竹炭固定化施氏假單胞菌Pseudomonas stutzeri ZH-1降解苯酚的研究

張澤錕， 閆 勇， 黃 霞， 劉靖靖， 劉曉琦， 胡青平

(山西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030000)

苯酚作為一種難以降解的有毒污染物，低濃度就能對水體中的生物和人類身體造成巨大的傷害。苯酚在工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用非常廣泛，通常在化工生產(chǎn)的過程中作為原料出現(xiàn)，在皮革制造、香料生產(chǎn)等產(chǎn)業(yè)中使用。然而一個不容忽視的問題是其常在使用后產(chǎn)生大量的含酚廢水，這些廢水如果直接排入自然界，將會對環(huán)境造成嚴重破壞[1-3]。目前，為解決微生物法運行中存在的生物量易流失等問題，人們更多地采用微生物固定化技術(shù)[4-6]。微生物固定化是將分散、游離的微生物通過物理或化學(xué)手段將其集中在一個限定區(qū)域，通過提高單位空間內(nèi)的微生物濃度，以提高其活性及重復(fù)利用其功能的生物技術(shù)。微生物固定化技術(shù)在水污染治理中應(yīng)用非常廣泛，該技術(shù)利用不同的載體材料固定各種各樣的微生物，降解或吸附廢水中的營養(yǎng)鹽、酚類污染物[5-7]。載體材料的選擇是這項技術(shù)的關(guān)鍵，良好的載體不僅可以提高微生物的數(shù)量和活性，維持微生物細胞的穩(wěn)定性，而且在重復(fù)利用，對污染物保持較高去除效果方面往往表現(xiàn)出更為顯著的優(yōu)勢[8-10]。夏麗[11]和吳芳芳等[12]分別使用海藻酸鈣和聚乙烯醇固定化苯酚降解菌，結(jié)果顯示，在高濃度苯酚條件下(>1 000 mg/L)，固定化菌的苯酚降解速率遠高于游離菌。劉羽等[13]在用核桃殼固定化苯酚降解菌LQ-1的過程中發(fā)現(xiàn)，固定化后的菌株苯酚耐受能力由500 mg/L提高至700 mg/L，40 h內(nèi)苯酚降解率可達97.83%。固定化后菌株的苯酚耐受性與降解性能均有提高，竹炭是以毛竹為原料，經(jīng)過高溫燒制、炭化干餾等步驟后制成，因其表面多孔，所以比表面積大，且具備吸附力，在使用過程中理化性能保持穩(wěn)定，在研究與工業(yè)生產(chǎn)中廉價易得，經(jīng)常用作微生物的固定化載體[8]。本研究以PseudomonasstutzeriZH-1為研究對象，前期在對其降解苯酚的研究中發(fā)現(xiàn)菌株ZH-1對苯酚的降解率可達89.6%，并且對菌株ZH-1的苯酚耐受性進行了測試，其苯酚最大耐受濃度為1 000 mg/L，并且在400 mg/L內(nèi)，菌株ZH-1對苯酚的降解能力基本不受苯酚濃度影響。通過LC-MS結(jié)合KEGG通路得出菌株ZH-1降解苯酚是通過鄰苯二酚1，2-加氧酶途徑(C120途徑)進行的，即苯酚在苯酚羥化酶(HO)作用下將苯酚轉(zhuǎn)化成鄰苯二酚，鄰苯二酚在1，2-加氧酶(C12O)的作用下將鄰苯二酚開環(huán)裂解產(chǎn)生己二酸，己二酸在順，順-粘糠酸內(nèi)酯酶(LE)作用下分解成內(nèi)酯，然后被分解為β-酮基己二酸，并進一步被徹底降解為琥珀酸和乙酰輔酶A而進入糖代謝途徑。本研究采用竹炭作為固定化載體，對高效苯酚降解菌P.stutzeriZH-1采取吸附固定處理，研究其最佳固定化條件，并在此基礎(chǔ)上，分析和對比固定化菌和游離菌在苯酚去除上的表現(xiàn)，考察竹炭固定化菌群是否對苯酚降解有促進作用，進一步研究竹炭固定菌多次重復(fù)利用去除苯酚的可行性，為竹炭固定化微生物在含苯酚污水治理方面提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 菌株P(guān)seudomonasstutzeriZH-1，于山西省臨汾市汾河淤泥中分離，可以利用苯酚為碳源進行生長。保存于山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實驗室。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①種子液培養(yǎng)基：直接用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基配制。②固體培養(yǎng)基[11]：使用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基配制。③苯酚無機鹽模擬廢水(MSM)[14](g/L)：(NH4)2SO4·12H2O 2，NaH2PO41.5，K2HPO41.5，MgSO40.2，CaCl2·2H2O 0.01，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.001，苯酚含量按實驗需求添加，pH值7～8。

