白細胞介素-6基因敲除對創(chuàng)傷失血性休克小鼠肺組織Syndecan-1的影響及機制

范穎楠,馮筑生,于超平,謝建剛,王倩梅,劉善收,尹 文

空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院急診科，西安 710032

近年來，對于創(chuàng)傷失血性休克(traumatic hemorrhagic shock,THS)的病理生理學機制認識持續(xù)深入，相關(guān)的診治指南繼續(xù)更新發(fā)展。在2019版的《嚴重創(chuàng)傷出血和凝血病出血歐洲指南(第五版)》[1]中，系統(tǒng)性內(nèi)皮病(systemic endotheliopathy,SE)作為創(chuàng)傷性凝血病(traumatic coagulopathy,TC)發(fā)生發(fā)展中的一個階段被正式提出。SE主要相關(guān)因素包括交感腎上腺素激活、炎癥、多糖蛋白復合物脫落、血小板激活與失活、內(nèi)源性肝素化、凝血因子活性降低、纖溶功能異常等[2-3]。

多配體蛋白聚糖家族(Syndecans)是一類廣泛存在于內(nèi)皮和上皮細胞表面的跨膜糖蛋白，已知的四個Syndecan蛋白具有相似的結(jié)構(gòu)，大致都分為胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)[4-5]。Syndecan-1(SDC1)是該家族中的主要成員，當前對于SDC1的研究最為廣泛和深入，最近研究[6-8]顯示肺血管內(nèi)皮損傷在THS后急性肺損傷(acute lung injury,ALI)發(fā)病過程中扮演重要角色，而SDC1是血管內(nèi)皮表面多糖蛋白的核心成分。

白細胞介素-6(IL-6)是創(chuàng)傷/休克后主要的炎癥指標之一，而脫落的SDC1被認為是創(chuàng)傷/休克嚴重程度和預后判斷的重要指標。多項創(chuàng)傷/休克相關(guān)研究[9-11]都顯示創(chuàng)傷或休克后組織和血清中的IL-6與SDC1存在一定的相關(guān)性，但其具體的作用機制尚不清楚，而炎癥和多糖蛋白復合物脫落是SE研究領(lǐng)域重要的構(gòu)成部分，本研究擬探索IL-6基因敲除(knockout,KO)對THS小鼠肺組織SDC1的影響及機制。

材料與方法

1材料

1.1主要試劑與儀器 小鼠SDC1抗體、小鼠基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP9)抗體(美國Novus Biologicals公司)，小鼠磷酸化蛋白激酶B(phospho-AKT,p-AKT)抗體、小鼠AKT抗體、二抗(美國Cell Signaling Technology公司)，小鼠β-actin抗體、小鼠磷酸化核因子-κB(phospho- nuclear factor kappa-B,p-NF-κB)抗體、小鼠NF-κB抗體、CY3試劑、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)試劑、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗原修復液、自發(fā)熒光淬滅劑、4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)、抗熒光淬滅封片劑(武漢賽維爾生物科技有限公司)，正置光學顯微鏡、成像系統(tǒng)(日本尼康公司)，電泳儀(美國Bio-Rad公司)，TRIzol試劑(美國Therrno Fisher公司)，mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國TaKaRa 公司)，SYBR@Green熒光定量試劑(上海生工生物工程股份有限公司)，實時定量PCR 引物(廣州銳博生物技術(shù)有限公司)，實時定量PCR 儀(美國Agilent公司)。

1.2實驗動物 IL-6 KO小鼠由空軍軍醫(yī)大學免疫學教研室惠贈，無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級C57BL/6購自空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心，IL-6 KO小鼠與C57BL/6小鼠回交后，經(jīng)小鼠基因鑒定(PCR擴增法)后最終獲得野生型(wild type,WT)和IL-6 KO小鼠，飼養(yǎng)條件為光照模擬12h/12h晝夜循環(huán)，室溫(24±2)℃，相對濕度40%～80%，自由攝食和飲水，本實驗已由空軍軍醫(yī)大學倫理委員會批準(20190906)。

