基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和斑馬魚模型的金盞菊緩解阿爾茨海默病癥狀及作用機(jī)制

任擎宇，靳 夢，商學(xué)良，張秀軍

[1.華北理工大學(xué)，心理與精神衛(wèi)生學(xué)院，河北 唐山 063200；2.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)生物研究所，山東省科學(xué)院藥物篩選技術(shù)重點實驗室，山東 濟(jì)南 250103]

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，WHO報道目前全球約有5 000萬AD患者，且患病人數(shù)呈逐年增長趨勢[1]。AD病患的典型臨床表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶和感知運(yùn)動能力下降、反應(yīng)遲鈍、注意力不集中等，隨著病情惡化會發(fā)展為全面性癡呆狀態(tài)，給患者及其家庭帶來巨大的心理壓力和沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。AD的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，主要涉及膽堿能系統(tǒng)紊亂、氧化應(yīng)激與自由基損傷、細(xì)胞凋亡、炎癥等方面[2]。由于目前對AD的認(rèn)知有限，其治療手段尚無統(tǒng)一定論，臨床用藥主要包括改善認(rèn)知功能的乙酰膽堿酯酶抑制劑類(鹽酸多奈哌齊、利斯的明、石杉堿甲)、抗氧化劑類(司來吉蘭)及N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑類(美金剛)等[3-4]。上述藥物主要針對于AD的單一靶點進(jìn)行阻斷和治療，雖然在一定程度上可以暫時緩解AD癥狀，但需長期服用。AD治療藥物長期服用會在患者體內(nèi)過量堆積，進(jìn)而將誘發(fā)一系列不良反應(yīng)。因此，在全球嚴(yán)峻的AD防治形勢下，研發(fā)有效治療AD且毒副作用較小的藥物已迫在眉睫。

在我國，應(yīng)用中藥作為醫(yī)學(xué)治療手段已有數(shù)千年歷史。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，在全球銷量最好的藥物中，約1/4來源自中藥等天然產(chǎn)物[5]。中醫(yī)藥因食源性、藥源性物質(zhì)中的活性成分具有更好的有效度和安全性，在疾病預(yù)防和治療中扮演著至關(guān)重要的角色。中藥毒副作用和不良反應(yīng)較小，且可發(fā)揮多成分、多途徑的治療優(yōu)勢，符合AD等神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜性、多樣性的特點，因此在臨床治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。金盞菊屬菊科植物，亦稱金盞花、萬壽菊，天然生長在亞洲、美洲等多處地帶。金盞菊中分離的化合物(包括黃酮類、皂甙類、萜類等)具有多重生物活性，在抗凋亡、抗氧化、抗炎、傷口愈合、促進(jìn)色素生物合成等方面均可發(fā)揮一定作用[6]。但是，金盞菊是否具有抗AD活性仍然未知。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)系統(tǒng)整合了傳統(tǒng)生物學(xué)、藥理學(xué)、基因組學(xué)等多個學(xué)科方向，運(yùn)用多角度高通量篩選等計算機(jī)分析技術(shù)，通過構(gòu)建“藥物-活性成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，將網(wǎng)絡(luò)大數(shù)據(jù)可視化、直觀化，從整體綜合性角度探索藥物與疾病之間的關(guān)聯(lián)，進(jìn)而預(yù)測藥物治療疾病的可行性及作用機(jī)制，近年來已成為一種探索中藥療效的高效科研方法和技術(shù)手段[7]。本研究以金盞菊為研究對象，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，擬篩選出金盞菊的主要活性成分和作用靶點，對金盞菊改善AD癥狀的作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測，并通過體內(nèi)實驗進(jìn)一步驗證。旨在為AD的臨床治療提供新的研究思路，同時深度挖掘金盞菊的活性成分及作用機(jī)制，為金盞菊的深度開發(fā)利用開辟新途徑。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑金盞菊購于河北大中藥業(yè)有限公司，研磨成粉后蒸餾提純，離心后收集上清液旋蒸，得到較純凈的金盞菊水提物，以上提取物由山東省科學(xué)院藥物化學(xué)實驗室提供并檢測。氯化鋁(AlCl3，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，CAS：7784-13-6)、鹽酸多奈哌齊(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，CAS：120011-70-3)、亞甲基藍(lán)(美國默克生命科學(xué)公司)、一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(紅色熒光)(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、Allprep組織/細(xì)胞miRNA/RNA/DNA分提試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)。

