB液體培養(yǎng)基中, 加入卡那霉素至終質(zhì)量濃度50 μg/mL, 隨后在37 ℃搖床中220 r/min培養(yǎng)至OD值為1.0～1.2, 加入0.2 mmol/L異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)于18 ℃誘導(dǎo)蛋白表達12 h[31], 6 500 r/min離心10 min收集細菌沉淀。

1.6 VGCC β亞基純化

野生型和突變型β亞基的純化步驟完全一致。首先, 在等量野生型和各突變型菌體中加入等體積裂解緩沖液(25 mmol/L Tris-HCI、pH 8.8, 150 mmol/L NaCl, 1 mmol/L PMSF), 冰上均質(zhì)重懸后, 用高壓細胞破碎機進行破碎。隨后在4 ℃, 15 000 r/min離心1 h去除未破碎細胞碎片, 收集上清液并將其分別與等量Ni-NTA (Invitrogen)混合。借助旋轉(zhuǎn)混勻儀于4 ℃孵育120 min后, 用含10～500 mmol/L咪唑的等體積25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)緩沖液梯度洗脫, 各步留樣體積相同, 借此定性分析野生型和不同突變型β亞基對Ni-NTA的結(jié)合能力強弱。利用氨基三乙酸鎳(Ni-NTA)、亞胺基二乙酸銅(Cu-IDA)、亞胺基二乙酸鋅(Zn-IDA)純化蛋白時, 將樣品分為等體積的3份分別與等量的3種親和柱孵育, 純化步驟與上述相同, 各步洗脫及留樣體積保持一致。

1.7 SDS-PAGE凝膠電泳及免疫印跡分析

根據(jù)長牡蠣VGCC β亞基的分子量, 實驗選取濃度為12.5%的SDS-PAGE對各蛋白樣品進行分析鑒定, 各樣品留樣體積、加入的蛋白loading buffer及點樣量均保持一致。鑒于長牡蠣的VGCC β亞基C端含有多個組氨酸殘基, 實驗選用針對多組氨酸標(biāo)簽的一抗His-tag (27E8) mouse mAb (Cell Signaling Technology)和二抗anti-mouse IgG, HRP-linked antibody (Cell Signaling Technology)對包括突變型長牡蠣VGCC β亞基在內(nèi)的不同蛋白樣品進行免疫印跡分析, 以進一步確認目的蛋白條帶。蛋白量與其印跡條帶的面積和深淺具有相關(guān)性[32], 通過ImageJ計算不同樣品印跡條帶的灰度值, 從而實現(xiàn)定量分析。

1.8 長牡蠣閉殼肌中VGCC蛋白復(fù)合體的原位提取

分離長牡蠣閉殼肌, 研磨后加入裂解緩沖液(10 mmol/L MOPS-Na、pH 7.4, 0.3 mol/L 蔗糖, 0.5 mmol/L EDTA, 復(fù)配蛋白酶抑制劑)均質(zhì)重懸破碎細胞。隨后4 ℃, 6 450 r/min離心5 min, 收集上清液均分為2份作為不同去垢劑實驗組。超速離心(4 ℃, 41 500 r/min離心1 h)收集膜組分, 分別加入等體積含1%毛地黃皂苷(digitonin)或1% glyco-diosgenin (GDN)去垢劑的緩沖液(20 mmol/L MOPS-Na、pH 7.4, 100 mmol/L NaCl, 0.5 mmol/L CaCl2, 復(fù)配蛋白酶抑制劑)重懸后, 4 ℃過夜孵育增溶[33], 再次超速離心(73 400 r/min, 30 min)去除不溶組分, 收集含有VGCC蛋白復(fù)合體的上清液用于后續(xù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列分析