2方法

2.1實驗分組 取8～12周雄性同窩野生型和IL-6 KO小鼠，體重23～28g，隨機分為正常組與THS組：野生型組(WT組)、基因敲除組(KO組)、野生型創(chuàng)傷失血性休克組(WT THS組)和基因敲除創(chuàng)傷失血性休克組(KO THS組)，各6只。

2.2THS模型制備 取1%戊巴比妥納注射液對小鼠進行腹腔注射 (50mg/kg) ，待小鼠麻醉后將其四肢進行固定，使用止血鉗橫向鉗夾小鼠左側(cè)股骨干中段，致其股骨干骨折，當骨折遠端有明顯的離斷感時，提示骨折制備成功。之后再使用1mL注射器針頭緊貼小鼠劍突下邊緣，針頭以30°的角度斜向前略偏右插入心臟。當觀察到注射器前段有血液流入時，固定注射器位置，緩慢回抽注射器，抽血量按照小鼠總血量的30%進行計算[抽血量(mL)=30%×7.7%×體重(g)][12-13]，整個抽血過程在1min之內(nèi)完成。模型建立2h后，采用頸椎脫臼法處死小鼠進行后續(xù)實驗操作。

2.3HE染色觀察小鼠肺組織病理變化 (1)取右肺組織置于4%多聚甲醛中固定24h；(2)乙醇脫水；(3)制備石蠟切片；(4)石蠟切片脫蠟至水；(5)蘇木素染色；(6)伊紅染色；(7)脫水封片；(8)顯微鏡鏡檢，圖像采集，根據(jù)病變嚴重程度進行半定量分析。

2.4免疫熒光觀察小鼠肺組織SDC1變化 (1)石蠟切片脫蠟至水；(2)抗原修復；(3)組化筆在組織周圍畫圈；(4)血清封閉；(5)加入一抗(SDC1)；(6)加入辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔二抗；(7)加FITC試劑；(8)微波處理；(9)加CY3試劑；(10)自發(fā)熒光淬滅；(11)DAPI復染細胞核；(12)封片；(13)鏡檢拍照，使用Image J軟件進行熒光強度分析。

2.5定量實時熒光聚合酶鏈式反應(yīng)(qRT-PCR)檢測小鼠肺組織mRNA相對表達量變化 取左上肺組織，使用TRIzol提總RNA，定量后取1μg反轉(zhuǎn)錄成cDNA，之后進行qRT-PCR檢測。使用10μL擴增體系，SYBR@Green Master Mix(2×)5μL，上下游引物各0.5μL，ddH20 4μL。擴增程序設(shè)置如下：(1)預變性95℃ 10min；(2)變性95℃ 15s；(3)退火/延伸55℃ 1min，共40個循環(huán)；(4)融解曲線階段采用儀器默認設(shè)置。以β-肌動蛋白(β-actin)作為內(nèi)參，進行目的基因歸一化處理獲得相對表達量。各引物序列如下：(1)β-actin上游引物：5′-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3′,下游引物：5′-GCCGGACTCATCGTACTCC-3′;(2)AKT上游引物：5′-ATGAACGACGTAGCCATTGTG-3′,下游引物：5′-TTGTAGCCAATAAAGGTGCCAT-3′;(3)NF-κB上游引物：5′-TGCGATTCCGCTATAAATGCG-3′,下游引物：5′-ACAAGTTCATGTGGATGAGGC-3′;(4)MMP9上游引物：5′-GCAGAGGCATACTTGTACCG-3′,下游引物：5′-TGATGTTATGATGGTCCCACTTG-3′；(5)SDC1上游引物：5′-AGCAACACCGAGACTGCTTTT-3′,下游引物：5′-GTGCGGATGAGATGTGACAG-3′。

2.6Western blotting檢測小鼠肺組織蛋白相對表達量變化 取左下肺組織，使用RIPA裂解液提總蛋白，蛋白濃度測定和加熱變性后進行上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育抗體[一抗(SDC1為1∶500，MMP9、p-AKT、p-NF-κB和NF-κB為1∶1000，AKT為1∶2000，β-actin為1∶5000)孵育置于4℃冰箱搖床過夜，HRP標記的二抗(1∶5000)室溫震蕩孵育1h、高效化學發(fā)光法(ECL)顯影。

