水產(chǎn)養(yǎng)殖飼用微生態(tài)制劑研究進展

王國旭， 吳又多，， 胡馨月， 雷 茜， 車 鑒, 3， 徐永平, ， 李淑英， 薛 闖*

(1.大連理工大學 生物工程學院，遼寧 大連 116024；2.大連賽姆生物工程技術(shù)有限公司，遼寧 大連 116000；3.大連鑫玉龍海洋生物種業(yè)科技股份有限公司，遼寧 大連 116222)

我國最早于1990年微生態(tài)學會學術(shù)研討的會議紀要中第一次提出關(guān)于“微生態(tài)制劑”這一概念[1]，是指利用動物或環(huán)境中篩選、分離、鑒定出的益生功能菌株，經(jīng)過人工選育、發(fā)酵、制劑等工藝制備而成的具有調(diào)節(jié)動物營養(yǎng)保健及微生態(tài)平衡等功效的活菌制劑[2]。微生態(tài)制劑作為飼料添加劑，在畜禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)得到廣泛應(yīng)用，能夠調(diào)節(jié)動物腸道微環(huán)境，增強機體免疫力，促進生長發(fā)育，提高養(yǎng)殖產(chǎn)能與經(jīng)濟效益[3]。更為重要的是，水產(chǎn)養(yǎng)殖飼用微生態(tài)制劑還起到凈化環(huán)境水質(zhì)，降低營養(yǎng)氮素累積的作用，其帶來的環(huán)境友好及可持續(xù)發(fā)展效益十分顯著。根據(jù)中國知識產(chǎn)權(quán)局專利信息中心統(tǒng)計，我國微生態(tài)制劑發(fā)明專利最早申請于1990年，截至2020年，微生態(tài)制劑發(fā)明專利申請數(shù)共計2 199項，其中畜禽養(yǎng)殖飼用制劑占比居首位，水產(chǎn)養(yǎng)殖飼用制劑緊隨其后。隨著我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194號和246號公告的頒布實施，自2018年啟動實施獸用抗菌藥使用減量化行動，自2020年1月1日起停止生產(chǎn)進口促生長類藥物飼料添加劑(中藥類除外)，需每年組織開展獸藥殘留監(jiān)控和動物源細菌耐藥性監(jiān)測。基于此，微生態(tài)制劑勢必發(fā)揮重要的“減抗、替抗”作用，未來發(fā)展空間及市場容量極其可觀。

1 水產(chǎn)養(yǎng)殖飼用微生態(tài)制劑概述

根據(jù)《生物飼料標準及常用飼料法律法規(guī)(2019)》及《飼料添加劑品種目錄農(nóng)業(yè)部公告第2045號(3次修訂)》，水產(chǎn)養(yǎng)殖飼用益生菌主要包括芽胞桿菌(Bacillus)、乳桿菌(Lactobacillusbeijerinck)、雙歧桿菌(Bifidobacterium)、腸球菌(Enterococcus)、鏈球菌(Streptococcus)、片球菌(Pediococcus)、酵母菌(Yeast)、曲霉菌(Aspergillus)及光合細菌(Photosynthetic bacteria)等32種功能微生物，如枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、青春雙歧桿菌(Bifidobacteriumadolescentis)、產(chǎn)朊假絲酵母(Candidautilis)及沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)等。如表1所示水產(chǎn)養(yǎng)殖飼用益生菌種類及功能，首先，這些益生菌大多為兼性厭氧微生物，其腸道定殖與生存能力較強，能夠快速改善腸道菌群結(jié)構(gòu)，通過腸道氧氣競爭，分泌細菌素、胞外多糖、幾丁質(zhì)酶及蛋白酶等效應(yīng)，有效抑制病原微生物的滋生，從而起到防病治病的作用[4]。其次，這些益生菌能夠在機體內(nèi)產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，如游離氨基酸、維生素、益生因子等能夠增強益生菌群的協(xié)同共生作用，如淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶等能夠促進飼料消化與營養(yǎng)吸收，加快機體生長發(fā)育與增產(chǎn)增重。另外，這些益生菌還具有氧化、氨化、硝化、固氮等功能，可以將養(yǎng)殖水體中的飼料殘渣、動物排泄物等大分子有機物降解為二氧化碳、碳酸鹽、磷酸鹽和硫酸鹽等小分子化合物，有效減少氨氮、亞硝酸鹽等毒害物質(zhì)的積累，進而促進藻類光合作用及水質(zhì)凈化[5]。

表1 水產(chǎn)養(yǎng)殖飼用益生菌種類、代謝產(chǎn)物及調(diào)節(jié)作用Table 1 Species, metabolites and functions of probiotics used in aquaculture microecologics