1.1.3 主要試劑與儀器設(shè)備 竹炭(粒徑0.8 mm，比表面積600 m2/g，用蒸餾水清洗3次，滅菌后100 ℃烘干備用)購自上海海諾炭業(yè)有限公司；苯酚(純度>99.9%)。臺式離心機(Z36HK，德國賀默公司)；冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM)(JSM-7500F，日本電子株式會社)；數(shù)顯振蕩培養(yǎng)箱(YHZ-98AB，上海一恒科技有限公司)；新世紀紫外可見光分光光度計(T6，上海菁華科技儀器有限公司)；光照培養(yǎng)箱(BSG-300，上海博迅科技有限公司)；酸度計(PSH-3C，上海雷磁儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1P.stutzeriZH-1菌懸液制備 無菌條件下將P.stutzeriZH-1接種到營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基，37 ℃、120 r/min培養(yǎng)至對數(shù)期，5 000 r/min離心10 min后，去上清，無菌水沖洗沉淀的細菌細胞，再次離心，重復(fù)3次，用無菌水調(diào)整菌懸液OD600至1左右，4 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株ZH-1的固定化 稱量一定量竹炭加入錐形瓶中，121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻后按實驗需求添加一定濃度的菌懸液，同時以相同濃度菌懸液添加于滅菌的空錐形瓶中作為游離態(tài)菌株，37 ℃、120 r/min振蕩培養(yǎng)一定時間。取出錐形瓶，用無菌水清洗固定化細胞3次，即制備一份固定化菌懸液。

1.2.3 固定化條件的優(yōu)化 ①單因素試驗：三個單因素分別為接種量(竹炭量為1 g，按培養(yǎng)液的體積比，分別接種0.5%、1%、3%、5%、7%的菌懸液，振蕩吸附36 h)、竹炭量(0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 g竹炭，接種量為3%(體積分數(shù)，下同)的菌懸液，振蕩吸附36 h)和吸附時間(竹炭量為1 g，接種量為3%的菌懸液，分別振蕩吸附12、24、36、48、60 h)，無菌水沖洗3次固定化細菌，參考丁鵬[15]對化工廠含酚廢水中苯酚量的測定方法，加入含200 mg/L已滅菌模擬廢水，120 r/min培養(yǎng)48 h后，計算降解率。 ②正交試驗：以苯酚降解率為響應(yīng)值，使用L9(34)正交試驗確定固定化菌對苯酚的最適降解條件。

1.2.4 竹炭固定化菌的形態(tài)表征 使用SEM觀察菌株ZH-1經(jīng)竹炭固定化前后的特征變化。固定化前的竹炭無需處理，可直接在SEM下觀察[16]。竹炭固定化后的菌株需先在2.5%的戊二醛溶液固定，然后經(jīng)梯度酒精脫水、乙酸異戊酯置換、冷凍干燥后，SEM對竹炭表面及內(nèi)部微生物的附著情況進行觀察，觀察竹炭作為固定化載體的特性。

1.2.5 固定化菌株與游離態(tài)菌株降解模擬苯酚廢水試驗 基于1.2.3中得出的竹炭固定化微生物的最適條件，在滅菌的錐形瓶中制備竹炭固定菌，然后向錐形瓶中加入含200 mg/L苯酚的已滅菌模擬廢水(100 mL/250 mL)，進行竹炭固定菌對苯酚的降解試驗[17]，以相同接種量的游離態(tài)菌株作為陰性對照，每6 h取樣測定苯酚含量。同時，以竹炭對苯酚的吸附為空白對照，稱取1.0 g滅菌的竹炭于含200 mg/L苯酚的無機鹽培養(yǎng)基中，37 ℃，120 r/min振蕩培養(yǎng)，直到吸附平衡，每6 h取樣，測定苯酚含量，計算苯酚降解率。