VGCC是真核細胞中鈣離子內(nèi)流的主要通道, 在神經(jīng)和肌肉生理活動中發(fā)揮重要功能。其最多包含5個亞基: α1亞基, α2亞基, β亞基, δ亞基和γ亞基。如圖1所示, 將長牡蠣VGCC β亞基的氨基酸序列與多個同源序列進行比對, 結(jié)果表明, 長牡蠣VGCC β亞基存在兩段在同源蛋白中較為保守的氨基酸序列, 分別為68～130位氨基酸組成的SH3結(jié)構(gòu)域和229～409位氨基酸組成的Guanylate kinase結(jié)構(gòu)域[34]。與脊椎動物相比, 其他軟體動物的β亞基氨基酸序列與長牡蠣的相似性更高, 例如, 扇貝的序列相似性為67.6%, 而脊椎動物兔子的序列相似性為49.8%。長牡蠣β亞基序列C端存在3組聚集的組氨酸殘基, 分別用紅色、橙色、黃色標(biāo)注。紅色標(biāo)注的(HG)7序列在真核生物CDF蛋白家族也有報道, 其loop 4含有富含組氨酸的序列(HX), 其中X通常是G或C,=3～6。這些序列可能參與了生理活動中與金屬離子的結(jié)合[35]。除此之外, 對比圖1中列出的脊椎動物β亞基氨基酸序列發(fā)現(xiàn), 軟體動物β亞基的C端普遍存在多組聚集的組氨酸序列(紫色標(biāo)注), 尤其是海蝸牛β亞基C端的H3、H6序列。天冬氨酸殘基也常與聚集的組氨酸殘基同時出現(xiàn)。軟體動物VGCC β亞基C端富含的組氨酸序列與功能之間的關(guān)系還有待進一步探索與研究。

注: 藍色部分為一致性100%的殘基, 淺藍色部分為相似殘基(Threshhold % for shading設(shè)為60%)。3組組氨酸殘基分別用紅、橙、黃色標(biāo)記, 突變體M1對應(yīng)紅色區(qū)域中組氨酸殘基突變, 突變體M2對應(yīng)紅色及橙色區(qū)域中組氨酸殘基突變, 突變體M3對應(yīng)紅、橙、黃色區(qū)域中組氨酸殘基全突變, 其他物種序列中聚集的組氨酸殘基用紫色標(biāo)記。氨基酸序列的Accession number如下: 長牡蠣() XP_011429591.2, 扇貝() XP_033728564.1, 海蝸牛() XP_035825861.1, 章魚() XP_029654560.1, 紫貽貝() VDI38901.1, 小鼠() XP_006497382.1, 人() XP_011517961.1, 非洲爪蟾() XP_041435102.1, 穴兔() NP_001075748.1

2.2 不同金屬離子親和柱選擇分析

通過分子克隆得到的長牡蠣VGCC β亞基序列, 經(jīng)DNA測序分析, 與NCBI數(shù)據(jù)庫中長牡蠣VGCC β亞基X3亞型(Accession number: XP_011429591.2)完全一致。在未添加任何親和標(biāo)簽的情況下, 重組表達后獲得的蛋白分子量為63.7 kDa, 且該蛋白表達量較高。基于該重組蛋白的氨基酸序列, 借助C-I-TASSER On-line Server(https://zhanggroup.org// C-I-TASSER/)對長牡蠣VGCC β亞基的結(jié)構(gòu)進行預(yù)測, 結(jié)果表明β亞基C端3組較為連續(xù)的組氨酸殘基均位于柔性較大的區(qū)域, 有利于固定相金屬親和層析方法的運用。

在柱料體積滿足目的蛋白載量要求的前提下, 未添加親和標(biāo)簽的β亞基與Ni-NTA、Cu-IDA及Zn-IDA金屬離子親和柱的親和實驗結(jié)果顯示(圖2), Ni-NTA親和實驗中, 在200～500 mmol/L咪唑濃度下目的蛋白洗脫量最大, 低咪唑濃度對目的蛋白洗脫能力微弱; Cu- IDA與Zn-IDA的表現(xiàn)類似, 在咪唑物質(zhì)的量濃度為10 mmol/L時, 二者均開始出現(xiàn)少量β亞基洗脫, 且隨著咪唑濃度的逐漸增加, β亞基洗脫量逐步加大。質(zhì)譜結(jié)果顯示(數(shù)據(jù)未展示), 圖2中分子量50～ 70 kDa間的條帶均為目的蛋白VGCC β亞基, 其呈現(xiàn)的分子量大小差異原因未知。綜上, 長牡蠣VGCC β亞基C端天然存在的3組較為連續(xù)的組氨酸殘基可與Ni2+、Cu2+、Zn2+等幾種不同的金屬離子親和柱結(jié)合, 通過分析咪唑梯度洗脫得到的目的蛋白的相對比例和洗脫趨勢, 后續(xù)實驗均選用更易獲得的Ni-NTA進行分析。