續(xù)表1

2 養(yǎng)殖飼用微生態(tài)制劑的研究進展

據(jù)國家統(tǒng)計局發(fā)布的數(shù)據(jù)顯示，2019年我國魚類水產(chǎn)總產(chǎn)量高達3 746.9萬t，占水產(chǎn)總量的57.82%，蝦蟹養(yǎng)殖產(chǎn)量達到782.71萬t，占水產(chǎn)總量的12.08%。魚肉富含蛋白、鈣、磷及維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，而蝦肉中脂肪含量更少，蛋白含量可達20%，遠高于魚肉蛋白含量，且富含鉀、碘、鎂、磷、維生素A等中、微量營養(yǎng)元素。除魚蝦水產(chǎn)品外，2019年我國海參養(yǎng)殖面積達到24.67萬hm2，年產(chǎn)量17.17萬t，養(yǎng)殖規(guī)模居世界第一，直接經(jīng)濟收益超過300億元。海參具有高蛋白、低糖、低脂等特點，其蛋白含量高達80%，富含必需氨基酸及脂肪酸、維生素、酸性粘多糖、皂苷和膠原蛋白等有效活性成分，具有顯著的抗腫瘤、抗凝血、抗氧化、降血壓、降血脂、增強免疫等功效。早在1994年，微生態(tài)制劑就已成功用于虹鱒魚養(yǎng)殖過程。后續(xù)研究工作及養(yǎng)殖應(yīng)用結(jié)果表明，微生態(tài)制劑在魚類、蝦類、海參養(yǎng)殖過程中均發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，至今已廣泛應(yīng)用于草魚、雜交鱘、鱸魚、羅非魚、錦鯉、大口黑鱸、黃顙魚、凡納濱對蝦、南美白對蝦、羅氏沼蝦、克氏原螯蝦以及海參等水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)。總體來說，微生態(tài)制劑及其益生菌在魚類、蝦類、海參養(yǎng)殖中發(fā)揮的共性調(diào)節(jié)作用表現(xiàn)為補充益生菌群，抑制病原微生物滋生，提高養(yǎng)殖個體成活率，增強飼料利用與營養(yǎng)吸收，提高機體生長率與增重率，縮短養(yǎng)殖周期，改善環(huán)境水體質(zhì)量(表2)。

表2 微生態(tài)制劑及其益生菌在魚蝦及海參養(yǎng)殖中的調(diào)節(jié)作用Table 2 The functions of microecologics and probiotics in fish, shrimp and sea cucumber aquaculture

2.1 微生態(tài)制劑在魚類養(yǎng)殖中的應(yīng)用

近年來，針對魚類養(yǎng)殖產(chǎn)能與魚肉營養(yǎng)品質(zhì)，國內(nèi)外研究者在魚類飼用益生菌及微生態(tài)制劑開發(fā)方面取得了重要工作進展。例如，沈文英等[21]在飼料中添加枯草芽胞桿菌制劑，草魚增重率和生長率分別提高21.78%和6.67%，血清免疫球蛋白、補體含量分別提高了100%、123.08%，堿性磷酸酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶水平分別提高108.87%、44.23%和11.01%，機體總抗氧化能力提高了18.31%，肝胰還原型谷胱甘肽和抗氧化能力分別提高了51.39%和37.6%，表明機體自由基得到有效清除，魚肉脂質(zhì)過氧化得到緩解。邱燕[22]在飼料中按2 000 mg/kg比例添加枯草芽胞桿菌制劑，飼喂后的草魚比生長速率增加30.85%，腸道淀粉酶和蛋白酶活性分別提高32.15%和27.29%，料肉比下降31.22%，蛋白質(zhì)和脂肪沉積率分別提高5%和23%，魚肉組成及品質(zhì)得到顯著改善。張書環(huán)等[23]將枯草芽胞桿菌制劑按0.1%比例混拌飼料后飼喂雜交鱘，實驗結(jié)果顯示個體增重率與比生長速率分別提高了22.5%和0.02%·d-1。

除普遍使用的枯草芽胞桿菌制劑外，Midhun等[24]在飼料中按108cfu/g添加量混拌多粘芽胞桿菌制劑，羅非魚比生長速率由0.82%·d-1增至1.58%·d-1，飼料轉(zhuǎn)化率由0.22%降至0.10%，單體增重提高了89.03%。Serra等[25]在飼料中混拌蠟樣芽胞桿菌等復(fù)合制劑，歐洲鱸魚腸道菌群結(jié)構(gòu)得到明顯改善，同時對葡聚糖、木聚糖、半乳聚糖等糖類消化能力增強。乳酸菌、光合細菌及硝化細菌在魚類養(yǎng)殖中也發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用，如Mohammadian等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在魚飼料中添加5×107cfu/g嗜酸乳桿菌或保加利亞乳桿菌，虹鱒魚腸道消化酶活性和菌群結(jié)構(gòu)得到改善，同時機體免疫調(diào)節(jié)蛋白水平及非特性免疫應(yīng)答能力也得到相應(yīng)提升。史東杰等[27]利用丁酸梭菌、糞腸球菌及枯草芽胞桿菌混合制劑飼喂錦鯉，雌魚性腺發(fā)育加快，多不飽和脂肪酸含量提高40.9%，絕對繁殖力和體質(zhì)量相對繁殖力分別提高11.96%和9.57%，幼魚孵化率由80.77%增至85.13%。王賽賽等[28]利用酵母菌、乳酸菌、光合細菌、放線菌、硝化細菌、芽胞桿菌混合制劑，按0.5%比例混拌飼料后喂食大口黑鱸，雌魚性腺指數(shù)達到5.23%，懷卵量、相對懷卵量分別提高44.5%和42.66%，此外機體超氧化物歧化酶活性在產(chǎn)卵前達到峰值370 U/mg，提高了15.63%，顯著調(diào)節(jié)了機體免疫力與抗氧化能力。