1.2 儀器斑馬魚養(yǎng)殖系統(tǒng)(北京愛生科技發(fā)展有限公司)；Zebrabox斑馬魚行為分析儀(上海眾維貿(mào)易有限公司)；超微量分光光度計(基因有限公司)；實時熒光定量PCR儀器(羅氏診斷產(chǎn)品有限公司)；AXIO Zoom.V16卡爾蔡司熒光顯微鏡(卡爾蔡司光學(xué)有限公司)；C1000 Touch梯度PCR儀(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)。

1.3 動物AB品系野生型斑馬魚，由山東省科學(xué)院生物研究所藥物篩選重點實驗室提供，并嚴(yán)格按照國際實驗動物保護(hù)認(rèn)證評估機(jī)構(gòu)相關(guān)處理準(zhǔn)則執(zhí)行。

1.4 金盞菊化學(xué)成分與相應(yīng)靶點基因的收集與篩選通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(TCMSP)數(shù)據(jù)庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.Php)檢索金盞菊藥物的全部化學(xué)成分并進(jìn)行篩選，篩選條件為：口服生物利用度(OB)≥30%且藥物相似性(DL)≥0.18。同時獲取金盞菊有效活性成分及相應(yīng)靶點信息后，利用蛋白質(zhì)(UniProt)數(shù)據(jù)庫(http://www.uniprot.org/)，轉(zhuǎn)換靶點蛋白質(zhì)名稱為對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)化基因名稱，所得信息用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

1.5 AD疾病靶點的收集與篩選通過人類基因平臺(DISGENET)數(shù)據(jù)庫(http://www.disgenet.org/)，以“Alzheimer′s disease”為關(guān)鍵詞檢索與其相關(guān)的人類基因，篩選條件為:score>0.1，最后分別與金盞菊活性成分作用靶點轉(zhuǎn)換的基因名稱進(jìn)行比對，獲得金盞菊抗AD的潛在靶點蛋白數(shù)據(jù)。

1.6 金盞菊活性成分-潛在靶點-AD疾病靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建根據(jù)TCMSP和DISGENET數(shù)據(jù)庫收集篩選以及UniProt數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)化結(jié)果，分別將金盞菊活性成分作用的靶點和AD疾病相關(guān)靶點導(dǎo)入基因功能分析(FUNRICHNEW.exe)軟件在線構(gòu)圖，得到金盞菊與AD的交集蛋白信息，繪制維恩圖。同時將此結(jié)果上傳至網(wǎng)絡(luò)可視化生物信息分析軟件(Cytoscape 3.7.2)，構(gòu)建金盞菊有效活性成分和AD疾病靶點間相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖，并根據(jù)Cytoscape 3.7.2自帶功能對此網(wǎng)絡(luò)圖的網(wǎng)絡(luò)特征進(jìn)行分析，預(yù)測金盞菊改善AD的作用機(jī)制。

1.7 靶點蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建應(yīng)用蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建軟件(STRING)數(shù)據(jù)庫(http://www.string-db.org/)構(gòu)建靶點蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)。選擇“Multiple Protein”(多種蛋白質(zhì))，輸入金盞菊與AD共同交集的靶點蛋白名稱，選擇“Homo sapiens”(人源)的蛋白質(zhì)種類屬性作為篩選條件，下載數(shù)據(jù)后導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件，根據(jù)度值(Degree)拓?fù)浞治霾⒗L制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.8 GO生物功能富集分析通過GO生物功能富集分析可以從生物的功能角度上對基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化描述，全面注釋基因及其產(chǎn)物的生物學(xué)功能和屬性分析。本研究為驗證金盞菊改善AD癥狀的靶點蛋白在基因功能中的作用，利用基因富集在線分析(Metascape)平臺對金盞菊和AD共同交集的基因信息進(jìn)行GO生物功能富集分析。

