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    新冠肺脾氣虛方對體外新冠病毒增殖及炎癥因子表達的影響

    2022-03-22 06:47:20謝佩芳馬欽海李洪梅邵榆嵐沈智麗李蓉濤楊子峰趙金存董書維楊洪軍夏雪山
    中國藥理學(xué)通報 2022年3期
    關(guān)鍵詞:載量孵育病毒

    謝佩芳,李 慧,馬欽海,李洪梅,李 芳,邵榆嵐,方 越,沈智麗,李蓉濤,楊子峰,趙金存,董書維,楊洪軍,夏雪山

    (1.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,云南 昆明 650500;2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所,北京 100700;3.廣州醫(yī)科大學(xué)呼吸疾病國家重點實驗室,廣州 廣東 510120)

    冠狀病毒(coronavirus,CoVs)是一種單鏈RNA病毒,可感染人和多種脊椎動物。已知可感染人類的7種冠狀病毒中,嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS-CoV)、中東呼吸綜合征(MERS-CoV)和新型冠狀(SARS-CoV-2)病毒因其高傳染性、高致病性對社會公眾健康造成了重大威脅[1]。與此同時,引起成人普通感冒的HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63 和 HCoV-HKU1這4種普通冠狀病毒在兒童、老年人或免疫抑制人群中易造成嚴(yán)重呼吸道感染[2-3]。對于冠狀病毒感染,現(xiàn)有臨床治療主要采用對癥和支持療法,尚缺乏特異性藥物。此外,因冠狀病毒具有高頻率同源/異源重組和基因組靈活性等特點,使其具有較強的人群感染適應(yīng)能力和逃逸藥物選擇壓力的能力[4]。為應(yīng)對常見流行冠狀病毒危害、尤其新發(fā)冠狀病毒的大流行,亟需篩選具有抗多種冠狀病毒感染作用的廣譜藥物。

    在冠狀病毒感染過程中,刺突蛋白(spike protein,S)與細胞表面受體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)結(jié)合,導(dǎo)致病毒吸附并進入細胞[5]。病毒侵入后,可激活機體免疫系統(tǒng),引起MCP-1、IL-10和IP-10等免疫介質(zhì)大量產(chǎn)生,加劇免疫反應(yīng),導(dǎo)致組織損傷、水腫,還容易引發(fā)二次感染,嚴(yán)重威脅患者健康[6]。因此,尋找限制病毒復(fù)制和抑制過度促炎反應(yīng)的藥物,對于減緩冠狀病毒感染造成的機體損傷具有重要價值。

    本研究所選肺脾氣虛方(以下簡稱4-1)為國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》試行第四和第五版推薦處方,主要用于治療脾肺氣虛的恢復(fù)期患者,但是其治療機理尚不清楚。本研究擬在體外水平確定4-1對新冠病毒和普通冠狀病毒的抗病毒作用,并從多個炎癥因子表達層面探討其抗炎效果和抗病毒作用機理。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料

    1.1.1細胞和病毒 人直腸癌HRT-18細胞系(ATCC CCL-244)、恒河猴腎上皮細胞系LLC-MK2 (ATCC CCL7)、非洲綠猴腎上皮細胞系Vero E6 (ATCC CRL-1586)和人肝細胞癌細胞系Huh-7 (ATCC)由本實驗室保存。HCoV-OC43 (VR-1558)、HCoV-229E、HCoV-NL63毒株由廣州醫(yī)科大學(xué)趙金存教授提供,SARS-CoV-2 (Genebank accession no.MT123290.1)由廣州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床分離。

    1.1.2藥物 連花清瘟原料藥粉(Lianhuaqingwen powder,LH)由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所提供,鹽酸阿比朵爾片(arbidol hydrochloride tablets,ARB)(0.1 g/片)購自中海石油歐益制藥有限公司,瑞德西韋(remdesivir,RDV)由廣州醫(yī)科大學(xué)楊子峰教授提供。新冠肺脾氣虛方(4-1)飲片由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所提供,該處方包含法半夏9 g、陳皮10 g、黨參15 g、炙黃芪30 g、茯苓15 g、藿香10 g以及砂仁6 g,煎煮方法如下:取上述藥材,除砂仁外加8倍量水(加水量按總處方計算)浸泡30 min后加熱煎煮,沸騰20 min,濾過,為一煎液;按砂仁重量取10倍一煎液,加入砂仁,單獨煎煮10 min,過濾,為砂仁煎煮液;將砂仁煎煮液與法半夏等藥渣混合,再加入8倍水,煎煮20 min,過濾,濾液與一煎液混合后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行濃縮,濃縮液以1 000 r·min-1常溫離心10 min,用0.45 μm濾膜過濾,得到4-1水煎劑。每毫升4-1煎劑相當(dāng)于0.874 g生藥。