2.3 長牡蠣VGCC β亞基的純化

為明確長牡蠣VGCC β亞基中參與Ni-NTA結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸殘基, 本研究對其C端3組較為連續(xù)的組氨酸殘基(圖1)進行了分組突變, 并在相同的親和層析純化條件下, 選用不同濃度的咪唑(10～300 mmol/L)進行梯度洗脫。圖3a顯示, 野生型β亞基與Ni-NTA的結(jié)合能力最強, 咪唑濃度為300 mmol/L時β亞基有峰值洗脫, 該洗脫濃度與多組氨酸標(biāo)簽親和層析方法純化蛋白通常使用的洗脫濃度相等, 顯示其同Ni-NTA的結(jié)合能力與多組氨酸標(biāo)簽相當(dāng)。相比之下, 突變型β亞基與Ni-NTA的結(jié)合能力顯著下降, 且隨著組氨酸殘基突變數(shù)量的增多, 各突變體與Ni-NTA的結(jié)合能力逐漸變?nèi)? 較低濃度咪唑即可洗脫大部分β亞基突變體。為了更好的對洗脫的β亞基進行量化和對比, 借助ImageJ對圖3a中的目的蛋白條帶進行灰度值計算(表2)。突變體M1在咪唑濃度為80 mmol/L時出現(xiàn)峰值洗脫; 突變體M2在60 mmol/L咪唑時出現(xiàn)峰值洗脫; 突變體M3的洗脫峰值對應(yīng)的咪唑濃度為20 mmol/L。

圖2 長牡蠣電壓門控鈣離子通道β亞基的不同金屬離子親和層析純化

注: 不同金屬離子親和層析純化過程中, 不同濃度咪唑梯度洗脫樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果, 使用考馬斯亮藍染色; Marker為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn), Flow through為親和層析流穿樣品

圖3 野生型及突變型長牡蠣電壓門控鈣離子通道β亞基的純化

注: (a)為Ni-NTA親和層析純化過程中不同濃度咪唑洗脫樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果, 使用考馬斯亮藍染色; (b)為Ni-NTA親和層析純化過程中部分濃度咪唑洗脫樣品的聚丙烯酰胺凝膠電泳(左)和對應(yīng)的蛋白質(zhì)免疫印跡(右)結(jié)果, 聚丙烯酰胺凝膠電泳使用考馬斯亮藍染色, 蛋白質(zhì)免疫印跡所用一抗為組氨酸標(biāo)簽特異性鼠源單抗, 二抗為HRP偶聯(lián)的鼠IgG特異性抗體; Marker為蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)

表2 咪唑梯度洗脫樣品SDS-PAGE目的蛋白條帶灰度值分析

注: 上述為圖3a中目的蛋白條帶灰度值的計算結(jié)果, 背景值為空白, 以“樣品扣除空白后的灰度值與空白灰度值的比值”表示; “—”表示無該樣品

選取圖3a中的部分樣品進行蛋白質(zhì)免疫印跡實驗(圖3b)。M1雖然仍可與Ni-NTA有較好的結(jié)合, 但是其印跡信號較野生型β亞基明顯減弱, 說明(HG)7序列中的組氨酸殘基是多組氨酸標(biāo)簽抗體識別的關(guān)鍵位點。對剩余2組組氨酸殘基進一步突變得到的M2、M3突變體難以檢測到可靠免疫印跡信號(數(shù)據(jù)未展示)。