1.9 動物實驗

1.9.1實驗流程圖 見Fig 1。

Fig 1 Flow chart of experiment

1.9.2斑馬魚胚胎的準(zhǔn)備 成年雌雄斑馬魚分開飼養(yǎng)于26 ℃恒溫斑馬魚養(yǎng)殖水箱中，每日定時喂食豐年蝦兩次。按雌雄比例1 ∶1選擇成熟斑馬魚于實驗前一日下午放入產(chǎn)卵缸中用隔板隔離，于次日上午8 ∶30抽出隔板，約2 h后收取斑馬魚受精卵，在新鮮養(yǎng)殖水中反復(fù)沖洗3次，剔出死卵后移入含2 mg·L-1亞甲基藍(lán)的養(yǎng)殖水中，置于恒溫培養(yǎng)箱中控光孵化。

1.9.3分組、造模及給藥 選取健康的3 dpf斑馬魚幼魚隨機(jī)分為空白對照組、造模組(AlCl3溶液80 μmol·L-1)、陽性藥組(AlCl3溶液80 μmol·L-1+鹽酸多奈哌齊4 μmol·L-1)、低、中、高濃度金盞菊組(根據(jù)前期濃度致死率實驗統(tǒng)計后，確定金盞菊的最大安全劑量，26 mg·L-1)(AlCl3溶液80 μmol·L-1+金盞菊提取物6.5、13、26 mg·L-1)，每組40條。將各組斑馬魚幼魚置于6孔培養(yǎng)板中，每孔20條，水環(huán)境pH(氫離子濃度指數(shù))值保持在7.0～7.5，恒溫保溫箱中環(huán)境溫度保持在28 ℃左右，并且始終模擬晝夜交替(光照10 h和遮光14 h)環(huán)境。空白組板孔中給予純凈水，其他組在純凈水中加入相應(yīng)藥液，每日更換一次新鮮純凈水和藥液，連續(xù)給藥3日至6 dpf。

1.9.4行為學(xué)實驗 運(yùn)動能力下降、反應(yīng)能力減退是AD患者典型的臨床表現(xiàn)，擬通過明暗交替行為學(xué)實驗檢測金盞菊改善斑馬魚AD樣行為的效果。從各組中隨機(jī)選取6 dpf斑馬魚放入48孔板中(n=10)，每孔加入1 mL純凈水后吸入1條魚，再將48孔板放入斑馬魚行為分析儀暗箱中，在斑馬魚適應(yīng)環(huán)境10 min后開始正式實驗，檢測時間設(shè)置為60 min(黑暗環(huán)境10 min和明亮環(huán)境10 min，交替循環(huán)3次)，視頻記錄其運(yùn)動軌跡，之后運(yùn)用Zeblab軟件處理數(shù)據(jù)，計算每條魚在明暗交替環(huán)境下的游動總距離和平均速度。

1.9.5斑馬魚腦區(qū)細(xì)胞凋亡情況檢測 腦區(qū)細(xì)胞凋亡是AD典型的病理學(xué)特征之一，擬通過TUNEL染色實驗方法，對各組斑馬魚腦區(qū)細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行檢測，驗證斑馬魚AD樣行為與腦區(qū)細(xì)胞凋亡的關(guān)聯(lián)一致性。根據(jù)行為學(xué)實驗的量效關(guān)系，選定26 mg·L-1作為金盞菊給藥濃度，分別從空白對照組、造模組、陽性藥組和金盞菊組中隨機(jī)選取6 dpf斑馬魚，經(jīng)多聚甲醛固定并4 ℃過夜處理。第二日按照一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書操作，對斑馬魚腦區(qū)凋亡細(xì)胞染色，利用AXIO Zoom.V16蔡司熒光顯微鏡觀察，采集圖像并統(tǒng)計各組斑馬魚腦區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)量。