    1.1.3主要試劑和儀器 色譜純試劑甲醇和乙腈(Thermo Fisher,美國);RPMI 1640、DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)(Gibco,美國);MTT噻唑蘭和二甲基亞砜(DMSO)試劑(GBCBIO,中國);RNAiso Plus (TRIzol)、RR064A One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit、RR036A PrimeScript RT Master Mix、RR390A Premix Ex Taq (Probe qPCR)、SYBR Premix Ex TapTMⅡ (TaKaRa,日本);E.Z.N.A.viral RNA extraction 162 R6874-02(Omega Bio-Tek,美國);PCR引物(上海生工生物科技有限公司);pEASY-T1載體 (北京全式金生物技術(shù));pTRIPLEscript載體(Ambion,美國);6540 UHD Accurate-Mass Q-TOF LC/MS (Agilent,美國);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(BUCHI,瑞士);酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Thermo Fisher公司的Multiskan GO);ABI檢測系統(tǒng)(ABI PRISM?7500 Real-time PCR system,Applied Biosystems Co,USA)。

    1.2 實驗方法

    1.2.1藥物準(zhǔn)備 LH、ARB、RDV分別用DMSO配制成濃度為300和100 g·L-1、100 mmol·L-1的儲存液。上述藥物儲存液及4-1水煎劑于4 ℃保存待用。

    1.2.2處方煎劑LC-MS分析 將4-1中藥復(fù)方及其配伍藥材分別粉碎,95%乙醇冷浸提取3次(每次24 h)。合并3次提取液,減壓濃縮除去乙醇,得到醇提物。取少量溶于甲醇,過濾后進行LC-MS分析。篩選在4-1復(fù)方和配伍藥材中具有相同保留時間(tR)和質(zhì)荷比(m/z)的分子離子峰(或準(zhǔn)分子離子峰),通過與配伍藥材的化學(xué)成分進行比較以及文獻查閱,確定離子峰可能的化學(xué)組成。

    1.2.3細胞和病毒培養(yǎng) 人直腸癌HRT-18細胞系于RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。恒河猴腎上皮細胞系LLC-MK2、非洲綠猴腎上皮細胞系Vero E6和人肝細胞癌細胞系Huh-7于添加10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。HCoV-OC43 (VR-1558)、HCoV-229E、HCoV-NL63和SARS-CoV-2病毒分別在HRT-18、Huh-7、LLC-MK2、Vero E6細胞中培養(yǎng)。以上病毒均儲存于-80 ℃。用Reed-Muench法計算組織半數(shù)感染量(TCID50)。

    1.2.5CPE法檢測抗病毒藥效 以PBS洗滌96孔板中預(yù)先鋪好的單層細胞,每孔加入100 μL 100TCID50的病毒稀釋液,在34 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h,棄去病毒液,加入特定濃度的藥物,每個濃度設(shè)置4個復(fù)孔。HCoV-229E和SARS-CoV-2孵育3 d,HCoV-OC43 (VR-1558)孵育5 d(d 3補液100 μL/孔)。根據(jù)CPE分級標(biāo)準(zhǔn)記錄各處理所對應(yīng)的CPE情況:“+”為25%的細胞出現(xiàn)病變;“”為50%細胞出現(xiàn)病變;“”為75%的細胞出現(xiàn)病變;“”為>75%的細胞出現(xiàn)病變。用Prism non-regression analysis計算藥物半數(shù)有效濃度(IC50),計算選擇指數(shù)(SI)=CC50/IC50。