2.4 長牡蠣VGCC蛋白復(fù)合體的原位提取及免疫印跡檢測

長牡蠣是一種海洋軟體動物, 并非模式動物, 其研究過程中, 常遇到缺少特異性抗體的情況。前述蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示, 重組表達的長牡蠣VGCC β亞基C端天然(HG)7序列能與多組氨酸標(biāo)簽抗體特異性結(jié)合, 因此, 在提取長牡蠣VGCC蛋白復(fù)合體時, 選用針對多組氨酸標(biāo)簽的一抗及相應(yīng)二抗對VGCC蛋白復(fù)合體中β亞基進行免疫印跡分析, 可以監(jiān)測蛋白復(fù)合體提取情況。結(jié)果顯示, 在從長牡蠣閉殼肌中原位提取VGCC蛋白復(fù)合體的過程中, 天然存在的β亞基仍然具有明確的免疫印跡信號。在提取過程中, 經(jīng)超速離心和去垢劑增溶后, 水溶性的β亞基主要位于膜組分中, 部分證明了VGCC蛋白復(fù)合體的完整性。作為VGCC蛋白復(fù)合體的一部分, β亞基的含量是VGCC蛋白復(fù)合體含量的合理指征, 分析β亞基的含量, 可以輔助優(yōu)化VGCC蛋白復(fù)合體的提取條件。據(jù)圖4中β亞基含量分布, digitonin是更適合VGCC復(fù)合體增溶的去垢劑。

圖4 長牡蠣電壓門控鈣離子通道蛋白復(fù)合體的原位提取

注: 泳道1為細胞裂解后6 450 r/min離心的上清; 泳道2為細胞裂解后6 450 r/min 離心的沉淀; 泳道3為41 500 r/min超速離心后的上清; 泳道4為去垢劑digitonin增溶后73 400 r/min超速離心的上清; 泳道5為去垢劑digitonin增溶后73 400 r/min超速離心的沉淀; 泳道6為去垢劑GDN增溶后73 400 r/min超速離心的上清; 泳道7為去垢劑GDN增溶后73 400 r/min超速離心的沉淀

3 討論

蛋白質(zhì)純化是生命科學(xué)研究中重要的一環(huán), 方法多樣, 應(yīng)用靈活。在實際研究中, 為滿足蛋白質(zhì)的純度要求以及更好地適應(yīng)下游需求, 研究者往往會選用多種純化方法綜合應(yīng)用, 如先借助親和層析去除絕大部分的雜蛋白, 然后根據(jù)蛋白質(zhì)分子量的不同通過分子排阻層析對樣品進一步分離, 使目的蛋白的純度逐步提升。選用親和層析進行蛋白純化時, 目的蛋白與親和柱結(jié)合的特異性以及親和力均為重要的考慮因素。一般來說特異性越高、親和力越強, 越有利于通過淋洗去除更多的雜質(zhì), 獲得足量高純度的蛋白。在目的蛋白的C/N端融合外源親和標(biāo)簽是實現(xiàn)上述目標(biāo)的有效方法。

當(dāng)目的蛋白具有與親和標(biāo)簽相似的氨基酸序列特征時, 能否利用該序列特征實現(xiàn)高效的無標(biāo)簽親和層析純化是本研究的重點。結(jié)果表明, 長牡蠣VGCC β亞基C端天然存在的富含組氨酸殘基的序列能夠滿足Ni-NTA親和層析的要求。而在該蛋白C端和N端分別添加多組氨酸標(biāo)簽后, 相同親和層析條件下, 無論是純度還是得率均無顯著優(yōu)勢(數(shù)據(jù)未展示)。

Wu等人[36]在對兔子VGCC蛋白復(fù)合體進行純化時, 為減少樣品損失省去了分子排阻層析的步驟, 由此可見, 在樣品量受限的情況下, 通過減少純化步驟提高最終產(chǎn)量是必要的。無標(biāo)簽親和層析法利用目的蛋白自身氨基酸序列特點, 避免了融合標(biāo)簽使用后對目的蛋白結(jié)構(gòu)和功能的影響, 省去了酶切去除外源標(biāo)簽的步驟, 減少了對目的蛋白產(chǎn)量的影響。