3統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

1HE染色觀察小鼠肺組織病理變化

WT組與KO組肺泡大小形態(tài)均勻，結(jié)構(gòu)清晰，肺泡腔內(nèi)無白細胞浸潤和出血，兩組肺組織病理損傷評分[(0.3±0.5)分vs.(0.5±0.5)分]差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。WT THS組明顯可見較多肺泡壁增厚和肺泡腔狹窄，伴有較多淋巴細胞與中性粒細胞浸潤。KO THS組局部可見部分肺泡壁增厚，肺泡腔狹窄，淋巴細胞與中性粒細胞浸潤，但病變程度較WT THS組減輕[(2.3±0.8)分vs.(3.7±0.5)分]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

2免疫熒光觀察小鼠肺組織SDC1表達變化

WT組與KO組SDC1主要沿肺血管內(nèi)皮和肺泡上皮分布，SDC1表達比較豐富，兩組肺組織SDC1熒光強度[(148.2±3.6)AUvs.(147.8±3.5)AU]差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。WT THS組大部分肺血管內(nèi)皮和肺泡上皮SDC1表達顯著下降。KO THS組肺血管內(nèi)皮和肺泡上皮SDC1熒光強度與WT THS組相比較高[(137.2±3.7)AUvs.(129.8±2.6)AU]，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

3qRT-PCR檢測肺組織mRNA相對表達量變化

WT組與KO組的肺組織AKT、NF-κB、MMP9和SDC1的mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。KO THS組AKT、NF-κB和MMP9的mRNA相對表達量低于WT THS組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。WT THS組與KO THS組SDC1的mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3。

4Western blotting檢測肺組織蛋白相對表達量變化

WT組與KO組的肺組織p-AKT、p-NF-κB、MMP9和SDC1的蛋白相對表達量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。KO THS組p-AKT、p-NF-κB和MMP9的蛋白相對表達量低于WT THS組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。KO THS組SDC1的蛋白相對表達量高于WT THS組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4。

WT：野生型；KO：基因敲除；THS：創(chuàng)傷失血性休克

WT：野生型；KO：基因敲除；THS：創(chuàng)傷失血性休克

AKT：蛋白激酶B；NF-κB：核因子-κB；MMP9：基質(zhì)金屬蛋白酶-9；SDC1：Syndecan-1；WT：野生型；KO：基因敲除；THS：創(chuàng)傷失血性休克;ns：差異無統(tǒng)計學意義;ns：P>0.05，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001，****：P<0.0001

p-AKT：磷酸化蛋白激酶B；AKT：蛋白激酶B；p-NF-κB：磷酸化核因子-κB；NF-κB：核因子-κB；MMP9：基質(zhì)金屬蛋白酶-9；β-actin：β-肌動蛋白；SDC1：Syndecan-1；WT：野生型；KO：基因敲除；THS：創(chuàng)傷失血性休克；ns：差異無統(tǒng)計學意義，KD：千道爾頓；ns：P>0.05，*：P<0.05，**：P<0.01，***：P<0.001，****：P<0.0001

討 論

嚴重創(chuàng)傷失血后會引發(fā)SE，持續(xù)發(fā)展則會進展成為TC，TC是指多因素參與的系統(tǒng)性凝血功能障礙，凝血功能檢測可表現(xiàn)為高凝、低凝和纖溶亢進等不同狀態(tài)，約1/3非控制性出血的創(chuàng)傷患者在入院時會并發(fā)凝血病，其多器官衰竭發(fā)生率和病死率明顯增高，而阻斷SE向TC進一步發(fā)展成為創(chuàng)傷領(lǐng)域最新研究的熱點[14-16]。

肺是THS較早和較易累及的器官之一，相關(guān)研究[12]顯示，失血性休克小鼠的失血量達到30%并持續(xù)2h就會造成小鼠肺組織的明顯損傷，在此條件下小鼠的病死率約為10%，筆者團隊研究也發(fā)現(xiàn)，隨著失血量升高和創(chuàng)傷因素加入，THS小鼠的病死率會顯著上升，而采用30%失血量并持續(xù)2h建立THS小鼠模型既有利于觀察小鼠的肺組織損傷情況，也有利于控制THS小鼠的總體病死率完成后續(xù)實驗操作。本研究顯示THS小鼠模型建立后，HE染色肺組織可見肺泡壁增厚和肺泡腔狹窄，伴有淋巴細胞與中性粒細胞浸潤，KO THS組肺泡壁增厚，肺泡腔狹窄，淋巴細胞與中性粒細胞浸潤的病變程度比WT THS組明顯減輕，提示IL-6 KO有助于緩解小鼠THS后的ALI。