2.2 微生態(tài)制劑在蝦類養(yǎng)殖中的應(yīng)用

目前，蝦類養(yǎng)殖往往受病毒、細菌、真菌、寄生蟲等因素引發(fā)的病害影響，傳統(tǒng)防病治病方案普遍使用大量抗生素、免疫增強劑、環(huán)境改良劑等化學藥物，但不可避免地會造成細菌耐藥性，甚至水體環(huán)境的二次污染。多項研究表明，使用微生態(tài)制劑可顯著調(diào)節(jié)凡納濱對蝦、南美白對蝦、羅氏沼蝦、克氏原螯蝦等養(yǎng)殖過程，一方面縮短蝦體生長周期，提高生長率，增加個體重量，增強機體免疫力，另一方面凈化水體環(huán)境，降低氮素過剩累積。例如，劉文亮[29]在飼料中按1%比例混拌蠟樣芽胞桿菌制劑，凡納濱對蝦生長速率提高15.2%，腸道變形菌門比例由68.30%降至57.94%，弧菌比例由5.40%降至1.94%，病原微生物侵染及病害發(fā)生風險降低。Khademzade等[30]利用蠟樣芽胞桿菌混拌飼料，南美白對蝦存活率提高13.38%，水體中硝酸鹽、亞硝酸鹽、氨氮含量分別降低48.15%、6.67%和20.48%，對蝦產(chǎn)量和凈收入分別提高27.30%和92.94%。朱光來等[31]在羅氏沼蝦飼料中按3%比例添加枯草芽胞桿菌制劑，沼蝦存活率由56%提高至78%，采食量提高129.51%，料重比由3.69降至1.71，比生長速率提高45.53%，個體重量提高3.4倍，蝦肉蛋白組成含量提高。駱玉玲等[32]使用復(fù)合芽胞桿菌制劑飼喂克氏原螯蝦，養(yǎng)殖水體中氨氮、亞硝酸鹽、透明度分別降低69.6%、54.5%、23.5%，蝦體成活率提高12.8%，養(yǎng)成規(guī)模提高27.8%。

除了使用上述單一芽胞桿菌制劑外，其他功能益生菌如腸球菌、單胞菌、乳桿菌、酵母等對蝦類水產(chǎn)養(yǎng)殖同樣具有重要調(diào)節(jié)作用。朱成坤等[33]自蝦體腸道篩分出堅忍腸球菌和枯草芽胞桿菌，利用二者混合制劑飼喂羅氏沼蝦，監(jiān)測發(fā)現(xiàn)實驗組酚氧化酶活性提高了48.24%，溶菌酶活性提高了198%，腸道蛋白酶活性提高了84.8%，弧菌數(shù)量下降了59.76%。練小軍等[34]以白斑綜合征病毒、致急性肝胰腺壞死病副溶血弧菌侵染的凡納濱對蝦為研究對象，發(fā)現(xiàn)假交替單胞菌、微小桿菌均具有顯著的病原菌拮抗作用。當飼料中僅添加假交替單胞菌制劑時，對蝦存活率提高213%，平均生長率提高45.3%；當飼料中僅添加微小桿菌制劑時，對蝦存活率提高48.63%，平均生長率提高105.2%；當同時添加兩種制劑時，對蝦存活率提高184%，平均生長率提高70.6%。樊英等[35]使用商業(yè)飼用微生態(tài)制劑，主要包含干酪乳桿菌、釀酒酵母等，飼喂凡納濱對蝦后，實驗組機體酸性磷酸酶、過氧化物酶活性分別提高近4倍和1.5倍，同時非特異性免疫增強；此外，谷丙轉(zhuǎn)氨酶與谷草轉(zhuǎn)氨酶活性降低，而淀粉酶、脂肪酶、胰蛋白酶等消化酶活性提高，有效促進了飼料消化與營養(yǎng)吸收。

