三種物理因素處理對青海野生唐古特大黃種子萌發(fā)的影響

劉力寬，袁偉博，張俊焱，馬 慧，石永梅，曾 陽,李錦萍*

(1.青海師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,青海 西寧 810016；2.青海省青藏高原藥用動(dòng)植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016；3.青海省人民政府—北京師范大學(xué) 高原科學(xué)與可持續(xù)發(fā)展研究院，青海 西寧 810016)

唐古特大黃(RheumtanguticumMaxim.ex.Balf)，又名：雞爪大黃，多年生高大草本，與掌葉大黃極相似，主要區(qū)別為：葉片深裂，裂片常呈三角狀披針形或狹線形，裂片窄長[1，2].大黃喜光照、耐寒，不宜在溫度較高或潮濕的地方生長，野生資源非常有限，我國大黃大多分布在西北及西南海拔3000m左右的高寒山地，主要分布于甘肅、青海、西藏、云南等高海拔地區(qū)[2，3].藥典記載大黃具有瀉下攻積，逐瘀通經(jīng)，涼血解毒，清熱瀉火，利濕退黃等功效[4].近年來，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，人們對中醫(yī)藥健康保健的逐漸認(rèn)可，唐古特大黃作為重要中藥材之一，需求量逐年增加.野生大黃過度采挖，致使野生唐古特大黃資源大幅度減少，因此對唐古特大黃進(jìn)行種質(zhì)資源研究、野生撫育、人工馴化栽培迫在眉睫[5].目前對唐古特大黃的研究主要集中在化學(xué)成分，藥理藥效等方面，對于高海拔唐古特種子的萌發(fā)研究較少，且物理方法研究種子的萌發(fā)具有簡便快捷、易操作等特點(diǎn)，因此本文采用三種不同的物理方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

超聲波是頻率高于20kHz的聲波，有良好的方向性，穿透性好.有研究證實(shí)，超聲波具有動(dòng)能，可有效刺激種子，提高發(fā)芽率和發(fā)芽勢，促進(jìn)生長[6，7].其原因可能是因?yàn)?，適量的超聲處理后，細(xì)胞膜通透性改變，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)外物質(zhì)的交換從而促進(jìn)種子的萌發(fā)，在提高轉(zhuǎn)基因、促進(jìn)種子萌發(fā)等領(lǐng)域取得了廣泛的應(yīng)用和發(fā)展[8].在種子萌發(fā)過程中，適宜的溫度是必要的，溫度不僅會(huì)影響種子中酶的活性，還會(huì)影響種子內(nèi)部物質(zhì)的運(yùn)輸、水分吸收和氣體交換[9，10].目前不同溫度處理在種子萌發(fā)過程中仍是最常用的物理方法之一[11].種子成熟后往往會(huì)進(jìn)入休眠期，等待環(huán)境適宜才開始萌發(fā)，溫度對于種子而言是一個(gè)非常重要的環(huán)境因子，種子通過感知高溫，低溫或變溫來判斷季節(jié)的變化及微環(huán)境的差異，選擇合適的時(shí)機(jī)開始植物的生活史[12].

目前，通過超聲、溫度等物理因素對青海高海拔唐古特大黃種子萌發(fā)的影響還鮮有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)以青海高海拔野生唐古特大黃種子為材料，探究超聲波、溫水浸泡和溫度三種不同物理處理方法對青海高海拔唐古特大黃種子萌發(fā)及活力的影響，從而擬選出最佳萌發(fā)條件，為青海高海拔唐古特大黃的人工栽培和規(guī)范化種植提供科學(xué)的理論依據(jù).

1 材料與試劑

唐古特大黃種子，于2016年7月24-30日采集于黃南州河南縣老政府(34°44′3″N，101°37′59″E，海拔3462m)、果洛達(dá)日滿掌鄉(xiāng)(33°17′18″N，100°26′8″E，海拔4417m)和黃南州同仁縣麥秀林場(35°21′51″N，101°56′20″E，海拔3424m)，樣品由青海師范大學(xué)李錦萍教授鑒定為唐古特大黃(RheumtanguticumMaxim.ex.Balf).

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 種子的前處理

分別挑選唐古特大黃種子中籽粒飽滿，大小均一、無病蟲害的種子，用蒸餾水漂洗干凈，除去其中的雜質(zhì)，清水常溫浸泡24h，使種子充分吸水后待用.

2.2 超聲波處理

為探究不同超聲時(shí)間處理對種子萌發(fā)的影響，結(jié)合前人對超聲時(shí)長的研究，本研究設(shè)置六組實(shí)驗(yàn)，每組20粒種子，超聲時(shí)長分別為10、20、30、40、50min，以不作任何處理為對照組.超聲波處理時(shí)，用三層紗布包裹種子，然后放入超聲波發(fā)生器進(jìn)行處理，溫度波動(dòng)控制在3℃以內(nèi)，每組重復(fù)3次.最后將處理好的大黃種子放在鋪有三層濾紙的培養(yǎng)皿中并加入適量的蒸餾水于室溫下進(jìn)行培養(yǎng)，逐日觀察種子發(fā)芽情況，第五天開始記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算發(fā)芽勢，第12天測定種子的發(fā)芽率和平均芽長，計(jì)算種子簡化活力指數(shù)(G·S).