1.9.6探究金盞菊改善斑馬魚AD樣癥狀的作用機(jī)制 通過實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)實驗方法探究金盞菊改善斑馬魚AD樣癥狀的細(xì)胞凋亡機(jī)制。分別從空白對照組、造模組、陽性藥組和金盞菊組隨機(jī)收集斑馬魚于EP(eppendorf)管中(n=30)，加入裂解緩沖液在組織研磨機(jī)中機(jī)械勻漿后離心取上清液，提取RNA(ribonucleic acid)，利用超微量分光光度計測定濃度，A260/A280應(yīng)在2.0～2.5之間。立即使用C1000 Touch梯度PCR儀將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA(complementary DNA)，期間嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。以各組反轉(zhuǎn)完成后的cDNA為模板，加入待測引物在qRT-PCR儀器中擴(kuò)增后，輸出各組別目的基因的CT(Cycle Threshold)值，以Rpl13a為內(nèi)參基因，通過2-ΔΔCT相對定量法計算不同組別基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 金盞菊有效活性成分及作用靶點通過TCMSP數(shù)據(jù)分析平臺收集到金盞菊活性成分共35個，根據(jù)Lipinski(類藥性五原則)標(biāo)準(zhǔn)，以O(shè)D%≥30；DL≥0.18為篩選條件，篩選出8個化合物作為金盞菊有效活性成分(Tab 1)，對應(yīng)235個靶點，刪除重復(fù)靶點后剩余187個作用靶點。

Tab 1 The active components and medical value of C.officinalis

2.2 金盞菊抗AD成分-靶點網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖通過DISGENET數(shù)據(jù)分析平臺收集到與AD相關(guān)靶點蛋白信息，篩選出221個AD靶點。依據(jù)UniProt數(shù)據(jù)庫轉(zhuǎn)換結(jié)果，繪制AD-金盞菊交集靶點維恩圖(Fig 2)。利用Cytoscape 3.7.2分析軟件將活性成分與靶點的對應(yīng)關(guān)系可視化為金盞菊抗AD成分-靶點網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，共包括455條邊和385個節(jié)點。

Fig 2 Ingredients-targets network of C.officinalis against AD

2.3 金盞菊抗AD作用靶點的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)將上述篩選的32個金盞菊抗AD的潛在作用靶點蛋白導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中，得到靶點蛋白間的相互作用信息。將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2數(shù)據(jù)庫中構(gòu)建金盞菊抗AD的PPI網(wǎng)絡(luò)圖(Fig 3)，共有32個節(jié)點代表靶點和208條邊代表靶點間相互作用關(guān)系，節(jié)點與邊相互交錯，提示金盞菊抗AD的潛在靶點間關(guān)聯(lián)密切，金盞菊通過多靶點多通路發(fā)揮抗AD作用。圖中的節(jié)點顏色越深，表示該節(jié)點Degree越大，度值較大的關(guān)鍵靶點為CASP3、VEGFA、TNF等，提示它們可能在金盞菊抗AD中發(fā)揮重要作用。

Fig 3 The protein-protein interaction network of anti-AD targets of C. officinalis

2.4 GO生物功能富集分析結(jié)果將金盞菊抗AD的32個潛在作用靶點蛋白導(dǎo)入Metascape平臺數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行GO功能富集分析，可以獲得與蛋白相對應(yīng)的基因生物學(xué)功能，包括細(xì)胞組分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)、生物過程(biological process，BP)3個方面。通過GO功能富集分析共收集到42條結(jié)果，根據(jù)基因數(shù)值，列出前20條GO功能富集分析結(jié)果(Tab 2)。上述靶點蛋白對應(yīng)基因的分子功能主要涉及細(xì)胞凋亡、毒物質(zhì)反應(yīng)、活性氧代謝等方面。其中細(xì)胞凋亡排在首位，提示抗凋亡機(jī)制在金盞菊抗AD活性中發(fā)揮重要作用。

