恩諾沙星、磺胺嘧啶和呋喃西林對(duì)共培養(yǎng)的萱藻絲狀體和膨脹色球藻生長(zhǎng)的影響

劉德舉, 張 敏, 莊英瑞, 畢 萌, 宮相忠

恩諾沙星、磺胺嘧啶和呋喃西林對(duì)共培養(yǎng)的萱藻絲狀體和膨脹色球藻生長(zhǎng)的影響

劉德舉, 張 敏, 莊英瑞, 畢 萌, 宮相忠

(中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院, 山東 青島 266003)

為有效抑制萱藻種質(zhì)保存和絲狀體擴(kuò)增時(shí)膨脹色球藻的污染, 本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用實(shí)驗(yàn)生態(tài)學(xué)法, 研究了恩諾沙星、磺胺嘧啶和呋喃西林3種抗菌藥對(duì)共培養(yǎng)的萱藻絲狀體和膨脹色球藻生長(zhǎng)的影響。結(jié)果顯示: 在5～100 mg/L范圍內(nèi), 50 mg/L恩諾沙星適于除去萱藻種質(zhì)保存或絲狀體擴(kuò)增過(guò)程中出現(xiàn)的膨脹色球藻, 實(shí)驗(yàn)第18 d膨脹色球藻的日均增長(zhǎng)率為–2.67%, 萱藻絲狀體的單室孢子囊發(fā)育良好; 在10～150 mg/L范圍內(nèi), 100 mg/L磺胺嘧啶能有效抑制膨脹色球藻的生長(zhǎng), 實(shí)驗(yàn)第18 d膨脹色球藻的日均增長(zhǎng)率為–0.58%, 萱藻絲狀體日均增長(zhǎng)率為2.91%, 單室孢子囊發(fā)育良好; 150 mg/L磺胺嘧啶會(huì)使萱藻絲狀體的部分細(xì)胞呈淺褐色, 單室孢子囊發(fā)育不良; 在1～20 mg/L范圍內(nèi), 20 mg/L呋喃西林能抑制膨脹色球藻的生長(zhǎng), 實(shí)驗(yàn)第18 d膨脹色球藻日均增長(zhǎng)率為–0.78%, 但同時(shí)影響了萱藻絲狀體的正常生長(zhǎng), 單室孢子囊發(fā)育不良。實(shí)驗(yàn)證明, 50 mg/L恩諾沙星和100 mg/L磺胺嘧啶最適于解決萱藻種質(zhì)保存和絲狀體擴(kuò)增過(guò)程中膨脹色球藻的污染。

萱藻; 絲狀體; 膨脹色球藻; 共培養(yǎng); 抗菌藥

萱藻()系廣溫性大型海藻, 隸屬于褐藻門(Phaeophyta), 褐子綱(Phaeosporeae), 萱藻科(Scytosiphonaceae), 廣泛分布于南美洲、北美洲、大洋洲、歐洲以及亞洲沿海海域, 在中國(guó)主要分布于遼東半島至廣東省海陵島之間的沿海海域[1-2]。萱藻生長(zhǎng)在在中潮帶、低潮帶的石頭、基巖等堅(jiān)硬的基質(zhì)及潮池中, 與其他海藻一起構(gòu)成近岸海洋初級(jí)生產(chǎn)者, 在海洋生態(tài)系統(tǒng)中扮演著重要的角色[3]。萱藻的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高, 富含氨基酸、蛋白質(zhì)、不溶性膳食纖維和脂肪等成分[4]。此外, 萱藻中還富含褐藻膠、巖藻聚糖酸內(nèi)酯及酚類物質(zhì)。褐藻膠有助于人體排鉛[5], 還可作為食品添加劑用來(lái)改良口感[6]; 巖藻聚糖酸內(nèi)酯有抗凝血及抗血栓的作用[7]; 萱藻多酚可通過(guò)清除羥自由基以達(dá)到抗衰老和美白的效果[8]。萱藻的乙醇提取物對(duì)人結(jié)腸癌腫瘤細(xì)胞(HT-29)具有很強(qiáng)的選擇性活性(LD50=1.49 μg/mL), 甲醇提取物對(duì)人肺腺癌腫瘤細(xì)胞(A-549)、白血病腫瘤細(xì)胞(HL-60)的抑制率大于80%[7, 9]。因此, 萱藻在食品、工業(yè)、醫(yī)藥和生態(tài)等方面發(fā)揮著重要作用, 是一種極具開發(fā)潛力的經(jīng)濟(jì)海藻。