1.2.6 竹炭固定化菌的重復(fù)利用性能試驗 按照1.2.5的竹炭固定菌對200 mg/L模擬苯酚廢水進行降解試驗，降解結(jié)束后，離心取出固定化菌，先用無菌水清洗，然后用滅菌的無機鹽培養(yǎng)基清洗，之后進行第二次模擬苯酚廢水降解試驗，按此方法連續(xù)重復(fù)10次，每輪均以游離態(tài)菌株作為對照。

1.2.7 苯酚含量測定及降解率計算 使用國標方法——4-氨基安替比林分光光度法對苯酚的含量進行測定[12]。降解率計算公式：苯酚降解率(%)=((苯酚初始量-苯酚剩余量)/苯酚初始量)×100%。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 使用SPSS 17.0進行鄧肯氏單因素方差分析，Excel繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 竹炭固定化菌后的形態(tài)表征

竹炭在固定化菌前后的形態(tài)經(jīng)掃描電鏡表征見圖1。由圖1A可以看出苯酚降解菌P.stutzeriZH-1呈短桿狀，菌落形態(tài)飽滿，說明菌株對苯酚毒性有一定耐受性，具備固定化的條件。由圖1B可見竹炭表面和內(nèi)部的多孔結(jié)構(gòu)為微生物在其中的生長附著提供了有利的條件，可以認為竹炭是一種比較合適的固定化載體。由圖1C可見大量的細菌在竹炭的表面與空隙中生長，由于存在細菌與竹炭間的物理作用及細菌產(chǎn)生的胞外分泌物與竹炭間的黏合作用[18-20]，竹炭孔隙明顯減少。苯酚降解菌P.stutzeriZH-1可以很好地附著在竹炭表面及其內(nèi)部，但由于微生物和竹炭之間的吸附效應(yīng)及竹炭內(nèi)部空隙結(jié)構(gòu)的不規(guī)則使得菌株吸附不均[21]。

圖1 固定化前后竹炭的結(jié)構(gòu)表征Fig.1 Structure characterization of bamboo charcoal before and after immobilizationA1～A3：P. stutzeri ZH-1；B1～B3：固定化前竹炭；C1～C3：固定化后竹炭A1-A3:P. stutzeri ZH-1；B1-B3:Before immobilization；C1-C3:After immobilization

2.2 固定化前后P. stutzeri ZH-1菌株降解苯酚能力的比較

竹炭固定化菌株P(guān).stutzeriZH-1與游離態(tài)菌株對苯酚的降解作用及竹炭的吸附作用對比實驗結(jié)果見圖2。竹炭對苯酚具有一定吸附作用，且在24 h達到吸附平衡，對苯酚的吸附率為20%，說明在竹炭固定化菌降解實驗整個過程中，竹炭對苯酚的吸附只占很小一部分，大部分苯酚的降解是通過微生物發(fā)揮作用的。同時，在同等接種量條件下，固定化菌相較于游離菌能夠發(fā)揮更為明顯的降解優(yōu)勢，48 h固定化菌株苯酚降解率達92.37%，與游離菌株僅80.12%相比，降解率增加了15%(P<0.05)。這可能是由于竹炭固定化體系中局部高菌密度，以及竹炭載體對微生物的保護作用使菌對苯酚的利用能力增大，對苯酚的降解產(chǎn)生明顯的促進作用。以上結(jié)果表明，竹炭作為一種固定化載體，固定化苯酚降解菌之后，會對菌落產(chǎn)生保護和緩沖作用，削弱有害物質(zhì)對細菌的沖擊，同時菌落的高度密集也增加了對有害物質(zhì)的抵擋，提高了對苯酚的降解[22-23]。因此，固定化細菌比游離態(tài)細菌具有更強的降酚能力，能夠應(yīng)用于實踐。

圖2 固定化菌株與游離菌株對苯酚的降解率Fig.2 Degradation rate of phenol by immobilized and free strains

2.3 竹炭固定化菌株條件的單因素優(yōu)化

2.3.1 接種量對竹炭固定化菌株ZH-1降解苯酚的影響 不同接種量對竹炭固定化菌株ZH-1降解苯酚的影響如圖3所示。隨著接種量的增加，菌株ZH-1對苯酚的降解呈先增加后減少的趨勢。當接種量為3%和5%時，苯酚降解率最大，分別為84.36%和86.01%，但兩者無顯著性差異(P>0.05)，考慮到經(jīng)濟節(jié)約的原則，選擇3%的接種量作為后續(xù)正交試驗的水平2。

