基于QuEChERS 凈化提取的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞蛋中氟苯尼考、金剛烷胺和金剛乙胺

倪煒華，陳妍，王麗麗，薛羽晴

(1.嘉興市食品藥品與產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測院，浙江嘉興 314000； 2.北方民族大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，銀川 750030)

動物性食品中的獸藥或非法添加藥物殘留對人體健康有著不容小覷的影響。雞蛋作為優(yōu)質(zhì)的高蛋白動物源食品，因其價格、營養(yǎng)、口感等多方面的因素，成為人們不可或缺的食物，因此雞蛋中獸藥或非法添加藥物殘留問題引起人們高度關(guān)注。氟苯尼考為氯霉素的第三代改良版藥物。氯霉素是公眾熟知的一種抗生素，但它可以導(dǎo)致人體再生障礙性貧血［1］，2002 年3 月15 日，我國農(nóng)業(yè)部發(fā)布《食品動物禁用的獸藥及其化合物清單》，將氯霉素列為禁止使用的抗生素。而后，在氯霉素的基礎(chǔ)上，研發(fā)了甲砜霉素，其毒性相對氯霉素減弱，藥效增強(qiáng)。而氟苯尼考是在甲砜霉素的基礎(chǔ)上，保留了甲砜基，以氟取代α-甲基位的羥基產(chǎn)生的衍生物，其藥效更強(qiáng)［2］。隨著進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，氟苯尼考具有胚胎毒性，大量、不規(guī)范使用易在畜禽、水產(chǎn)等動物性食品中殘留，直接影響消費者的健康，并導(dǎo)致耐藥菌的產(chǎn)生［3］。GB 31650—2019 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中獸藥最大殘留限量》中規(guī)定，雞蛋中不允許檢出氟苯尼考?xì)埩簟＝饎偼榘泛徒饎傄野肪鶎儆诮饎偼轭?，是廣譜類抗病毒藥物，可用于動物的疾病預(yù)防和治療［4］，但此類藥物殘留通過食物鏈進(jìn)入人體后，可在人體積累富集，對人的神經(jīng)系統(tǒng)造成危害。農(nóng)業(yè)部農(nóng)醫(yī)發(fā)【2005】33 號文《關(guān)于清查金剛烷胺等抗病毒藥物的緊急通知》中規(guī)定，禁止將金剛烷胺、金剛乙胺用于防治由高致病性禽流感等一類病原微生物引起的病毒性疫病。雖然國家已明確禁止金剛烷類藥物的使用，但部分養(yǎng)殖場濫用金剛烷類藥物的情況仍然時有發(fā)生，例如在2012 年的“速成雞”事件中，就檢測到雞肉中存在金剛烷胺殘留［5］。

目前測定氟苯尼考、金剛烷胺和金剛乙胺的方法主要有免疫分析法［6-7］、氣相色譜法［8-9］、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［10-11］、液相色譜法［12-13］以及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法［14-16］等。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法因具有高分離能力、高選擇性和高靈敏度等優(yōu)勢，廣泛應(yīng)用于藥物、食品、環(huán)境分析等領(lǐng)域。王亞會等［17］利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞肉中的金剛烷胺；李詩言等［18］利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定烏鱧肌肉中金剛烷胺、金剛乙胺和美金剛殘留；李雅寧等［19］建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測禽蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺殘留物的方法。目前采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定雞蛋中的氟苯尼考、金剛烷胺和金剛乙胺3 種藥物還未見報道。筆者選擇QuEChERS 試劑盒對樣品進(jìn)行凈化提取，通過優(yōu)化儀器條件，建立了同時測定雞蛋中氟苯尼考、金剛烷胺和金剛乙胺殘留的液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)方法，該方法快速、靈敏，可為保障食品安全提供有效的監(jiān)控手段。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：Agilent 1290 Infinity-6460 型，美國安捷倫科技有限公司。

氮氣發(fā)生器：CLAIND NIGEN LCMS40-1 型，楷來(上海)科技有限公司。氮吹儀：N-EVAP 型，美國orgnomation 公司。電子天平：JJ600 型，感量為0.01g，常熟雙杰測試儀器廠。

電子天平：BS210S 型，感量為0.1 mg，德國賽多利斯公司。

離心機(jī)：TCL-10B 型，上海安亭科學(xué)儀器廠。恒溫水浴振蕩器：SH-B 型，上海精密儀器儀表有限公司。

超純水儀：PURELAB Chorus 1 型，英國埃爾格公司。

乙腈、甲醇：均為色譜純，德國默克公司。

甲酸：色譜純，美國ACS 恩科化學(xué)公司。

氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）為99.0%，德國Dr.Ehrenstorfer 公司。