2.3 微生態(tài)制劑在海參養(yǎng)殖中的應(yīng)用

海參養(yǎng)殖易受到假單胞菌、燦爛弧菌、霉菌、纖毛寄生蟲、盾纖毛蟲等病原菌及寄生蟲的侵害，發(fā)病多見腐皮綜合征、爛胃病、霉菌病、后口蟲病等病害，傳統(tǒng)防病治病手段多使用四環(huán)素類、磺胺類、喹諾酮類、酰胺醇類、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。2020年，我國全面禁止使用抗生素，同時需每年組織開展獸藥殘留監(jiān)控和動物源細菌耐藥性監(jiān)測，亟待開發(fā)綠色替抗及高效水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)，實現(xiàn)海參快速生長發(fā)育與增產(chǎn)增重，同時提高成活率、減少發(fā)病率，已成為國內(nèi)外研究學者和養(yǎng)殖業(yè)者的關(guān)注熱點。相關(guān)研究表明，海參飼用益生菌主要使用芽胞桿菌、乳桿菌、酵母等微生物。Zhao等[36]在飼料中按109cfu/g添加枯草芽胞桿菌，幼參增重率提高30.14%，腸道淀粉酶和胰蛋白酶活性分別提高8%和93.62%，飼料中碳水化合物和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化利用加快，弧菌等主要病原微生物數(shù)量大幅降低。Chao等[37]在海洋魚類腸道中分離、鑒定出一株植物乳桿菌，制劑后添加至飼料中，實驗組參體比生長速率提升0.28%·d-1；當利用病原菌侵染海參后，實驗組海參存活率提高18.6%，且參體中堿性磷酸酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶活性分別提高1.6倍、2倍及0.5倍，有效刺激了海參生長發(fā)育與免疫應(yīng)答。Ma等[38]在飼料中添加海洋紅酵母和梅奇酵母復(fù)合制劑，飼料吸收利用加快，海參比生長速率提高0.5 %·d-1，胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性分別提高34.29%、47.95%和72.23%，腸道總益生菌數(shù)量增加了1倍，弧菌等病原菌數(shù)量降低了17.51%。包鵬云等[39]將梅奇酵母、紅酵母、芽胞桿菌按1∶1∶10形成復(fù)合制劑，飼喂后的海參腸道弧菌數(shù)量下降86.3%，胃蛋白酶、胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性分別提高126.87%、41.55%、42.47%和85.76%，體壁蛋白和糖組成含量分別提高11.98%和14.62%。王光玉等[40]將投喂飼料與商業(yè)EM菌劑按2∶1的比例混合，飼喂后的海參生長率提高2.92%，蛋白酶、纖維素酶、褐藻酸酶、淀粉酶活性分別提高32.68%、33.12%、36.33%和35%，養(yǎng)殖水體中亞硝態(tài)氮、氨氮含量下降28.89%和40.25%，水質(zhì)得到凈化，有效抑制了病原微生物滋生。另一項相似研究中，王圣等[41]將商品斗山制劑飼喂刺參后，其生長率和成活率分別提高了0.42%和11.11%，堿性磷酸酶和超氧化物歧化酶活性提高了3倍，淀粉酶和蛋白酶活性分別提高了2.2倍和4.2倍，養(yǎng)殖水體中氨氮和亞硝酸氮含量分別降低75.9%和67.0%。

總體來說，魚蝦及海參水產(chǎn)養(yǎng)殖飼用微生態(tài)制劑普遍使用芽胞桿菌、乳桿菌、酵母菌、硝化細菌等多種益生菌，這些微生物適宜生長溫度范圍多為25～37 ℃，然而養(yǎng)殖水體溫度往往控制在25 ℃以下。如表3所示，以海參養(yǎng)殖為例，生長階段主要劃分為育苗期、雛參期、幼體及養(yǎng)成期，其中育苗期需要控制水體溫度在20～22 ℃，雛參期以19～25 ℃為宜，幼體及養(yǎng)成期溫度需降至10～18 ℃為最佳[42]。因而，使用益生菌的生長增殖、代謝合成及產(chǎn)物活性極易受低溫環(huán)境影響，導致制劑大量使用或補充使用，且益生菌(群)無法發(fā)揮理想的生物效價，進而影響水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)能與經(jīng)濟效益，因此亟待開發(fā)適宜低溫水產(chǎn)養(yǎng)殖的優(yōu)良益生菌菌種資源。與此同時，益生菌是發(fā)酵制劑工藝的核心，高密度細胞發(fā)酵能夠顯著提高有效活菌數(shù)，而利用多種微生物的混合菌株發(fā)酵，是實現(xiàn)益生菌群及活性代謝產(chǎn)物功能互補、協(xié)同互作的有效途徑，因而開發(fā)高效菌種選育、發(fā)酵優(yōu)化等關(guān)鍵生物技術(shù)，對于提升飼用微生態(tài)制劑功能性至關(guān)重要。

表3 海參養(yǎng)殖溫度條件、常見病害及飼用益生菌特點Table 3 Culture temperature, diseases and probiotics for sea cucumber aquaculture