膨脹色球藻()是一種藍(lán)藻, 隸屬于藍(lán)藻門(Cyanophyta), 色球藻目(Chroo-coc-cales),色球藻科(Chroococcaceae), 色球藻屬(), 生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中能產(chǎn)生種類繁多的次生代謝物, 這些次生代謝物釋放到水體中會(huì)對(duì)其他生物的生長(zhǎng)繁殖產(chǎn)生不利影響, 如膨脹色球藻的正己烷提取物對(duì)革蘭氏陰性菌有明顯的抑制作用[10]。萱藻在種質(zhì)保存和絲狀體擴(kuò)增過(guò)程中極易被膨脹色球藻污染, 若不及時(shí)抑制或清除, 膨脹色球藻會(huì)迅速繁殖并產(chǎn)生大量次生代謝物, 造成萱藻絲狀體發(fā)育不良, 生長(zhǎng)受阻甚至死亡。膨脹色球藻作為一種原核生物, 其細(xì)胞壁化學(xué)成分與細(xì)菌存在相似性, 細(xì)胞壁中均含有肽聚糖并存在抗生素分子的作用靶點(diǎn), 因此, 鏈霉素(100 mg/L)、氯霉素(10 mg/L)、卡那霉素(100 mg/L)和頭孢噻肟鈉(100 mg/L)等抗生素可作用于膨脹色球藻并抑制其生長(zhǎng)[11-12], 但以上抗生素經(jīng)多次使用后也會(huì)使病原菌產(chǎn)生耐藥性[13], 在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域中被禁止大量使用。

與某些微生物產(chǎn)生的抗生素相比, 人工合成的抗菌藥在養(yǎng)殖領(lǐng)域使用更加廣泛, 目前關(guān)于人工合成的抗菌藥對(duì)萱藻絲狀體和膨脹色球藻生長(zhǎng)的影響尚未見報(bào)道。因此, 研究應(yīng)用人工合成抗菌藥抑制膨脹色球藻的生長(zhǎng)對(duì)于萱藻的種質(zhì)保存和絲狀體擴(kuò)增具有積極意義。氟喹諾酮類抗菌藥和磺胺類抗菌藥被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域, 硝基呋喃類抗菌藥則曾在畜禽養(yǎng)殖業(yè)被廣泛使用。本文研究了3種抗菌藥恩諾沙星(enrofloxacin, ENFX)、磺胺嘧啶(sulfa-dia-zine, SD)和呋喃西林(nitrofurazone, NFZ)對(duì)共培養(yǎng)的膨脹色球藻和萱藻絲狀體生長(zhǎng)的影響, 比較了其對(duì)共培養(yǎng)體系中膨脹色球藻生長(zhǎng)的抑制效果, 該研究將為萱藻種質(zhì)保存和絲狀體擴(kuò)增時(shí)膨脹色球藻的污染問(wèn)題提供有效的解決方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 萱藻絲狀體

取自中國(guó)海洋大學(xué)海藻繁殖生物學(xué)研究室種質(zhì)庫(kù), 培養(yǎng)條件為: 溫度21 ℃、光照強(qiáng)度86.40～ 97.20 μmol/(m2·s)、光周期L︰D=14︰10, 培養(yǎng)液為F1培養(yǎng)液[14-15]。

1.1.2 膨脹色球藻

從被污染的萱藻種質(zhì)中分離出膨脹色球藻, 進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為: 溫度21 ℃, 光周期L︰D= 14︰10, 光照強(qiáng)度54.00～67.00 μmol/(m2·s), 培養(yǎng)液為F1培養(yǎng)液。