Tab 2 Results of top 20 of GO biological function analysis

2.5 實驗結(jié)果

2.5.1基于斑馬魚模型的金盞菊抗AD活性驗證 本研究對不同實驗組的斑馬魚進(jìn)行了明暗交替行為學(xué)檢測(n=10)，以檢測其運(yùn)動能力和對應(yīng)激刺激的恢復(fù)能力，結(jié)果見Fig 4。相比于空白對照組，造模組斑馬魚的AD樣行為表現(xiàn)在游動的平均速度明顯變慢、對光亮刺激后的恢復(fù)能力下降(Fig 4A，造模組所示)，游動總距離明顯減少(Fig 4B，造模組所示)(P<0.01)；與造模組比較，陽性藥組與金盞菊組斑馬魚游動的平均速度變快、對光亮刺激后的恢復(fù)能力提高(Fig 4A，陽性藥組和金盞菊組所示)，游動總距離明顯增加(Fig 4B，陽性藥組和金盞菊組所示)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(陽性藥組：P<0.05；金盞菊組：P<0.01)。研究結(jié)果表明，金盞菊可以改善斑馬魚AD樣行為，且抗AD活性與其濃度呈正相關(guān)。

Fig 4 The relieving effect of positive drugs and C.officinalis on AD-like behavior in zebrafish (n=10)

2.5.2基于斑馬魚腦區(qū)凋亡檢測的金盞菊抗AD活性和內(nèi)在機(jī)制驗證 基于前期文獻(xiàn)報道和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果，AD與細(xì)胞凋亡之間關(guān)系密切，本研究通過對斑馬魚腦區(qū)開展TUNLE細(xì)胞凋亡檢測以驗證金盞菊抗AD的活性和與凋亡相關(guān)的內(nèi)在機(jī)制。如Fig 5所示，與空白對照組相比，造模組斑馬魚腦區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增加(P<0.01)；與造模組相比，陽性藥組和金盞菊組凋亡數(shù)量明顯減少(P<0.01)，表明金盞菊對斑馬魚腦區(qū)細(xì)胞凋亡具有一定緩解作用。結(jié)合上述金盞菊改善AD樣行為的實驗結(jié)果，本研究驗證了金盞菊的抗AD活性和與抗凋亡相關(guān)的作用機(jī)制，提示抗凋亡極有可能是金盞菊發(fā)揮抗AD活性的作用途徑。

Fig 5 Comparison and statistic analysis of apoptotic cells in zebrafish brain regions

2.5.3金盞菊改善AD癥狀的抗凋亡作用機(jī)制 為探究金盞菊改善AD癥狀的機(jī)制，本研究采用qRT-PCR檢測不同實驗組CASP3 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示(Fig 6)，與空白對照組相比，CASP3表達(dá)水平明顯上調(diào)(P<0.01)；與造模組相比，CASP3表達(dá)水平在金盞菊組下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，陽性藥組雖有下降趨勢但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，實驗結(jié)果表明，金盞菊能夠調(diào)控凋亡相關(guān)基因的異常表達(dá)。

Fig 6 Expression of AD apoptosis-related genes

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合了多學(xué)科、多領(lǐng)域，從系統(tǒng)性角度為中藥活性成分和作用機(jī)制研究提供了全新的研究方向，同時可為中藥的藥效開發(fā)提供有效性和科學(xué)性理論基礎(chǔ)。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，從金盞菊-活性成分-作用靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)中預(yù)測出槲皮素(quercetin)和豆甾醇(stigmasterol)是抗AD的關(guān)鍵化學(xué)成分，這與之前的研究結(jié)果一致[8-9]。Rifaai等[10]報道，在AlCl3誘導(dǎo)的大鼠AD模型中，槲皮素有助于神經(jīng)再生和甲狀腺激素(thyroid hormone，TH)分泌，緩解了AlCl3對海馬神經(jīng)元的破壞，顯著降低了神經(jīng)元退行性改變，減少了淀粉樣斑塊(amyloid plaques，APs)和神經(jīng)原纖維纏結(jié)的形成。Burg等[11]研究表明，豆甾醇可降低脂質(zhì)筏中膽固醇和早老素的分布，以減少APs的產(chǎn)生，進(jìn)而緩解神經(jīng)元變性損傷，表現(xiàn)出抗AD活性。由此推測，上述化學(xué)成分可能是金盞菊改善AD的藥效物質(zhì)。然而金盞菊改善AD的效果和作用機(jī)制尚不明晰，有待進(jìn)一步研究。