圖3 接種量對竹炭固定化菌株ZH-1降解苯酚的影響Fig.3 Effect of inoculation amount on degradation of phenol by bamboo charcoal immobilized strain ZH-1不同小寫字母之間表示顯著性差異，P<0.05，下圖同Different lowercase letters indicate significunt differences beween different treatments,P<0.05,same below

2.3.2 竹炭量對竹炭固定化菌株ZH-1降解苯酚的影響 不同竹炭量對竹炭固定化菌株ZH-1降解苯酚的影響如圖4所示。當竹炭量小于1.0 g時，固定化菌株對苯酚的降解呈逐漸增大趨勢。當竹炭量為1.0 g時，苯酚降解率最大，可達86.42%。當竹炭量大于1.0 g時，固定化菌株ZH-1對苯酚的降解呈逐漸減小趨勢。說明過高或過低的竹炭量都會影響固定化菌對苯酚的降解，可能原因是當竹炭量較少時，可供菌液吸附的孔道和表面過少，菌液吸附不完全，固定的菌液量少，部分菌以游離的形式存在，固定化菌的優(yōu)勢不明顯，降解率比較低。當竹炭量過多時，竹炭將游離菌吸附完全后還剩余一部分竹炭，剩余的竹炭會吸附培養(yǎng)液中的苯酚，導(dǎo)致苯酚減少，固定化菌可利用的碳源減少，固定化菌的生長量減少，使苯酚降解率降低[14]。因此，選擇竹炭量1.0 g作為后續(xù)正交試驗的水平2。

圖4 竹炭量對竹炭固定化菌株ZH-1降解苯酚的影響Fig.4 Effect of bamboo carbon content on degradation of phenol by bamboo charcoal immobilized strain ZH-1

2.3.3 吸附時間對竹炭固定化菌株ZH-1降解苯酚的影響 不同吸附時間對竹炭固定化菌株ZH-1降解苯酚的影響如圖5所示。在設(shè)置的竹炭吸附菌液時間梯度內(nèi)，吸附時間為24 h和36 h時，苯酚降解率最大，分別為85.19%和83.54%，且二者之間沒有顯著性差異(P>0.05)，當竹炭吸附時間延長時，苯酚降解率呈現(xiàn)下降趨勢。這可能是由于竹炭對菌的吸附固定化是一個緩慢進行的過程，吸附初始階段，由于竹炭的孔道效應(yīng)比較明顯，同時菌體上存在大量豐富的對吸附過程有利的活性官能團，但隨著吸附時間的延長，大量菌體聚集在竹炭的微孔和表面，使得竹炭的吸附位不斷減少，吸附速率迅速降低，固定化菌苯酚降解率下降[24-25]。本研究選擇36 h作為后續(xù)正交試驗的水平2。

圖5 吸附時間對竹炭固定化菌株ZH-1降解苯酚的影響Fig.5 Effect of adsorption time on degradation of phenol by bamboo charcoal immobilized strain ZH-1

2.4 竹炭固定化菌株條件的正交設(shè)計優(yōu)化

以竹炭量(A)、接種量(B)和吸附時間(C)三個因素做單因素分析，設(shè)計L9(34)正交試驗，結(jié)果見表1、表2。其中由方差分析的結(jié)果可知，竹炭量、接種量和吸附時間三個因素對竹炭固定化菌株降解苯酚沒有顯著性影響，但由直觀分析表可知這三個因素都在一定程度上影響了微生物的固定化。根據(jù)正交實驗直觀分析表極差大小結(jié)果，以苯酚降解率為指標，影響竹炭固定化菌各因素主次順序為竹炭量>吸附時間>接種量，且A2B3C1為最優(yōu)組合，即竹炭量1.0 g，接種量5%，吸附時間24 h。

表1 L9(34)正交試驗優(yōu)化結(jié)果Table 1 Results of L9 (34) orthogonal test

表2 正交實驗結(jié)果方差分析Table 2 Analysis of variance of orthogonal experiment results

2.5 最佳固定化條件驗證

為驗證正交實驗結(jié)果，在實驗分析所得最優(yōu)組合條件下(竹炭量1.0 g，接種量5%，吸附時間24 h)，向錐形瓶中加入含苯酚200 mg/L的已滅菌MSM中進行竹炭固定菌對苯酚的降解試驗，實驗設(shè)置三個重復(fù)。測得平均降解率為92.88%，大于正交實驗設(shè)計的最高值，說明最佳組合條件可行。