1.1.3 抗菌藥

三種抗菌藥恩諾沙星、磺胺嘧啶和呋喃西林均購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司, 根據(jù)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》[16]配置成溶液。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 三種抗菌藥對(duì)共培養(yǎng)的膨脹色球藻和萱藻絲狀體生長(zhǎng)的影響

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的萱藻絲狀體, 用組織勻漿機(jī)點(diǎn)切10次, 得到長(zhǎng)度為180～200 μm的絲狀體, 用200目篩絹過(guò)濾上述絲狀體并用無(wú)菌海水反復(fù)沖洗, 配制成生物量為0.5 mg/mL萱藻藻液, 取400 mL該藻液置于500 mL三角燒瓶中。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的膨脹色球藻接種到萱藻藻液中, 接種密度是1.0×104ind/mL, 各抗菌藥的濃度如表1所示, 每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)平行樣, 并設(shè)置對(duì)照組。在實(shí)驗(yàn)第0、3、6、9、12、15和18 d, 從各平行樣中取20 mL藻液, 稱量萱藻鮮重, 計(jì)數(shù)每0.1 μL藻液中膨脹色球藻細(xì)胞數(shù)量。培養(yǎng)條件為: 光周期L︰D=14︰10, 溫度21 ℃, 光照強(qiáng)度84.6～97.2 μmol/(m2·s)。通過(guò)計(jì)算日均增長(zhǎng)率來(lái)探究各抗菌藥對(duì)共培養(yǎng)的萱藻絲狀體和膨脹色球藻生長(zhǎng)的影響。

萱藻絲狀體日均增長(zhǎng)率的計(jì)算公式[17]:

=[(Lnt–Ln0)/]×100%, (1)

此公式中,表示萱藻絲狀體的日均增長(zhǎng)率;表示稱重的時(shí)間間隔(d);0表示萱藻絲狀體的起始鮮重;t表示萱藻絲狀體時(shí)的鮮重。

膨脹色球藻日均增長(zhǎng)率的計(jì)算公式[17]:

C=[(Lnt–Ln0)/]×100%, (2)

此公式中,C表示膨脹色球藻細(xì)胞的日均增長(zhǎng)率,表示稱重的時(shí)間間隔(d);0表示膨脹色球藻的起始細(xì)胞密度;t表示膨脹色球藻時(shí)的細(xì)胞密度。

表1 抗菌藥的實(shí)驗(yàn)濃度

注: -表示未設(shè)置該組別

1.2.2 三種抗菌藥停用后萱藻絲狀體的發(fā)育情況

共培養(yǎng)18 d后, 用200目篩絹過(guò)濾各平行樣中的藻液, 并用無(wú)菌海水反復(fù)沖洗, 將上述對(duì)照組和各實(shí)驗(yàn)組中的萱藻絲狀體分別配成0.5 mg/mL的藻液, 置于500 mL三角燒瓶中, 進(jìn)行孢子囊誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)。條件為: 溫度17 ℃, 光暗周期10L︰14D, 光照強(qiáng)度28.8～43.2 μmol/(m2·s) 。誘導(dǎo)20 d后, 從各平行樣中取少量藻液, 在顯微鏡下隨機(jī)取10個(gè)視野統(tǒng)計(jì)單室孢子囊細(xì)胞數(shù)及萱藻絲狀體細(xì)胞數(shù), 測(cè)量單室孢子囊直徑并計(jì)算孢子囊比例。

單室孢子囊比例的計(jì)算公式:

1.3 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS19.0和Sigmaplot10.0分析軟件進(jìn)行單因素方差分析, 使用IS Capture軟件進(jìn)行圖像采集和孢子囊直徑測(cè)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 恩諾沙星對(duì)膨脹色球藻和萱藻絲狀體生長(zhǎng)的影響