    1.2.6藥物體外抑制病毒增殖與RT-PCR法病毒載量檢測 用感染復(fù)數(shù)(MOI)為1的HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和SARS-CoV-2分別感染Huh7、HRT-18、LLC-MK2和Vero-E6細胞,吸附2 h后去上清,PBS洗滌2次,隨后分別加入特定藥物濃度的培養(yǎng)基,藥物濃度為:Huh7細胞,4-1為10、5、2.5 g·L-1,LH為500 mg·L-1,ARB為4 mg·L-1;HRT-18細胞,4-1為20、10、5 g·L-1,LH為600 mg·L-1,ARB為6 mg·L-1;LLC-MK2細胞,4-1為 20、10、5、2.5 g·L-1,LH為400 mg·L-1,ARB為2 mg·L-1;Vero E6細胞,4-1為10、5、2.5 g·L-1,LH為400 mg·L-1,ARB為2 mg·L-1,RDV為5 μmol·L-1;放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育。分別孵育48、72 h (229E),72、96、120 h (OC43),120、168 h (NL63)及48 h (SARS-CoV-2 )后收集上清。用E.Z.N.A.病毒RNA提取試劑盒提取上清液中病毒RNA,按照RR064A試劑說明測定上清中病毒載量。分別擴增HCoV-OC43、HCoV-229E和HCoV-NL63核蛋白(n)基因并插入到pEASY-T1載體中,擴增SARS-CoV-2 RdRp/Helicase基因插入到pTRIPLEscript載體中,利用所得重組質(zhì)粒制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,用于計算各冠狀病毒載量[7]。引物序列見Tab 1。

    1.2.7qRT-PCR檢測藥物對SARS-CoV-2所致細胞ACE2、病毒S蛋白、IL-1α和CCL-5/RANTES mRNA表達水平的影響 SARS-CoV-2病毒吸附2 h后,去上清,加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)基,培養(yǎng)箱孵育48 h后去上清,用RNAiso Plus試劑盒提取細胞總RNA,按照RR036A說明將其逆轉(zhuǎn)錄成cDNA;以GAPDH為內(nèi)參基因,利用SYBR Premix Ex TapTMⅡ進行qRT-PCR檢測,以2-ΔΔCt方法計算。PCR檢測系統(tǒng)為ABI檢測系統(tǒng)。

    1.2.8qRT-PCR檢測藥物對OC43和229E感染細胞中炎癥因子表達水平的影響 OC43和229E病毒吸附2 h后,去上清,加入含不同濃度藥物的培養(yǎng)基,培養(yǎng)箱分別孵育48 h (229E)和96 h (OC43)后去上清,細胞總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄方法同1.2.7;以GAPDH為內(nèi)參基因,根據(jù)RR390A說明進行qRT-PCR檢測促炎因子mRNA表達水平,以2-ΔΔCt方法計算。引物序列見Tab 1。

    Tab 1 The primer sequences for quantitative measurement of HCoVs genes and cytokines/chemokines

    續(xù)Tab 1

    2 結(jié)果

    2.1 4-1化學(xué)成分分析LC-MS分析表明,從4-1中藥粉劑和7個配伍飲片的醇提物鑒定了94個化合物,包括17個黃酮、14個甾體、13個倍半萜、13個脂肪酸及其脂類、8個酚類、5個三萜以及24個其他類型化合物。來源于半夏的化學(xué)成分有15種,涉及不飽和脂肪酸及其酯、生物堿和低聚糖等;來源于廣藿香的化合物共16種,以愈創(chuàng)木烷型倍半萜為主,以及一定量的廣藿香油;來源于茯苓的化合物有17種,主要包括倍半萜、三萜及甾體化合物;來源于炙黃芪的化學(xué)成分共10種,涉及甾體及其苷、異黃酮及其苷,以及三萜皂苷;來源于黨參的化學(xué)成分有22種,主要是炔苷、苯丙素、生物堿和芳香族化合物;來源于砂仁的化學(xué)成分有8種,涉及黃酮苷、甾體、單萜和芳香族化合物;來自陳皮的化合物有10種,包括9個黃酮及1個檸檬苦素類化合物 (Fig 1,Tab 2)。

    Tab 2 Retention time and ion flow information of LC-ESI+-MS in ethanol extraction group of TCM compound 4-1

    續(xù)Tab 2

    續(xù)Tab 2

    Fig 1 Results of LC-MS analysis of TCM 4-1 in alcohol extraction group

    Tab 3 Antiviral activity of n=3)