金剛烷胺、金剛乙胺標(biāo)準(zhǔn)品：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）均大于99.0%，北京曼哈格生物科技有限公司。

金剛烷胺-D6、美金剛-D6標(biāo)準(zhǔn)品：純度（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）均大于98.0%，加拿大DRC 公司。

QuEChERS 試劑盒：CQS-2 型，山東青云實驗耗材有限公司。

雞蛋樣品：市售。

1.2 溶液配制

氟苯尼考、金剛烷胺、金剛乙胺、金剛烷胺-D6、美金剛-D6單標(biāo)儲備溶液：100 μg/mL，分別稱取氟苯尼考、金剛烷胺、金剛乙胺、金剛烷胺-D6、美金剛-D6標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg(精確至0.1 mg)，置于5 只100 mL 容量瓶中，分別加入甲醇溶解并定容至標(biāo)線，混勻，于-20 ℃下避光保存。

金剛烷胺-D6、美金剛-D6混合內(nèi)標(biāo)溶液：質(zhì)量濃度均為1.0 μg/mL，分別移取金剛烷胺-D6、美金剛-D6單標(biāo)儲備溶液各1.0 mL，置于同一只100 mL容量瓶中，用甲醇稀釋至標(biāo)線，混勻，于4 ℃下避光保存。

氟苯尼考、金剛烷胺、金剛乙胺混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：質(zhì)量濃度均為1.0 μg/mL，分別移取氟苯尼考、金剛烷胺、金剛乙胺單標(biāo)儲備溶液各1.0 mL，置于同一只100 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至標(biāo)線，混勻。

氟苯尼考、金剛烷胺、金剛乙胺系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：用甲醇溶液逐級稀釋氟苯尼考、金剛烷胺、金剛乙胺混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，并加入一定量的金剛烷胺-D6、美金剛-D6混合內(nèi)標(biāo)溶液，配制成氟苯尼考、金剛烷胺、金剛乙胺的質(zhì)量濃度均分別為0.5、2、5、10、20 ng/mL 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，其中內(nèi)標(biāo)金剛烷胺-D6、美金剛-D6的質(zhì)量濃度均為5 ng/mL。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Agilent EC-C18柱(100 mm×3.0 mm，2.7 μm，美國安捷倫科技有限公司)；流動相：A 相為0.2%甲酸水溶液，B 相為甲醇；洗脫方式：梯度洗脫；洗脫程序：0～2 min 時B 相體積分?jǐn)?shù)為20%，2～3 min 時B 相體積分?jǐn)?shù)由20%等度過渡到80%，3～6 min 時B 相體積分?jǐn)?shù)為80%，6.01 min 時B 相體積分?jǐn)?shù)直接切換為20%，6.01～8 min 時B 相體積分?jǐn)?shù)為20%；流量：0.3 mL/min；進(jìn)樣體積：5 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電離模式：電噴霧(ESI)正負(fù)離子切換模式；監(jiān)測方式：多級反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式；毛細(xì)管電壓：4.0 kV；霧化氣：氮氣，純度（體積分?jǐn)?shù)）為99.9%，溫度為350 ℃，流量為11 L/min。氟苯尼考、金剛烷胺、金剛乙胺質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 氟苯尼考、金剛烷胺、金剛乙胺質(zhì)譜參數(shù)

1.4 樣品處理

稱取5.00 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL QuEChERS 萃取管中，加入20 μL 質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL 的金剛烷胺-D6、美金剛-D6混合內(nèi)標(biāo)溶液，加入20 mL 含1%甲酸的乙腈-水(體積比為80∶20)溶液，渦旋振蕩3 min，以8 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心8 min，取5 mL 上清液于QuEChERS 凈化管中，旋渦混勻1 min，以8 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，上清液全部轉(zhuǎn)移至試管中，于40 ℃水浴中氮吹至近干，用1 mL 甲醇溶解，過0.22 μm 濾膜，待測。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取劑選擇

分別用0.5%三氯乙酸-乙腈(體積比為1∶1)溶液、1%甲酸-甲醇(體積比為1∶1)溶液［20］和含1%甲酸的乙腈-水(體積比為80∶20)溶液作為提取劑，考察不同提取溶劑對3 種待測化合物的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3 種提取劑的提取效率基本一致，以0.5%三氯乙酸-乙腈溶液作為提取劑時，提取液離心后易出現(xiàn)絮狀沉淀；以1%甲酸-甲醇溶液作為提取劑時，出現(xiàn)雜峰且色譜峰形拖尾；以含1%甲酸的乙腈-水溶液作為提取劑時，離心后提取液澄清，目標(biāo)物色譜峰形尖銳且無雜峰，提取效率高，故選擇含1%甲酸的乙腈-水(體積比為80∶20)溶液作為提取劑。