在5～100 mg/L范圍內(nèi), 恩諾沙星對(duì)膨脹色球藻的生長(zhǎng)均有抑制作用, 且隨著恩諾沙星濃度的增大, 抑制作用增強(qiáng)(圖1a)。第18 d, 50 mg/L和100 mg/L實(shí)驗(yàn)組中日均增長(zhǎng)率分別為–0.97%和–1.78%, 膨脹色球藻的生長(zhǎng)完全受抑制。觀察發(fā)現(xiàn), 對(duì)照組中的膨脹色球藻生長(zhǎng)旺盛, 單細(xì)胞的直徑為5～12 μm, 外被寬厚的膠質(zhì)鞘, 胞質(zhì)充盈, 呈藍(lán)綠色(圖2a)。50 mg/L實(shí)驗(yàn)組中, 色球藻的膠質(zhì)鞘變薄, 細(xì)胞呈淺藍(lán)綠色。100 mg/L實(shí)驗(yàn)組中, 未見膠質(zhì)狀群體, 膨脹色球藻多以單細(xì)胞的形式存在, 呈淺藍(lán)綠色, 細(xì)胞的直徑為4～8 μm, 部分細(xì)胞發(fā)生解體(圖2b)。

圖1 恩諾沙星對(duì)膨脹色球藻與萱藻絲狀體生長(zhǎng)發(fā)育的影響

注: 不同字母表示差異性顯著(<0.05)

在5～20 mg/L范圍內(nèi), 萱藻絲狀體日均增長(zhǎng)率隨著恩諾沙星濃度的增大而升高, 在20～100 mg/L范圍內(nèi), 日均增長(zhǎng)率隨著濃度的增大而降低(圖1b)。實(shí)驗(yàn)第18 d, 100 mg/L實(shí)驗(yàn)組日均增長(zhǎng)率(1.33%)低于對(duì)照組(2.74%), 萱藻絲狀體的生長(zhǎng)受到抑制。50 mg/L實(shí)驗(yàn)組中萱藻絲狀體日均增長(zhǎng)率為3.18%, 觀察發(fā)現(xiàn), 萱藻絲狀體長(zhǎng)勢(shì)良好, 細(xì)胞呈深褐色, 胞質(zhì)充盈(圖2c); 100 mg/L實(shí)驗(yàn)組中絲狀體的部分細(xì)胞呈淺褐色,原生質(zhì)體收縮成一小團(tuán)并聚集到細(xì)胞的一端(圖2b)。

在整個(gè)誘導(dǎo)周期, 50 mg/L實(shí)驗(yàn)組的單室孢子囊比例均高于對(duì)照組, 孢子囊發(fā)育較好, 100 mg/L實(shí)驗(yàn)組的單室孢子囊比例均低于對(duì)照組, 孢子囊發(fā)育較差。實(shí)驗(yàn)第20 d, 對(duì)照組、50 mg/L實(shí)驗(yàn)組和100 mg/L實(shí)驗(yàn)組的單室孢子囊比例分別為6.52%、8.56%和5.64%, 單室孢子囊直徑分別為(18.02±0.12) μm、(19.35± 1.04) μm和(14.32±0.51) μm。

圖2 共培養(yǎng)18d時(shí)膨脹色球藻和萱藻絲狀體的生長(zhǎng)情況

注: 箭頭a指示的是萱藻絲狀體細(xì)胞, 箭頭b指示的是膨脹色球藻細(xì)胞

綜上分析, 50 mg/L和100 mg/L恩諾沙星均能有效抑制膨脹色球藻的生長(zhǎng), 50 mg/L實(shí)驗(yàn)組中萱藻絲狀體的生長(zhǎng)發(fā)育未受影響, 但100 mg/L實(shí)驗(yàn)組中萱藻絲狀體生長(zhǎng)狀況差且單室孢子囊發(fā)育不良。因此, 在不影響萱藻絲狀體生長(zhǎng)發(fā)育的前提下, 50 mg/L恩諾沙星適于抑制共培養(yǎng)體系中膨脹色球藻的生長(zhǎng)。