蛋白復(fù)合體亞基數(shù)量多, 表達純化復(fù)雜, 常用原位提取的方法, 無法依賴外源標(biāo)簽, 且非模式生物來源的蛋白質(zhì)缺乏特異性抗體, 難以通過常用的免疫印跡方法對提取過程進行監(jiān)測。本研究的實驗結(jié)果顯示, 原位提取的VGCC蛋白復(fù)合體中存在的β亞基具有明確的免疫印跡信號, 成為篩選增溶去垢劑等提取條件優(yōu)化的重要參考, 可以在非模式生物蛋白復(fù)合體研究中發(fā)揮重要作用。

無標(biāo)簽親和層析純化的方法也存在一定的局限性。本研究結(jié)果顯示, 長牡蠣VGCC β亞基M2、M3突變體蛋白仍可與Ni-NTA結(jié)合, 但難以獲得可靠免疫印跡信號。因此, 能與Ni-NTA親和柱結(jié)合的蛋白未必可以借助多組氨酸標(biāo)簽的抗體進行免疫印跡檢測, 可能由于免疫印跡方法對組氨酸殘基的連續(xù)性要求更高。

4 結(jié)論

本研究選取C端天然富含組氨酸殘基的長牡蠣電壓門控鈣離子通道β亞基, 開展了無標(biāo)簽親和層析純化。結(jié)果表明, 長牡蠣VGCC β亞基可與Ni2+、Cu2+、Zn2+等多種金屬離子親和柱有效結(jié)合, 其中與Ni-NTA的結(jié)合能力最強, 組氨酸殘基的數(shù)量與結(jié)合能力正相關(guān)。另外, 本研究發(fā)現(xiàn)針對多組氨酸標(biāo)簽的抗體可用于(HG)7序列的蛋白質(zhì)免疫印跡分析, 并將其進一步應(yīng)用于VGCC蛋白復(fù)合體的提取過程中。本研究為具有相似序列特征的蛋白質(zhì)純化提供了重要參考, 也為缺少特異性抗體的蛋白復(fù)合體的原位提取過程監(jiān)測提供了思路。

[1] NEVONE A, MERLINI G, NUVOLONE M. Treating protein misfolding diseases: therapeutic successes agai-nst systemic amyloidoses[J]. Frontiers in Pharmacology, 2020, 11: 1024.

[2] CHAUDHURI T K, PAUL S. Protein-misfolding disea-ses and chaperone-based therapeutic approaches[J]. FEBS Journal, 2006, 273(7): 1331-1349.

[3] GR?SLUND S, NORDLUND P, WEIGELT J, et al. Protein production and purification[J]. Nature Methods, 2008, 5(2): 135-146.

[4] THEKKILAVEEDU S, KRISHNASWAMI V, MOHANAN D P, et al. Lactic acid-mediated isolation of alpha-, beta- and kappa-casein fractions by isoelectric precipitation coupled with cold extraction from defatted cow milk[J]. International Journal of Dairy Technology, 2019, 73(1): 31-39.

[5] RAJESH S, CRANDALL C, SCHNEIDERMAN S, et al. Cellulose-graft-polyethyleneamidoamine anion-exchange nanofiber membranes for simultaneous protein adsorption and virus filtration[J]. ACS Applied Nano Materials, 2018, 1(7): 3321-3330.

[6] CAI W X, TUCHOLSKI T, CHEN B F, et al. Top-down proteomics of large proteins up to 223 kDa enabled by serial size exclusion chromatography strategy[J]. Analytical Chemistry, 2017, 89(10): 5467-5475.

[7] LIU S X, LI Z H, YU B, et al. Recent advances on protein separation and purification methods[J]. Advances in Colloid and Interface Science, 2020, 284: 102254.

[8] LI B L, GUO F, HU H, et al. The characterization of column heating effect in nanoflow liquid chromatography mass spectrometry (nanoLC-MS)-based proteo-mics[J]. Journal of Mass Spectrometry, 2020, 55(1): e4441.

[9] XING J, WANG M H, WANG S, et al. Analysis of proteins by capillary electrophoresis with a novel diazore-sin/β-Cyclodextrin covalent capillary coating method[J]. Ferroelectrics, 2020, 563(1): 45-51.