3 養(yǎng)殖飼用益生菌的研究進展

3.1 優(yōu)良益生菌選育

為了提高水產(chǎn)養(yǎng)殖飼用益生菌的生物效價與應(yīng)用效果，可從動物體內(nèi)或特定環(huán)境中分離、純化、篩選功能微生物，基于產(chǎn)酶活性、抑菌活性及脅迫耐性選育高性能益生菌，選育菌株多以芽胞桿菌為主。谷舞[43]從凡納濱對蝦腸道中獲得33株芽胞桿菌，分別利用脫脂牛乳培養(yǎng)基、淀粉培養(yǎng)基和脂肪培養(yǎng)基進行產(chǎn)酶活性指標檢測，其中1株芽胞桿菌具有淀粉酶、脂肪酶及蛋白酶高產(chǎn)特性，將該菌發(fā)酵制劑混拌飼料后，凡納濱對蝦比生長速率、飼料利用率及增重率分別提高22.5%、30.3%和47.1%；在副溶血弧菌侵染實驗中，芽胞桿菌飼喂組對蝦死亡率由56%降低至21%。王曉云[44]從羅非魚養(yǎng)殖水體中篩得7株枯草芽胞桿菌，通過透明圈法和福林酚法發(fā)現(xiàn)菌株BY7具有較高蛋白酶活性，最高酶活性可達43.28 U/mL，較商業(yè)菌株提高了2.6倍。劉曉燕等[45]通過形態(tài)鑒定和16S rRNA測序分析，從對蝦養(yǎng)殖環(huán)境中篩得1株枯草芽胞桿菌，其具有良好耐高溫、耐胃酸、耐膽鹽特性，并能有效拮抗金黃色葡萄球菌和副溶血弧菌，將該菌按5×105cfu/mL投入養(yǎng)殖水體，環(huán)境中亞硝態(tài)氮、氨氮含量分別降低了70.49%、 77.63%。

除上述芽胞桿菌以外，Ratchanu等[46]對魚腸道及發(fā)酵樣品中初篩獲得的656株乳酸菌分別進行病原菌拮抗及細菌素活性檢測，復(fù)篩獲得1株高性能植物乳桿菌，混拌飼料投喂后，博氏沼蝦存活率提高30.07%，比生長速率提高73.85%，蝦體增重提高42.09%，飼料轉(zhuǎn)化率由2.99%降至1.66%。Ana等[47]從鱸魚體內(nèi)初篩獲得122株菌株，通過病原菌拮抗、膽鹽及酸堿耐受實驗，選定1株高活性糞腸菌，該菌能夠激活多種促炎和抗炎細胞因子，有效調(diào)節(jié)鱸魚非特異性免疫。Sunish等[48]利用實驗室保藏的6株海洋放線菌進行抗哈維氏弧菌拮抗實驗，獲得放線菌發(fā)酵上清液后，按10%比例加入哈維氏弧菌培養(yǎng)體系中，弧菌生長抑制率可達52.4%。鄭軍榮等[49]從凡納濱對蝦腸道中篩得芽胞桿菌、酵母菌和腸球菌等7株菌株，發(fā)現(xiàn)其中的啤酒酵母、短小芽胞桿菌、枯草芽胞桿菌、暹羅芽胞桿菌，對副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌等致病菌具有良好的拮抗效果，暹羅芽胞桿菌抑菌活性最佳。除以上利用自然環(huán)境篩選，部分研究人員還將菌株進行了定向誘變，獲得了新型菌株。例如，Zhou等[50]利用常溫等離子體技術(shù)(ARTP)以及亞硝基胍(NTG)方法誘變解淀粉芽胞桿菌X030，結(jié)果顯示，經(jīng)誘變后的解淀粉芽胞桿菌對致病菌嗜水氣單胞菌和維羅氣單胞菌抗性增強。在活體養(yǎng)殖實驗中，分別感染嗜水氣單胞菌和維羅氣單胞菌的草魚死亡率分別降低52.9%和150%。總體來說，圍繞病原微生物拮抗、產(chǎn)酶活性、膽鹽耐受及酸堿耐受等特性，通過動物體內(nèi)或養(yǎng)殖環(huán)境篩選依然是選育優(yōu)良益生菌的有效手段，但選育菌株的低溫耐受性往往同樣重要，在發(fā)酵優(yōu)化有效活菌數(shù)及產(chǎn)物活性等方面仍有較大提升空間。雖然基因工程改造或誘變在微生態(tài)制劑方面應(yīng)用較少，但對生物生長存活仍具有顯著作用，但需考慮改造后的菌株的生物耐受性。