2.2 磺胺嘧啶對(duì)膨脹色球藻和萱藻絲狀體生長(zhǎng)的影響

在10～150 mg/L范圍內(nèi), 膨脹色球藻的日均增長(zhǎng)率隨著磺胺嘧啶濃度的增加而降低(圖3a)。實(shí)驗(yàn)第18 d, 100 mg/L和150 mg/L實(shí)驗(yàn)組日均增長(zhǎng)率分別為–0.58%和–2.27%, 遠(yuǎn)低于對(duì)照組(20.21%), 膨脹色球藻的生長(zhǎng)完全受抑制。觀察發(fā)現(xiàn), 100 mg/L實(shí)驗(yàn)組中, 絕大部分膠質(zhì)群體的公共膠質(zhì)鞘被破壞并有內(nèi)容物流出, 細(xì)胞開始破碎(圖2d)。150 mg/L磺胺嘧啶對(duì)膨脹色球藻的抑制效果最明顯, 未發(fā)現(xiàn)具有完整結(jié)構(gòu)的細(xì)胞個(gè)體, 大數(shù)細(xì)胞破碎成碎片或碎渣并包裹在萱藻絲狀體周圍(圖2e)。

在10～100 mg/L范圍內(nèi), 萱藻絲狀體的日均增長(zhǎng)率均高于對(duì)照組; 150 mg/L實(shí)驗(yàn)組的日均增長(zhǎng)率均低于對(duì)照組(圖3b)。實(shí)驗(yàn)第18 d, 150 mg/L實(shí)驗(yàn)組的日均增長(zhǎng)率僅1.41%, 但未出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng), 萱藻絲狀體的生長(zhǎng)受到不利影響。觀察發(fā)現(xiàn), 100 mg/L實(shí)驗(yàn)組中的萱藻絲狀體長(zhǎng)勢(shì)良好, 胞質(zhì)充盈, 顏色為深褐色, 大多數(shù)細(xì)胞呈念珠狀(圖2d); 而150 mg/L實(shí)驗(yàn)組中多數(shù)細(xì)胞顏色變深, 呈黑褐色, 部分細(xì)胞的原生質(zhì)體皺縮或消失(圖2e)。

在整個(gè)誘導(dǎo)周期中, 10～100 mg/L實(shí)驗(yàn)組的單室孢子囊比例均高于對(duì)照組, 150 mg/L實(shí)驗(yàn)組的單室孢子囊比例低于對(duì)照組(圖3c)。實(shí)驗(yàn)第20 d, 100 mg/L實(shí)驗(yàn)組的單室孢子囊比例為7.13%, 單室孢子囊直徑為(19.71±0.44) μm; 150 mg/L實(shí)驗(yàn)組的單室孢子囊比例僅4.73%, 低于對(duì)照組(6.62%), 對(duì)照組的單室孢子囊直徑為(18.02±0.12) μm, 而150 mg/L實(shí)驗(yàn)組僅(12.24±1.02) μm, 與對(duì)照組相比較小。

綜上分析, 100 mg/L和150 mg/L磺胺嘧啶可有效抑制膨脹色球藻的生長(zhǎng), 100 mg/L實(shí)驗(yàn)組中的萱藻絲狀體能正常生長(zhǎng)發(fā)育, 但150 mg/L實(shí)驗(yàn)組中的萱藻絲狀體生長(zhǎng)狀況差且單室孢子囊發(fā)育不良。因此, 在不影響萱藻絲狀體生長(zhǎng)發(fā)育的前提下, 100 mg/L磺胺嘧啶可作為抑制共培養(yǎng)體系中膨脹色球藻生長(zhǎng)的最佳濃度。

圖3 磺胺嘧啶對(duì)膨脹色球藻與萱藻絲狀體生長(zhǎng)發(fā)育的影響

注: 不同字母表示差異性顯著(<0.05)