[10] AYYAR B V, ARORA S, MURPHY C, et al. Affinity chromatography as a tool for antibody purification[J]. Methods, 2012, 56(2): 116-129.

[11] ZHAO X Y, LI G S, LIANG S F. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification[J]. Journal of Analytical Methods in Chemistry, 2013, 2013: 581093.

[12] LICHTY J J, MALECKI J L, AGNEW H D, et al. Com-parison of affinity tags for protein purification[J]. Protein Expression and Purification, 2005, 41(1): 98-105.

[13] WAUGH D S. Making the most of affinity tags[J]. Trends in Biotechnology, 2005, 23(6): 316-320.

[14] NOROUZI R, HOJATI Z, BADR Z. Overview of the recombinant proteins purification by affinity tags and tags exploit systems[J]. Journal of Fundamental and Applied Sciences, 2016, 8(3S): 90-104.

[15] HARPER S, SPEICHER D W. Purification of proteins fused to glutathione S-transferase[J]. Methods in Molecular Biology, 2011, 681: 259-280.

[16] WAUGH D S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags[J]. Protein Expression and Purification, 2011, 80(2): 283-293.

[17] UHLéN M, FORSBERG G, MOKS T, et al. Fusion proteins in biotechnology[J]. Current Opinion in Biotechnology, 1992, 3(4): 363-369.

[18] RIGUERO V, CLIFFORD R, DAWLEY M, et al. Immobilized metal affinity chromatography optimization for poly-histidine tagged proteins[J]. Journal of Chromatography A, 2020, 1629: 461505.

[19] KIMPLE M E, BRILL A L, PASKER R L. Overview of affinity tags for protein purification[J]. Current Protocols in Protein Science, 2013, 73: 9.9.1-9.9.26.

[20] BOOTH W T, SCHLACHTER C R, POTE S, et al. Im-pact of an N-terminal polyhistidine tag on protein ther-mal stability[J]. ACS Omega, 2018, 3(1): 760-768.

[21] MAJOREK K A, KUHN M L, CHRUSZCZ M, et al. Double trouble-buffer selection and his-tag presence may be responsible for nonreproducibility of biomedical experiments[J]. Protein Science, 2014, 23(10): 1359-1368.

[22] 馬曉川, 費浩. 金屬配位在多肽與蛋白質(zhì)研究中的應(yīng)用[J]. 化學(xué)進展, 2016, 28(2/3): 184-192.

MA Xiaochuan, FEI Hao. The use of metal coordination in peptide and protein research[J]. Progress in Che-mistry, 2016, 28(2/3): 184-192.

[23] WEISKIRCHEN R, MOSER M, WEISKIRCHEN S, et al. LIM-domain protein cysteine- and glycine-rich protein 2 (CRP2) is a novel marker of hepatic stellate cells and binding partner of the protein inhibitor of activated STAT1[J]. Biochemical Journal, 2001, 359: 485-496.

[24] REN D, PENNER N A, SLENTZ B E, et al. Histidine- rich peptide selection and quantification in targeted proteo-mics[J]. Journal of Proteome Research, 2004, 3(1): 37-45.

[25] CUN S J, LI H Y, GE R G, et al. A histidine-rich and cysteine-rich metal-binding domain at the C terminus of heat shock protein A from: implication for nickel homeostasis and bismuth susceptibility[J]. Journal of Biological Chemistry, 2008, 283(22): 15142-15151.

[26] SINGH B, MCCAFFERY J N, KONG A, et al. Puri-fication of native histidine-rich protein 2 (nHRP2) from Plasmodium falciparum culture supernatant, infected RBCs, and parasite lysate[J]. Malaria Journal, 2021, 20(1): 405.

[27] PATEL K K, POON I K, TALBO G H, et al. New me-thod for purifying histidine-rich glycoprotein from human plasma redefines its functional properties[J]. IUBMB Life, 2013, 65(6): 550-563.

[28] HALL T A. BioEdit: A user-friendly biological sequen-ce alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT[J]. Nuclc Acids Symposium Series, 1999, 41: 95-98.