3.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

事實上，優(yōu)良益生菌菌種及有效活菌數(shù)(或孢子數(shù))是微生態(tài)制劑的核心，高密度細胞發(fā)酵優(yōu)化是獲得高濃度有效活菌及活性代謝產(chǎn)物的有效途徑。相關(guān)研究結(jié)果表明，經(jīng)過發(fā)酵優(yōu)化的制劑對水體凈化能力以及養(yǎng)殖調(diào)節(jié)作用明顯增強。李卓偉等[51]通過正交試驗優(yōu)化枯草芽胞桿菌發(fā)酵條件，在1.0%玉米粉、1.5%黃豆餅粉、0.2%MgSO4·7H2O、0.3%K2HPO4、0.1%KH2PO4、初始pH 7.0、8%(體積分數(shù)，下同)接種量、200 r/min培養(yǎng)條件下，39 ℃發(fā)酵培養(yǎng)48 h后產(chǎn)孢率達89.6%。元福杰等[52]通過單因素和正交試驗，優(yōu)化了枯草芽胞桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基配方，在2.5 g/L葡萄糖、20 g/L豆粕、10 g/L NaCl、初始pH 7.5、170 r/min、5%接種量優(yōu)化條件下，28 ℃發(fā)酵培養(yǎng)32 h最高有效活菌數(shù)達到8.5×109cfu/mL，產(chǎn)孢率高達91%。董春光[53]利用單因子試驗和正交試驗，優(yōu)化了枯草芽胞桿菌培養(yǎng)基配方，在10 g/L玉米粉、10 g/L馬鈴薯淀粉、15 g/L豆粕粉、3 g/L Na2HPO4、3 g/L NaH2PO4、0.5 g/L MnSO4、初始pH 7.2～7.5、140 r/min、7%接種量優(yōu)化條件下，37 ℃發(fā)酵培養(yǎng)12 h獲得有效活菌數(shù)高達2.72×1011cfu/mL，制劑使用后，水體中亞硝酸鹽、硝酸鹽含量降低30.43%和46.62%，海參腸道內(nèi)淀粉酶和蛋白酶活性分別提高了30.27%和59.50%。張倩[54]利用49株芽胞桿菌分別進行除氮和弧菌拮抗實驗，篩選出FS017和FS037兩株優(yōu)良菌株，單因素和響應(yīng)面實驗結(jié)果顯示，菌株FS017在24.38 g/L酵母膏、0.31 g/L FeSO4·7H2O、2.62%接種量優(yōu)化條件下，有效活菌數(shù)最高為1.19×1010cfu/mL，抑菌圈直徑達到25.04 mm；菌株FS037在最優(yōu)發(fā)酵條件下，抑菌圈直徑可達27.67 mm，弧菌拮抗效果明顯。王曉飛等[55]將2%糖蜜作為碳源、0.5%酵母粉作為氮源，20 ℃、140 r/min，50 mL/250 mL裝液量、初始pH 3.0的優(yōu)化條件下，南極紅酵母AN5發(fā)酵有效活菌數(shù)為5.81×107cfu/mL，應(yīng)用于海參養(yǎng)殖后，參體蛋白和多糖含量分別提高了21.18%和23.63%。李鋼平等[56]對解淀粉芽胞桿菌進行發(fā)酵優(yōu)化，通過單因素和正交優(yōu)化試驗，發(fā)現(xiàn)在20 g/L蛋白胨、10 g/L玉米粉、20 g/L大米蛋白粉和1.0 mmol/L Mn2+優(yōu)化條件下，發(fā)酵48 h后的孢子濃度達到7.0×109cfu/mL，較實驗室LB培養(yǎng)基使用效果提高了3.3倍，比工業(yè)生產(chǎn)培養(yǎng)基使用效果提高了2.2倍。

傳統(tǒng)發(fā)酵優(yōu)化策略大多應(yīng)用于芽胞桿菌、酵母菌等單菌的批次發(fā)酵過程調(diào)控，包括接種量、溫度及pH、溶氧、營養(yǎng)組成及含量等。事實上，這些發(fā)酵營養(yǎng)組分往往較為復(fù)雜，常以豆粕、淀粉、葡萄糖、無機鹽、促生因子等為主，發(fā)酵優(yōu)化有效活菌數(shù)與生產(chǎn)強度仍有一定提升空間。因此，在批次發(fā)酵基礎(chǔ)上采用分批補料發(fā)酵，定期向發(fā)酵體系補充水、氮源、碳源、無機鹽等營養(yǎng)物質(zhì)，以補充菌體生長繁殖消耗的營養(yǎng)物質(zhì)。陳鴻圖等[57]研究發(fā)現(xiàn)，在枯草芽胞桿菌批次發(fā)酵實驗中，分別在11、18和24 h補加10 g/L玉米粉和7.5 g/L豆粕粉，發(fā)酵生產(chǎn)強度提高了112%。此外，錢風光等[58]利用枯草芽胞桿菌分別進行批次發(fā)酵和分批補料發(fā)酵，探究營養(yǎng)組成及發(fā)酵方式對發(fā)酵生物量的影響，研究發(fā)現(xiàn)將氮源豆粕濃度優(yōu)化為4%時，批次發(fā)酵生物量可達8.2×109cfu/mL；與此同時，當發(fā)酵糖濃度降至10 g/L以下時，分兩次各補加20 g/L糖，發(fā)酵生物量進一步提高到2.8×1010cfu/mL，因而調(diào)節(jié)發(fā)酵初始及過程碳氮比更有利于提高生物量。