相對于傳統(tǒng)的哺乳類動物實驗?zāi)Ｐ?，斑馬魚模型繁殖速度快、便于飼養(yǎng)和操作，可以有效彌補(bǔ)并完善現(xiàn)有藥物篩選和研發(fā)體系，提高藥物篩選效率、降低研發(fā)成本，現(xiàn)已被應(yīng)用于多種人類疾病研究。Sang等[12]通過斑馬魚AD模型揭示出芹菜素能夠通過抗氧化途徑緩解斑馬魚AD樣癥狀，驗證了以斑馬魚為模型進(jìn)行抗AD機(jī)制探究的可行性。

AD是一種發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、療程長且難治愈的神經(jīng)退行性疾病?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致AD發(fā)病及進(jìn)展的關(guān)鍵調(diào)控途徑[13]。金盞菊抗AD的32個潛在作用靶點GO富集分析結(jié)果顯示，金盞菊抗AD主要通過細(xì)胞凋亡、活性氧代謝等途徑發(fā)揮作用，說明金盞菊抗AD呈現(xiàn)多靶點、多途徑協(xié)同作用方式，避免了傳統(tǒng)治療效果單一的短板。在GO富集分析結(jié)果中，細(xì)胞凋亡信號途徑居于首位，提示該通路與金盞菊緩解AD癥狀密切相關(guān)。本結(jié)果與既往文獻(xiàn)報道[14]契合，為下一步機(jī)制驗證提供了理論基礎(chǔ)。

通過PPI網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn)，金盞菊與AD靶點存在緊密的相互作用關(guān)系，其中CASP3、VEGFA、TNF是網(wǎng)絡(luò)圖中的關(guān)鍵靶點，且與金盞菊活性成分具有較好的結(jié)合性。以往研究表明，VEGFA可拮抗異常載脂蛋白APOE(apolipoprotein E)，在AD高風(fēng)險人群中發(fā)揮保護(hù)作用[15]。據(jù)Drews等[16]報道，氯沙坦通過降低炎性細(xì)胞因子TNF表達(dá)水平，改善從成年轉(zhuǎn)基因 AD 小鼠中星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移特性。CASP3是細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用的終末剪切酶，通過自我活化參與其他家族蛋白酶的活化過程，漿化細(xì)胞膜引起細(xì)胞凋亡，繼而產(chǎn)生AD典型病理學(xué)表現(xiàn)——Aps，誘導(dǎo)AD患者產(chǎn)生認(rèn)知和行為功能障礙[17]。為探究金盞菊改善AD的作用機(jī)制，本研究采用TUNEL染色方法，對各實驗組斑馬魚腦區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行比較。結(jié)果顯示，造模組凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增多，且凋亡趨勢與以往文獻(xiàn)報道相似[14]。金盞菊處理后斑馬魚腦區(qū)細(xì)胞凋亡數(shù)目減少，驗證了金盞菊的抗凋亡活性。王玥等[18]已通過實驗揭示阿魏酸可降低CASP3表達(dá)水平，從而起到改善AD癥狀的作用。本研究經(jīng)qPT-PCR方法進(jìn)一步驗證金盞菊抗AD的凋亡機(jī)制，結(jié)果顯示金盞菊可調(diào)節(jié)斑馬魚CASP3 mRNA的異常表達(dá)，提示金盞菊可以抑制細(xì)胞凋亡，緩解斑馬魚AD樣癥狀，與上述網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果相一致。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測了金盞菊抗AD的主要作用靶點蛋白，構(gòu)建交互作用網(wǎng)絡(luò)圖，運(yùn)用金盞菊活性成分抗AD靶點蛋白的生物過程富集分析，闡述了金盞菊通過多靶點、多通路發(fā)揮抗AD活性的作用機(jī)制，其中細(xì)胞凋亡途徑綜合性關(guān)聯(lián)程度最高。通過體內(nèi)實驗對網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)一步驗證，結(jié)果顯示金盞菊可以有效改善斑馬魚AD樣癥狀，且抗凋亡途徑參與這一生物學(xué)過程。