2.6 竹炭固定化菌的重復(fù)利用性能測定

為驗證竹炭固定菌在降解苯酚中的重復(fù)利用性，對竹炭固定菌進行多批次的降解實驗。圖6表明，在添加竹炭固定體系后，苯酚的降解率相較游離菌體系有所增強。前5次降解實驗結(jié)束后，竹炭固定菌體系中苯酚的降解率分別為90.36%、89.95%、88.75%、90.16%、89.55%，游離菌體系中苯酚的降解率分別為80.32%、73.49%、60.07%、59.43%、56.62%，通過對比可知，竹炭固定體系在經(jīng)過5次重復(fù)利用后，降解率基本保持不變，而在游離菌體系中，伴隨每次重復(fù)利用，苯酚的降解率呈大幅度下降趨勢。在利用10輪后，竹炭固定菌的苯酚降解率下降為64.6%，游離菌的苯酚降解率下降至僅為23.6%，降解率增加了173%(P<0.05)。由此可見，伴隨著重復(fù)利用次數(shù)的增加，固定化體系與游離菌體系中苯酚的降解率均呈現(xiàn)下降趨勢，但竹炭固定菌體系的苯酚降解率下降趨勢較為平緩，而游離菌體系中苯酚的降解率下降趨勢則比較明顯，兩者之間的差距不斷拉大，實驗結(jié)果表明竹炭載體能夠?qū)晷纬捎行У墓潭?，能夠在生物處理系統(tǒng)的運行中提供長效、穩(wěn)定的運行條件，為今后固定化體系在實際污染廢水的處理中提供有價值的參考[26-28]。

圖6 固定化菌株重復(fù)使用次數(shù)對苯酚降解的影響Fig.6 Effect of repeated use of immobilized strain on degradation rate of phenol

3 討 論

本研究通過探究游離菌株P(guān).stutzeriZH-1及其竹炭固定化菌株對模擬苯酚廢水降解效果，研究了固定化技術(shù)在含苯酚廢水治理中的應(yīng)用，通過選擇竹炭量、接種量和吸附時間三個因素，以固定化菌對苯酚的降解率為響應(yīng)值利用正交試驗確定最佳固定化條件：竹炭量1.0 g，接種量5%，吸附時間24 h，在該條件下竹炭固定化菌P.stutzeriZH-1對苯酚的降解效果有最佳表現(xiàn)，降解率為92.88%。利用SEM觀察竹炭固定化前后的結(jié)構(gòu)特征表明，竹炭的多孔結(jié)構(gòu)在微生物的生長附著過程中提供了非常有利的條件，苯酚降解菌P.stutzeriZH-1可以很好地附著在竹炭表面及其內(nèi)部。通過對比分析竹炭的吸附作用及竹炭固定化菌株與游離態(tài)菌株對苯酚的降解作用發(fā)現(xiàn)，竹炭對苯酚具有一定吸附作用，24 h達到吸附平衡，對苯酚的吸附率為20%。竹炭固定化菌株與相同接種量的游離菌相比，固定化菌株48 h苯酚降解率達92.37%，與游離菌相比降解率增加了15%(P<0.05)，顯示出明顯降解優(yōu)勢。胡婷[14]在研究中也有相同的發(fā)現(xiàn)，苯酚濃度為1 000 mg/L時，游離菌和竹炭固定化菌雖然均能完全降解，但是固定化菌的降解速率明顯快于游離菌，說明竹炭固定化菌株可以有效提高對苯酚的降解能力。在經(jīng)過10輪的重復(fù)使用后，固定化菌對苯酚的降解率仍然可達64.6%，與游離菌相比降解率增加了173%(P<0.05)，說明竹炭固定化菌在苯酚的降解過程中可以多次重復(fù)利用。丁鵬[15]在海藻酸鈉固定化菌降解苯酚的研究中，固定化菌重復(fù)利用后對苯酚的降解率不變，但隨著使用次數(shù)的增加，降解苯酚所需時間也逐漸延長，并且固定化材料每次使用會產(chǎn)生破損，只能重復(fù)使用5輪。竹炭作為固定化載體，可起到有效的固定作用，為生物處理系統(tǒng)的穩(wěn)定運行提供有利保障，可為固定化體系處理污染廢水提供參考。