為了進一步提高生產(chǎn)強度，需要考慮不同飼用益生菌之間、不同活性代謝產(chǎn)物之間的協(xié)同互作效應(yīng)，應(yīng)在“物質(zhì)-能量-氧化還原”等細胞全局水平上，基于多維度協(xié)同互作機制，強化魚蝦、海參等水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中飼料轉(zhuǎn)化利用、促生防病治病、機體免疫調(diào)節(jié)、環(huán)境水質(zhì)凈化等方面的功能協(xié)同性與互補性。因此，開發(fā)混合菌株發(fā)酵工藝，制備復(fù)合微生態(tài)制劑，能夠提升有效活菌數(shù)(或孢子數(shù))及發(fā)酵生產(chǎn)強度，增強制劑生物效價及應(yīng)用效果，提高生產(chǎn)設(shè)備利用率，減少操作環(huán)節(jié)與資金投入，降低制劑生產(chǎn)成本，具有研究意義和一定的應(yīng)用價值。

3.3 混合菌株發(fā)酵及制劑應(yīng)用

關(guān)于混合菌株發(fā)酵及其復(fù)合微生態(tài)制劑應(yīng)用的研究報道較少，混菌發(fā)酵有效活菌數(shù)及生產(chǎn)強度能夠較單菌發(fā)酵效果更佳。針對芽胞桿菌單菌發(fā)酵，吉沐祥等[59]在授權(quán)專利中公開了一種多粘類芽胞桿菌JX-13及其應(yīng)用方法，培養(yǎng)基主要包括豆粕、馬鈴薯淀粉、蔗糖、酵母粉、碳酸鈣以及硫酸錳，發(fā)酵控制溶氧100%、轉(zhuǎn)速350 r/min、pH 7.0～7.2、30 ℃發(fā)酵36 h后，所制備的多粘類芽胞桿菌單菌制劑中有效活菌數(shù)為1×1010cfu/g。孫靜等[60]以豆粕為底物，對堅強芽胞桿菌PC024發(fā)酵工藝條件進行了優(yōu)化，圍繞接種量、料水比、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度進行響應(yīng)面分析，發(fā)酵100 h后，制備的堅強芽胞桿菌單菌制劑中有效活菌數(shù)為1.23×1010cfu/g。相較而言，針對多粘類芽胞桿菌和堅強芽胞桿菌混菌發(fā)酵，薛闖等[61]在授權(quán)專利中公開了一種多粘類芽胞桿菌與堅強芽胞桿菌高密度混合發(fā)酵方式，發(fā)酵條件為通氣量1.5～3 vvm(通氣率)、溶氧30%～50%、轉(zhuǎn)速150～200 r/min、pH 7.0～7.8、溫度28～37 ℃，當葡萄糖濃度降至2 g/L時，通過流加補料維持糖濃度不高于2 g/L，發(fā)酵僅需13 h，發(fā)酵液中多粘類芽胞桿菌有效活菌數(shù)高達1.2～1.5×1010cfu/mL，堅強芽胞桿菌有效活菌數(shù)高達8.0～9.0×109cfu/mL，混菌發(fā)酵生產(chǎn)強度顯著提高，制備的混菌制劑中有效活菌數(shù)高達為3 .0～6 .6×1011cfu/g，遠高于上述單菌發(fā)酵制劑。而更為重要的是，多粘類芽胞桿菌與堅強芽胞桿菌具有顯著的協(xié)同促生及抑菌作用，若作為復(fù)合菌劑生產(chǎn)，可減少工藝操作環(huán)節(jié)、生產(chǎn)設(shè)備與資金投入，生產(chǎn)經(jīng)濟性較好。