    2.2 4-1可在核酸水平抑制SARS-CoV-2體外增殖,降低SARS-CoV-2誘導(dǎo)的IL-1α 和CCL-5/RANTES近期研究表明,LH、ARB和RDV可以抑制SARS-CoV-2的復(fù)制[8-9]。本研究以這3種藥物為對照藥物,檢測4-1對SARS-CoV-2的抑制作用。在SARS-CoV-2感染的Vero-E6細胞中,4-1 CC50為(141.75±1.40)g·L-1,IC50為(6.80±0.11)g·L-1,選擇指數(shù)(SI,CC50/IC50)>2,說明該藥物對SARS-CoV-2低毒高效(Tab 3)。進一步通過RT-PCR檢測4-1對病毒核酸的抑制作用,在感染48 h時,4-1能較好抑制上清中病毒mRNA表達,且呈濃度依賴關(guān)系(Fig 2A)。4-1在10 g·L-1濃度下對對病毒復(fù)制抑制效果優(yōu)于ARB (2 mg·L-1)、LH (400 mg·L-1)及RDV(5 μmol·L-1),差異具有顯著性(P<0.01)。IL-1α和CCL-5/RANTES是重要的促炎因子和趨化因子,本研究結(jié)果顯示,4-1能顯著降低SARS-CoV-2誘導(dǎo)的IL-1α和CCL-5/RANTES,且高濃度10 g·L-1降低CCL-5/RANTES效果優(yōu)于ARB(2 mg·L-1)和LH (400 mg·L-1)(Fig 2B)。

    2.3 4-1抑制細胞ACE2受體和SARS-CoV-2病毒S蛋白mRNA表達如Fig 3所示,SARS-CoV-2感染Vero-E6細胞后,4-1持續(xù)作用48 h,在10、5和2.5 g·L-1濃度下均能降低細胞ACE2及病毒S蛋白mRNA表達水平;與ARB(2 mg·L-1)、LH(400 mg·L-1)及RDV(5 μmol·L-1)相比,中、高濃度4-1對病毒S蛋白 mRNA表達抑制效果更好(P<0.05)。

    2.4 4-1對普通冠狀病毒體外增殖抑制作用

    2.4.14-1具備抗病毒活性 為了明確4-1是否對不同株系冠狀病毒發(fā)揮抗病毒作用,本研究進一步檢測該藥物對3種普通冠狀病毒的抑制效果。4-1對HRT-18、Huh7和LC-MK23種細胞的細胞毒性見Tab 3。通過CPE法檢測發(fā)現(xiàn)4-1對HCoV-OC43和HCoV-229E的IC50值分別為(13.57±0.71)和(7.04±0.30)g·L-1。HCoV-NL63感染LLC-MK2細胞5 d后,通過qRT-PCR檢測上清中病毒載量,其IC50為(2.64±0.14)g·L-1。如Tab 3所示,4-1對3種普通冠狀病毒SI值均大于2,說明該藥物具備抗3種冠狀病毒活性。

    Fig 2 The inhibitory rate of viral mRNA expression in supernatant and mRNA levels of intracellular pro-inflammatory cytokines after treated with n=3)

    Fig 3 The mRNA levels of host ACE2 and viral S protein in SARS-CoV-2-infected cells after treated with

    2.4.24-1可降低三種冠狀病毒在細胞上清中的病毒載量,提高病毒增殖抑制率 3種冠狀病毒分別吸附相應(yīng)細胞2 h后,對藥物持續(xù)作用不同時間內(nèi)上清中的病毒載量進行檢測。結(jié)果顯示,4-1對3種病毒的抑制作用均呈濃度依賴性。在HCoV-OC43感染HRT-18細胞中,高濃度藥物 (30、20 g·L-1在72和120 h時抑制率均高于50%,且4-1 (30 g·L-1)持續(xù)治療120 h時,其抑制率明顯高于LH(600 mg·L-1)(P<0.01);相比濃度為6 mg·L-1的ARB,4-1在30、20 和10 g·L-1濃度下抑制效果更好(P<0.01)(Fig 4A)。對于HCoV-229E感染Huh7細胞,4-1 (20 g·L-1)持續(xù)作用72 h時,其抑制率顯著高于ARB(4 mg·L-1),且不同濃度的抑制效果均優(yōu)于LH(500 mg·L-1)(Fig 4B)。在HCoV-NL63感染LLC-MK2細胞中,高濃度4-1(20 g·L-1)持續(xù)作用120和168 h時,其抑制效果差異無統(tǒng)計學(xué)意義,而低濃度(2.5 g·L-1)藥物抑制效果在120 h時優(yōu)于168 h(P<0.01)。藥物持續(xù)作用120 h時,4-1(20 g·L-1)抑制率優(yōu)于ARB(2 mg·L-1)和LH (400 mg·L-1)(Fig 4C)。上述結(jié)果表明,4-1通過抑制上清中病毒載量從而發(fā)揮對多株系冠狀病毒的廣譜抗病毒作用。