[29] MADEIRA F, PARK Y M, LEE J, et al. The EMBL- EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019[J]. Nucleic Acids Research, 2019, 47(W1): W636-W641.

[30] JACOBUS A P, GROSS J. Optimal cloning of PCR fragments by homologous recombination in[J]. PloS One, 2015, 10(3): e0119221.

[31] WU J P, YAN Z, LI Z Q, et al. Structure of the voltage-gated calcium channel Cav1.1 complex[J]. Science, 2015, 350(6267): aad2395.

[32] MAHMOOD T, YANG P C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting[J]. North American Journal of Medical Sciences, 2012, 4(9): 429-434.

[33] ZHAO Y Y, HUANG G X, WU J P, et al. Molecular basis for ligand modulation of a mammalian voltage- gated Ca2+channel[J]. Cell, 2019, 177(6): 1495-1506.

[34] CHEN Y H, LI M H, ZHANG Y, et al. Structural basis of the alpha1-beta subunit interaction of voltage-gated Ca2+channels[J]. Nature, 2004, 429(6992): 675-680.

[35] PAULSEN I T, SAIER M H. A novel family of ubiquitous heavy metal ion transport proteins[J]. Journal of Membrane Biology, 1997, 156(2): 99-103.

[36] WU J P, YAN Z, LI Z Q, et al. Structure of the voltage-gated calcium channel Ca(v)1.1 at 3.6 A resolution[J]. Nature, 2016, 537(7619): 191-196.

Purification of voltage-gated calcium channel β subunit from Pacific oyster with tag-free affinity chromatography

LIU Feng-hua1, 2, 3, WANG Hao1, 2, JIA Qiao-ya1, 2, BI Yun-chen1, 2, 3

(1. CAS and Shandong Province Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Center for Ocean Mega-Science, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. Marine Biology and Biotechnology Laboratory, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Qingdao 266237, China)

Affinity chromatography is widely used in protein extraction and purification. Common affinity tags include the glutathione sulfhydryl transferase (GST) tag, the maltose-binding protein (MBP) tag, and the polyhistidine tag. However, the attachment of an exogenous affinity tag could affect the structure and function of the target protein, thus usually further removed via enzyme digestion, causing longer procedures and lower yields. Certain amino acid sequences, naturally found in some proteins, feature similarity to specific affinity tags. Tag-free purification based on this sequence feature may effectively avoid the mentioned problems. In this study, the voltage-gated calcium channel (VGCC) β subunit, which is naturally histidine-rich in the C-terminal, was purified with tag-free affinity chromatography. The results showed that Ni-NTA could specifically bind to the β subunit, and the binding ability is equivalent to that of the polyhistidine tag. Mutant β subunits showed gradual decreasing binding ability with Ni-NTA correlating to the number of mutated histidine residues. Western blot analysis with anti-His tag showed specific blotting of β subunit and the C-terminal (HG)7sequence was key to the antibody recognition. This natural amino acid feature of the VGCC β subunit was also successfully employed as indication of the VGCC complex integrity in the key steps of protein extraction. In summary, tag-free affinity chromatography purification strategy is performed in this study by relying on the natural amino acid sequence similarity to affinity tags found in some proteins, providing a reference for extraction and purification of proteins with similar characteristics.

voltage-gated calcium channel; β subunit; protein purification; affinity chromatography; polyhistidine

Dec. 31, 2021

Q816

A

1000-3096(2022)02-0087-10

10.11759/hykx20211231003

2021-12-31;

2022-01-05

青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室海洋生物學(xué)與生物技術(shù)功能實驗室引進人才支持計劃項目(YJ2019NO03)

[Talent Program from Marine Biology and Biotechnology Laboratory, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology, No. YJ2019NO03]

劉鳳華(1997—), 女, 山東濟南人, 碩士研究生, 主要從事海洋生物學(xué)研究, E-mail: liufenghua19@mails.ucas.ac.cn; 畢允晨(1982—),通信作者, 男, 研究員, 電話: 0532-82893630, E-mail: yunchenbi@qdio.ac.cn

(本文編輯: 楊 悅)