2.3 呋喃西林對(duì)膨脹色球藻和萱藻絲狀體生長(zhǎng)的影響

在1～20 mg/L范圍, 膨脹色球藻的日均增長(zhǎng)率隨著呋喃西林濃度的增加而逐漸降低(圖4a)。實(shí)驗(yàn)第18 d, 20 mg/L實(shí)驗(yàn)組中膨脹色球藻日均增長(zhǎng)率僅–0.78%, 與對(duì)照組(20.21%)相比差異顯著(<0.05), 膨脹色球藻的生長(zhǎng)完全被抑制。觀察發(fā)現(xiàn), 20 mg/L實(shí)驗(yàn)組中未見完整的單細(xì)胞個(gè)體或細(xì)胞群體, 細(xì)胞碎片呈淺藍(lán)綠色甚至無(wú)色(圖2f)。

在1～20 mg/L范圍, 萱藻絲狀體的日均增長(zhǎng)率隨著呋喃西林濃度的增加而逐漸降低(圖4b)。實(shí)驗(yàn)第18 d, 10 mg/L和20 mg/L實(shí)驗(yàn)組的日均增長(zhǎng)率分別為–1.06%和–3.26%, 均顯著低于對(duì)照組(2.74%) (<0.05), 萱藻絲狀體的生長(zhǎng)均受到抑制。觀察發(fā)現(xiàn), 20 mg/L實(shí)驗(yàn)組中, 萱藻絲狀體生長(zhǎng)狀況差, 部分細(xì)胞的原生質(zhì)體收縮, 細(xì)胞呈黃褐色或無(wú)色(圖2f)。

實(shí)驗(yàn)第18 d, 10 mg/L實(shí)驗(yàn)組中萱藻絲狀體的生長(zhǎng)完全被抑制, 日均增長(zhǎng)率為–1.06%; 膨脹色球藻的生長(zhǎng)未被完全抑制, 日均增長(zhǎng)率為4.6%。

在整個(gè)誘導(dǎo)周期, 萱藻絲狀體的單室孢子囊比例隨著呋喃西林濃度的增大而降低(圖4c)。實(shí)驗(yàn)第20 d, 20 mg/L實(shí)驗(yàn)組的單室孢子囊比例顯著低于對(duì)照組(6.52%)(<0.05)。觀察發(fā)現(xiàn), 20 mg/L實(shí)驗(yàn)組中的萱藻絲狀體的單室孢子囊呈游離態(tài), 直徑偏小, 僅(8.81±0.11) μm。

綜上分析, 在1～20 mg/L 范圍內(nèi), 20 mg/L呋喃西林能對(duì)膨脹色球藻的生長(zhǎng)進(jìn)行有效抑制, 但此濃度下的萱藻絲狀體生長(zhǎng)狀況差, 且單室孢子囊發(fā)育不良。因此, 在1～20 mg/L范圍內(nèi), 呋喃西林不適于抑制和清除萱藻絲狀體和膨脹色球藻共培養(yǎng)體系中的膨脹色球藻。

3 討論

恩諾沙星屬于氟喹諾酮類抗菌藥, 能抑制大多數(shù)細(xì)菌的DNA回旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV, 使細(xì)菌不能進(jìn)行正常的DNA復(fù)制與分裂, 最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡[18-19]。連鵬等[20]曾報(bào)道, 濃度低于10 mg/L的恩諾沙星對(duì)亞心形扁藻()的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用, 但濃度高于10 mg/L時(shí)會(huì)阻礙葉綠素的合成, 25 mg/L恩諾沙星對(duì)亞心形扁藻的生長(zhǎng)抑制率高達(dá)79.50%。由于膨脹色球藻外具有膠質(zhì)鞘, 低濃度的抗菌藥可能很難進(jìn)入藻細(xì)胞。在本研究中, 100 mg/L實(shí)驗(yàn)組從第12 d開始萱藻絲狀體日均增長(zhǎng)率低于未加抗菌藥的對(duì)照組但未出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng), 可能是因?yàn)槎髦Z沙星濃度過(guò)高阻礙了萱藻絲狀體葉綠素的合成, 光合作用不能正常進(jìn)行, 最終導(dǎo)致萱藻絲狀體細(xì)胞生長(zhǎng)滯緩。

圖4 呋喃西林對(duì)膨脹色球藻與萱藻絲狀體生長(zhǎng)發(fā)育的影響

注: 不同字母表示差異性顯著(<0.05)