既往研究[17-19]顯示SDC1在ALI中發(fā)揮重要作用并可以作為ALI的損傷標志物，SDC1胞內(nèi)區(qū)序列高度保守，人、大鼠和小鼠等種屬此段序列都相同，胞外區(qū)連接糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，包括3條硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)側(cè)鏈和2條硫酸軟骨素(chondroitin sulfate,CS)側(cè)鏈[20-21]。通過限制蛋白和可溶性物質(zhì)通過細胞連接縫隙，調(diào)節(jié)內(nèi)皮表面白細胞和血小板與細胞黏附分子的相互作用，依托HS側(cè)鏈調(diào)節(jié)局部細胞表面的凝血功能，SDC1對于維持血管的完整性和滲透性方面具有重要意義[22- 23]。本研究顯示THS小鼠模型建立后，肺血管內(nèi)皮和肺泡上皮SDC1表達明顯下降，KO THS組肺血管內(nèi)皮和肺泡上皮SDC1表達比WT THS組較高，各組免疫熒光顯示肺組織SDC1表達與HE染色顯示肺組織損傷嚴重程度呈負相關(guān)，提示SDC1可以作為小鼠THS后ALI的損傷標志物，這與既往研究保持一致。

有研究[24-25]提示在ALI過程中，IL-6可以通過AKT/NF-κB信號通路對MMP產(chǎn)生影響，本研究中qRT-PCR結(jié)果顯示THS所引起的ALI會導致AKT、NF-κB和MMP9的mRNA相對表達量上升，而KO THS組與WT THS組相比，AKT、NF-κB和MMP9的mRNA相對表達量較低，表明IL-6 KO可以下調(diào)AKT、NF-κB和MMP9的mRNA表達；本研究中Western blotting檢測結(jié)果顯示THS所引起的ALI會導致p-AKT、p-NF-κB和MMP9的蛋白相對表達量上升，而KO THS組與WT THS組相比p-AKT、p-NF-κB和MMP9的蛋白相對表達量較低，表明IL-6 KO可以下調(diào)AKT和NF-κB的蛋白磷酸化和下調(diào)MMP9的蛋白表達。

在SDC1靠近跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)域有一個蛋白水解酶作用的部位，用于從細胞表面釋放SDC1分子的胞外區(qū)，已知有多種MMP都可以作用此位點[26- 27]。本研究Western blotting檢測結(jié)果顯示THS所引起的ALI會導致SDC1蛋白相對表達量下降，KO THS組與WT THS組相比SDC1蛋白相對表達量較高，與免疫熒光顯示SDC1表達情況一致，而qRT-PCR檢測則顯示THS所引起的ALI會導致SDC1的mRNA相對表達量上升，KO THS組與WT THS組SDC1的mRNA相對表達量差異無統(tǒng)計學意義，表明IL-6 KO通過下調(diào)MMP9，可以在蛋白水平減少其對于SDC1的切割，從而減輕SDC1蛋白的脫落，而對于SDC1的mRNA水平則無明顯影響。

綜上所述，在小鼠THS模型中，IL-6 KO可抑制AKT/NF-κB信號通路激活，下調(diào)MMP9，減少SDC1蛋白的脫落，進而減輕ALI損傷程度，而炎癥和多糖蛋白復合物脫落在SE和TC發(fā)生發(fā)展過程中的彼此作用和相互影響值得進一步探索和發(fā)現(xiàn)。

作者貢獻聲明：范穎楠：研究設(shè)計、數(shù)據(jù)收集整理、論文撰寫；馮筑生：數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析、論文撰寫；于超平、謝建剛：數(shù)據(jù)收集整理；王倩梅：論文修改；劉善收：經(jīng)費支持；尹文：論文審定、經(jīng)費支持