    2.5 4-1抑制普通冠狀病毒感染誘導(dǎo)的細胞因子/趨化因子表達以過度促炎介質(zhì)的產(chǎn)生或免疫細胞募集為特征的異常免疫反應(yīng)可加速疾病的發(fā)病過程。因此,我們進一步檢測4-1對229E及OC43感染細胞中炎癥介質(zhì)表達的影響。結(jié)果顯示,HCoV-OC43感染96 h和HCoV-229E感染48 h均導(dǎo)致IL-6、CXCL-8/IL-8、CXCL-10/IP-10、TNF-α、IFN-α、CCL-2/MCP-1、CXCL-9/MIG和CCL-5/RANTES的mRNA水平顯著升高,而4-1可降低上述基因mRNA表達水平,該藥物作用呈濃度依賴性(P<0.01)(Fig 5A,5B)。與對照藥物相比,在HCoV-OC43感染細胞中,ARB (6 mg·L-1)對CXCL-8/IL-8、IL-6、CXCL-10/IP-10、TNF-α的作用優(yōu)于中低劑量的4-1 (Fig 5A);在HCoV-229E感染細胞中,除CXCL-9/MIG外,不同劑量4-1以及LH (500 mg·L-1)對各炎癥因子表達水平的抑制作用均優(yōu)于ARB (4 mg·L-1)(Fig 5B)。這些結(jié)果表明,4-1對多株系冠狀病毒感染誘導(dǎo)的促炎反應(yīng)具有緩解作用。

    3 討論

    肺脾氣虛方主要用于改善新冠患者恢復(fù)期癥狀,包括惡心乏力、倦怠、痞滿,大便粘稠、舌苔白膩等。與一定劑量的LH和ARB相比,4-1對病毒復(fù)制抑制的效果更好,抑制作用可持續(xù)至感染后期。廣藿香具有抗病毒抗炎作用,調(diào)節(jié)免疫,止咳、平喘、止嘔,其有效成分廣藿香油能有效抑制病毒復(fù)制[10];來源于炙黃芪的苷類化合物能抑制流感病毒H1N1、合胞病毒RSV及登革病毒的增殖[11-12]。4-1配伍中含有廣藿香油,苷類等化合物,這也許是其能普遍抑制多種病毒增殖,且對不同病毒的感染后期也有一定的抑制效果的原因之一。

    Fig 4 The inhibitory rate of common coronaviruses mRNA expression in supernatant after drug n=3)

    Fig 5 Expression of pro-inflammatory cytokines after treated with n=3)

    病毒粒子的遷移由S蛋白主導(dǎo)。S蛋白識別受體,吸附并進入宿主細胞。這種S蛋白-受體的相互作用支配著病毒的組織趨向性[5-6]。4-1一方面通過抑制SARS-CoV-2的復(fù)制從而降低S蛋白的表達,另一方面一定程度上干擾了宿主細胞受體ACE2的合成,從而減少病毒的遷移和吸附。

    冠狀病毒侵入宿主細胞后可促發(fā)級聯(lián)反應(yīng),并導(dǎo)致炎癥因子風(fēng)暴的產(chǎn)生,從而加劇疾病進程[13]。ARB (4 mg·L-1)對229E感染引起的炎癥因子表達上調(diào)作用有限,除 CXCL-9/MIG外該藥物不能顯著降低其余炎癥因子 mRNA表達水平。而4-1可普遍降低SARS-CoV-2、OC43和229E感染誘導(dǎo)的細胞因子/趨化因子mRNA表達水平。這可能與4-1含有多種抗炎成分有關(guān)。以往研究顯示,來源于廣藿香的倍半萜化合物能抑制脾細胞增殖[14];黃芪活性成分如黃芪甲苷等能誘導(dǎo)T細胞激活、增強CD45磷酸酶活性、抑制促炎細胞因子上調(diào)等,參與免疫調(diào)節(jié)[15];此外黨參補脾肺氣,改善機體免疫功能[16]。而LC-MS分析提示4-1中含以上抗炎成分,這些結(jié)果表明,新冠肺脾氣虛處方4-1對多種病毒具有潛在的抗炎作用。

    綜上,本研究證明了該處方能有效抑制多種冠狀病毒的增殖及炎癥發(fā)生,且抗病毒效果可持續(xù)到感染后期。為臨床推薦恢復(fù)期用藥提供了一定的基礎(chǔ)證據(jù)。

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