2.2 流動相選擇

氯霉素類化合物常用的流動相為甲醇-水、乙腈-10 mmol/L 乙酸銨水溶液等，金剛烷類常用甲醇-乙酸水溶液或甲醇-甲酸水溶液［21］作為流動相。本試驗選擇甲醇-甲酸水溶液作為流動相?？紤]到金剛烷胺、金剛乙胺在正離子模式下具有良好的電離效果，而氟苯尼考在負(fù)離子模式下有良好的電離效果，而流動相中加入甲酸有利于正離子模式下化合物的電離，對負(fù)離子模式下化合物的電離稍有抑制作用。通過對比不同體積分?jǐn)?shù)甲酸水溶液作為流動相時的試驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)用甲醇-0.2%甲酸水溶液作為流動相對被測物進(jìn)行梯度洗脫，氟苯尼考、金剛烷胺、金剛乙胺均能得到響應(yīng)較高的離子碎片，且色譜峰形良好，滿足檢測要求。雞蛋空白樣品和加標(biāo)樣品總離子流圖如圖1 和圖2 所示，氟苯尼考、金剛烷胺、金剛乙胺的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖如圖3～圖5 所示。

圖1 空白樣品總離子流圖

圖2 加標(biāo)樣品總離子流圖

圖3 氟苯尼考MRM 色譜圖

圖5 金剛乙胺MRM 色譜圖

2.3 質(zhì)譜條件優(yōu)化

圖4 金剛烷胺MRM 色譜圖

根據(jù)氟苯尼考、金剛烷胺和金剛乙胺的結(jié)構(gòu)特點，金剛烷胺、金剛乙胺選擇ESI+電離模式，生成較強(qiáng)的［M+H］+準(zhǔn)分子離子，氟苯尼考選擇ESI-電離模式，生成較強(qiáng)的［M-H］-準(zhǔn)分子離子，適合進(jìn)行多級質(zhì)譜分析。將氟苯尼考、金剛烷胺、金剛乙胺混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液以流動注射方式在正離子模式下進(jìn)行金剛烷胺、金剛乙胺母離子全掃描，在一級全掃描質(zhì)譜中得到準(zhǔn)分子離子［M+H］+，調(diào)節(jié)相應(yīng)參數(shù)，使［M+H］+峰的豐度最大；然后對［M+H］+進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，選擇最佳子離子，同時優(yōu)化碰撞電壓，最后確定定量、定性離子對。氟苯尼考相關(guān)參數(shù)在負(fù)離子模式下得到。優(yōu)化結(jié)果見表1。

2.4 線性方程與檢出限

在1.3儀器工作條件下，分別對1.2中氟苯尼考、金剛烷胺、金剛乙胺系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、以色譜峰面積（氟苯尼考）或色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)色譜峰面積比值（金剛烷胺和金剛乙胺）為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計算線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。以3 倍信噪比對應(yīng)的待測化合物的質(zhì)量濃度作為方法檢出限，根據(jù)樣品質(zhì)量、提取體積、稀釋倍數(shù)和定容體積換算為樣品中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。氟苯尼考、金剛烷胺和金剛乙胺質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限見表2。由表2 可知，3 種化合物的質(zhì)量濃度在0.5～20 ng/mL范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均不小于0.998，方法檢出限為1.0 μg/kg，滿足分析要求。

表2 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

2.5 加標(biāo)回收與精密度試驗

準(zhǔn)確稱取5.0 g 雞蛋空白基質(zhì)，分別加入氟苯尼考、金剛烷胺、金剛乙胺混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液5、25、50 μL（氟苯尼考、金剛烷胺、金剛乙胺的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為1.0、5.0、10.0 μg/kg），然后加入金剛烷胺-D6、美金剛-D6混合內(nèi)標(biāo)溶液20 μL，按1.4 樣品處理方法，每種加標(biāo)濃度水平平行處理6 份樣品溶液，在1.3 儀器工作條件下分別進(jìn)行測定，計算平均回收率和測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表3。根據(jù)NY/T 1896—2010 《獸藥殘留實驗室質(zhì)量控制規(guī)范》和GB/T 27404—2008 《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測》規(guī)定，平均回收率應(yīng)在60%～120%的范圍內(nèi)，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)小于30%。由表3 可知，該方法平均回收率為84.0%～117.9%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為5.6%～12.0%，符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

表3 加標(biāo)回收與精密度試驗結(jié)果

3 結(jié)語

建立了基于QuEChERS 凈化提取的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞蛋中氟苯尼考、金剛烷胺和金剛乙胺的方法。該方法便捷，高效，準(zhǔn)確度和精確度較好，滿足雞蛋中氟苯尼考、金剛烷胺和金剛乙胺同時測定要求。