Notes: Different letters indicate significant differences(<0.05)

磺胺嘧啶屬于磺胺類抗菌藥, 很多細(xì)菌的生命活動(dòng)離不開葉酸[21], 葉酸的合成需要對(duì)氨基苯甲酸(PABA)和二氫喋酸合成酶(DHPS)的參與, 磺胺類抗菌藥的結(jié)構(gòu)與PABA相似, 和PABA產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)拮抗作用, 從而干擾了PABA與DHPS合成葉酸[22]?；前粪奏た赡芡ㄟ^(guò)阻礙膨脹色球藻葉酸的合成抑制其生長(zhǎng)。趙玲等[23]曾報(bào)道, 高濃度(80 mg/L)的磺胺嘧啶會(huì)使球形棕囊藻()細(xì)胞嚴(yán)重破損從而抑制其生長(zhǎng), 在本研究中, 高濃度(150 mg/L)的磺胺嘧啶會(huì)使膨脹色球藻細(xì)胞破碎成碎片, 細(xì)胞破碎后的形態(tài)與趙玲等報(bào)道的細(xì)胞受損后的狀態(tài)一致。

呋喃西林屬于硝基呋喃類抗菌藥, 可以通過(guò)干擾細(xì)菌體內(nèi)的氧化還原酶系統(tǒng), 進(jìn)而阻礙菌體的糖代謝過(guò)程, 致使細(xì)菌代謝過(guò)程發(fā)生紊亂[24]。但是, 濫用硝基呋喃類抗菌藥會(huì)使藥物殘留在食物表面, 再通過(guò)食物鏈和食物網(wǎng)傳遞給人體, 產(chǎn)生致癌、致畸或致突變等毒副作用[25]。近年來(lái), 呋喃西林已禁止作為漁藥使用[26], 在本研究中呋喃西林僅用于解決實(shí)驗(yàn)室范圍內(nèi)萱藻種質(zhì)保存和絲狀體擴(kuò)增時(shí)膨脹色球藻的污染問(wèn)題, 以比較在水產(chǎn)養(yǎng)殖中允許使用與禁止使用的抗菌藥之間作用效果的差異。在1～20 mg/L范圍內(nèi), 呋喃西林對(duì)膨脹色球藻和萱藻絲狀體的生長(zhǎng)均產(chǎn)生了抑制作用, 20 mg/L時(shí)對(duì)二者的抑制作用最強(qiáng), 原因可能是高濃度的呋喃西林干擾了膨脹色球藻和萱藻絲狀體細(xì)胞的氧化還原酶系統(tǒng), 光合作用和呼吸作用不能正常進(jìn)行, 代謝活動(dòng)紊亂, 日均增長(zhǎng)率降低。

恩諾沙星、磺胺嘧啶對(duì)膨脹色球藻的抑制作用及對(duì)萱藻絲狀體生長(zhǎng)發(fā)育的影響存在差異性。通過(guò)比較相同濃度的恩諾沙星和磺胺嘧啶對(duì)共培養(yǎng)體系的影響發(fā)現(xiàn), 第18 d, 100 mg/L恩諾沙星和磺胺嘧啶實(shí)驗(yàn)組中膨脹色球藻的日均增長(zhǎng)率分別為–2.67%和–0.58%, 100 mg/L恩諾沙星實(shí)驗(yàn)組中萱藻絲狀體的部分細(xì)胞呈淺褐色, 原生質(zhì)體收縮成一小團(tuán)并聚集到細(xì)胞的一端(圖2b), 100 mg/L磺胺嘧啶實(shí)驗(yàn)組中萱藻絲狀體長(zhǎng)勢(shì)良好, 胞質(zhì)充盈, 顏色為深褐色, 大多數(shù)細(xì)胞呈念珠狀(圖2d)。停藥20 d后, 50 mg/L恩諾沙星實(shí)驗(yàn)組和100 mg/L磺胺嘧啶實(shí)驗(yàn)組萱藻絲狀體生長(zhǎng)發(fā)育未受影響, 絲狀體細(xì)胞胞質(zhì)充盈, 顏色為深褐色, 大多數(shù)細(xì)胞呈念珠狀(圖5)。由此推斷, 同一濃度下恩諾沙星對(duì)膨脹色球藻和萱藻絲狀體的抑制作用強(qiáng)于磺胺嘧啶。對(duì)于恩諾沙星、磺胺嘧啶聯(lián)合使用是否能更有效地清除膨脹色球藻, 有待進(jìn)一步探討。