此外，優(yōu)化組合復(fù)合菌劑也較單一菌劑具有更好的應(yīng)用效果。Zhang等[62]利用從對蝦中篩分出的植物乳桿菌、釀酒酵母和安全芽胞桿菌按1∶3∶3混合比例發(fā)酵制劑，與單一菌株制劑的使用效果相比，蝦體總氨基酸含量提升14.63%，存活率為93.5%，體重增率達到687.63%。Meidong等[63]利用空氣芽胞桿菌和植物乳桿菌，按 1∶1(質(zhì)量比)混合比例發(fā)酵制劑飼喂鯰魚幼魚，與單一空氣芽胞桿菌或植物乳桿菌制劑使用效果相比，幼魚增重量分別提高了59.09%及103.06%，飼料轉(zhuǎn)化率分別提高了101.92%及62.79%。張盛靜等[64]研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽胞桿菌和地衣芽胞桿菌按1∶1比例混合發(fā)酵制劑，飼喂被副溶血弧菌侵染的對蝦，與單一枯草芽胞桿菌或地衣芽胞桿菌制劑效果相比，對蝦死亡率分別降低11.43%和6.07%，特異性免疫應(yīng)答能力分別提高了40.01%和16.69%。謝航[65]以實驗室保存的耐鹽莢膜紅假單胞菌為基礎(chǔ)，結(jié)合1株能高效降解殘留飼料蛋白和淀粉的地衣芽胞桿菌、1株具有降解氨氮功能的假絲酵母，進行混合菌株發(fā)酵優(yōu)化，當?shù)匾卵堪麠U菌、假絲酵母、耐鹽莢膜紅假單胞菌混合接種比例為4∶3∶3時，三者有效活菌數(shù)菌達到最高，分別為2.69×108cfu/mL、4.07×107cfu/mL和6.03×109cfu/mL，同時發(fā)現(xiàn)假絲酵母與耐鹽莢膜紅假單胞菌具有明顯的協(xié)同互作關(guān)系。李靜舒等[66]利用凝結(jié)芽胞桿菌和嗜熱鏈球菌，通過單因素試驗和正交試驗發(fā)現(xiàn)凝結(jié)芽胞桿菌和嗜熱鏈球菌體積比按2∶1(體積比)混合，以4%接種量，43 ℃發(fā)酵有效活菌數(shù)為1.767×109cfu/mL，抑菌作用接近12.5 mg/L硫酸卡那霉素。王宇翕等[67]利用3株乳酸菌、2株芽胞桿菌、1株酵母菌，按等比例混合發(fā)酵制備復(fù)合微生態(tài)制劑，較單一菌株發(fā)酵，混合菌株發(fā)酵有效活菌數(shù)提高了2倍，同時對水體氨氮的清除能力提高了40.1%。王瑩等[68]將克雷伯氏菌和枯草芽胞桿菌按2∶1(質(zhì)量比)比例混合發(fā)酵，投放羅氏沼蝦養(yǎng)殖水體中，環(huán)境氨氮、亞硝酸鹽和硫化氫降解率分別提高至43.59%、37.96%及18.80%，推測紅螺菌、乳酸桿菌、枯草芽胞桿菌和克雷伯氏菌混合發(fā)酵過程存在種間拮抗效應(yīng)?？傮w來說，上述混合菌株發(fā)酵制劑的應(yīng)用效果較為單一，一類用于提高魚蝦養(yǎng)殖存活率與飼料轉(zhuǎn)化率，促進生長與增重，改善肉質(zhì)營養(yǎng)組成；一類用于降解養(yǎng)殖水體中的飼料殘渣、動物排泄物等大分子有機物，減少氨氮、亞硝酸鹽等毒害物質(zhì)積累，起到凈化水質(zhì)的作用。因而，基于益生菌協(xié)同互作機制的多效復(fù)合型微生態(tài)制劑開發(fā)是未來研究工作的重點。

4 展 望

我國水產(chǎn)資源豐富，養(yǎng)殖規(guī)模及密度日益擴大, 為了防控水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的發(fā)生, 抗生素等化學藥物的使用起到了一定的積極作用。但是，由于抗生素長期使用和濫用，病原微生物產(chǎn)生抗藥性，導致抗生素用量增加，引發(fā)水產(chǎn)動物內(nèi)源性感染和二重感染，破壞和干擾了動物腸道正常菌群和養(yǎng)殖微生態(tài)環(huán)境，甚至降低了機體免疫應(yīng)答反應(yīng)，更直接危害人類健康。因此，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)必須走可持續(xù)發(fā)展的健康、綠色、高效種養(yǎng)殖道路，生產(chǎn)綠色無公害水產(chǎn)品。微生態(tài)制劑作為水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料添加劑，是理想的抗生素替代品，具有綠色環(huán)保、無毒副作用、無殘留污染、不產(chǎn)生抗性、作用范圍廣等優(yōu)點，能夠調(diào)節(jié)動物腸道微環(huán)境，增強機體免疫力，促進生長發(fā)育，提高養(yǎng)殖產(chǎn)能與經(jīng)濟效益，同時還起到凈化環(huán)境水質(zhì)，降低營養(yǎng)氮素累積的作用，環(huán)保及可持續(xù)發(fā)展效益十分顯著，發(fā)展空間及市場容量巨大。飼用微生態(tài)制劑在魚蝦、海參養(yǎng)殖應(yīng)用方面仍存在問題與挑戰(zhàn)，未來研究重點在于開發(fā)成套集成技術(shù)，包括高效益生菌選育技術(shù)，增強生長定殖、代謝合成以及產(chǎn)物表達能力，以提高在動物體內(nèi)及水體環(huán)境中的生物效價；高效發(fā)酵制劑技術(shù)，提高發(fā)酵有效活菌數(shù)、代謝產(chǎn)物濃度，縮短發(fā)酵生產(chǎn)周期；基于協(xié)同互作機制的混合菌株發(fā)酵技術(shù)，增強益生菌功能互補，提高生產(chǎn)設(shè)備利用率。通過上述技術(shù)的優(yōu)化集成，可以有效提高微生態(tài)制劑的生物效價及應(yīng)用效果，積極發(fā)揮重要的“減抗、替抗”作用，同時降低發(fā)酵生產(chǎn)的資本投入和運營成本，助推高效種養(yǎng)殖、綠色安全及環(huán)境友好型模式的高質(zhì)量可持續(xù)發(fā)展。