圖5 停藥后20 d萱藻絲狀體的生長(zhǎng)情況

4 結(jié)論

本研究表明, 50 mg/L恩諾沙星和100 mg/L磺胺嘧啶既能有效抑制膨脹色球藻的生長(zhǎng), 又不影響萱藻絲狀體的生長(zhǎng)和單室孢子囊的發(fā)育, 可用于解決萱藻種質(zhì)保存和絲狀體擴(kuò)增過(guò)程中膨脹色球藻的污染。100 mg/L恩諾沙星和150 mg/L磺胺嘧啶對(duì)膨脹色球藻有更強(qiáng)的抑制效果, 但影響了萱藻絲狀體的正常生長(zhǎng)發(fā)育, 在實(shí)際應(yīng)用中, 可根據(jù)具體情況選擇合適的抗菌藥濃度。在1～20 mg/L范圍內(nèi), 呋喃西林不適于抑制和清除萱藻絲狀體和膨脹色球藻共培養(yǎng)體系中的膨脹色球藻。

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Effects of enrofloxacin, sulfadiazine and nitrofurazone on the growth of filaments ofandin the co-cultured condition

LIU De-ju, ZHANG Min, ZHUANG Ying-rui, BI Meng, GONG Xiang-zhong

(College of Marine Life Sciences, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

In order to inhibit the growth ofduring the germplasm preservation and the amplification of filaments of, effects of enrofloxacin, sulfadiazine and nitrofurazone on the growth of filaments ofandin the co-cultured condition are studied by experimental ecology methods. Results indicated that: ①In the range of 5～100mg/L, 50mg/L enrofloxacin is suitable for inhibitingfrom the germplasm preservation and the amplification of filaments of. The average daily growth rate ofis –2.67% and the development of unilocular sporangia of filaments ofis well on the 18th day; ②In the range of 10～150mg/L, 100mg/L is the optimum concentration of sulfadiazine to inhibit the growth of. On the 18th day, the average daily growth rate ofis –0.58%, the average daily growth rate ofis 2.91% and the development of unilocular sporangia of filaments ofis well; The growth of filaments ofis in bad condition and unilocular sporangia was poorly developed at 150mg/L; ③In the range of 1～20 mg/L, 20 mg/L nitrofurazone has the inhibitory effect onand the filaments of, the average daily growth rate ofis –0.78% on the 18th day, and at the same time, the normal growth of filaments ofalso be affect, and the unilocular sporangia developed poorly. All this experiments have proved that: 50mg/L enrofloxacin and 100mg/L sulfadiazine are suitable for solving the contamination ofduring the germplasm preservation and amplification of filaments of.

; filaments;; co-culture; antimicrobial

Oct. 12, 2020

Q14

A

1000-3096(2022)02-0046-09

10.11759/hykx20201012002

2020-10-12;

2021-01-22

山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2016GSF115042)

[The Key Research and Development Program of Shandong Province, No. 2016GSF115042]

劉德舉(1996—), 山東菏澤人, 碩士研究生, 主要從事海藻繁殖生物學(xué)研究, E-mail: q1074759745@163.com; 張敏(1994—), 共同第一作者, 山東聊城人, 碩士研究生, 主要從事海藻繁殖生物學(xué)研究, E-mail: m18753853893@163.com; 宮相忠(1963—), 山東青島人,通信作者, 教授, 主要從事海藻學(xué)、海藻實(shí)驗(yàn)生態(tài)學(xué)以及海藻繁殖生物學(xué)研究, E-mail: gxzhw@163.com

(本文編輯: 楊 悅)