2.3 熱水浸種處理

為探究不同浸種溫度處理對種子萌發(fā)的影響，結(jié)合前人對浸種溫度的研究，本研究設(shè)置六組實(shí)驗(yàn)，每組20粒種子，分別采用20、30、40、50、60℃蒸餾水浸種2小時(shí)，自然降至室溫后倒去取出，以0℃為對照組.培養(yǎng)方法同2.2.

2.4 不同溫度處理

為探究不同溫度條件下種子萌發(fā)的差異，依據(jù)先前學(xué)者的研究，本研究在溫度梯度為15、20、25、30、35、40℃的光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行24h的恒溫培養(yǎng).將最接近室溫的20℃作為對照組.培養(yǎng)方法同2.2.

2.5 萌發(fā)指數(shù)的計(jì)算

發(fā)芽率：在規(guī)定的條件和時(shí)間內(nèi)長成的正常幼苗數(shù)占供檢種子數(shù)的百分率.發(fā)芽率高說明活種子多，發(fā)芽率低說明活種子少.

發(fā)芽率(%)=(發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100

發(fā)芽勢：最初六日內(nèi)的發(fā)芽率.發(fā)芽勢的大小表明發(fā)芽速度的快慢，也表明種子活力的強(qiáng)弱.

發(fā)芽勢(%)=(規(guī)定日期內(nèi)種子發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù))×100

活力簡化指數(shù)：種苗生長量與發(fā)芽率的乘積.對于萌發(fā)迅速、萌發(fā)期短的種子，簡化活力指數(shù)是活力指數(shù)的簡化表達(dá)公式.

簡化活力指數(shù)(G.S)=種苗生長量×發(fā)芽率

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

使用SPSS25.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用軟件繪制三線表和折線圖.組間內(nèi)的比較采用的是單因素方差分析法.

3 結(jié)果與分析

3.1 不同時(shí)間超聲波處理對唐古特大黃種子萌發(fā)影響

以不作任何處理為對照組，以不同超聲時(shí)間處理三個(gè)地區(qū)的唐古特大黃種子.隨著處理時(shí)間的增加，種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢和活力指數(shù)總體呈先上升后下降的趨勢(圖1).通過與0min進(jìn)行對比發(fā)現(xiàn)，10、20、30、40、50min處理對各個(gè)地方唐古特大黃種子的萌發(fā)起一定的促進(jìn)作用.其中，超聲波處理時(shí)間為30min時(shí)，種子的萌發(fā)勢、萌發(fā)率和活力簡化指數(shù)均達(dá)到最高，且超聲處理30min時(shí)種子的發(fā)芽率與活力簡化指數(shù)，相較于其他處理時(shí)間顯著性差異.

圖1 超聲波處理對唐古特大黃種子萌發(fā)的影響

3.2 不同浸種溫度對唐古特大黃種子萌發(fā)的影響

以不作任何處理為對照組，以不同溫度熱水浸種處理三個(gè)地區(qū)的唐古特大黃種子.與不做任何處理的0℃進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)隨著浸種溫度的升高，種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、活力指數(shù)整體呈先增加后減小的趨勢(圖2).當(dāng)溫度設(shè)為20℃時(shí)，唐古特大黃種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和活力簡化指數(shù)均高于對照組，但效果不明顯.當(dāng)溫度高于30℃時(shí)，種子發(fā)芽率和活力簡化指數(shù)均低于對照組，而當(dāng)溫度高于60℃時(shí)種子被燙傷導(dǎo)致不能萌發(fā).

圖2 熱水浸種處理對唐古特大黃種子萌發(fā)的影響

3.3 不同溫度處理對唐古特大黃種子萌發(fā)影響

溫度的變化對唐古特大黃種子的萌發(fā)也有一定的影響.由表一可知.隨溫度的增加，種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、活力指數(shù)整體呈先增加后減小的趨勢.溫度范圍在20～30℃之間，不同采樣地點(diǎn)的唐古特大黃種子的萌發(fā)能力均較其他溫度處理下的強(qiáng).尤其25℃時(shí)種子的萌發(fā)指數(shù)與對照組差異顯著(P<0.05)(表1).

表1 溫度對唐古特大黃種子萌發(fā)的影響

4 討論

唐古特大黃為中藥配伍中的“將軍”，以其特有的功效聞名于世，為青海省大宗道地藥材之一.目前唐古特大黃也作為保健品進(jìn)行了開發(fā)，隨著進(jìn)一步深入研究，其更大價(jià)值也會(huì)得到發(fā)掘.種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、簡化活力指數(shù)等是衡量種子質(zhì)量的最重要、最關(guān)鍵的指標(biāo)，發(fā)芽勢、發(fā)芽率、簡化活力指數(shù)高就說明其種子的發(fā)芽速度快、發(fā)芽能力強(qiáng)、以及出苗整齊[13].藥用植物種子和種苗的生產(chǎn)是中藥材生產(chǎn)的關(guān)鍵，是提高中藥產(chǎn)量、品質(zhì)高效的前提和基礎(chǔ)，是推動(dòng)中藥農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要保障[14].所以，唐古特大黃種子萌發(fā)條件的研究對大黃的規(guī)范化種植生產(chǎn)有著十分重要的意義.

超聲波是物理處理種子和幼苗方法中的一種，兼有物理方法的特點(diǎn)，近年來在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面應(yīng)用較多[15].許多研究發(fā)現(xiàn)使用超聲波處理種子可提高種子的發(fā)芽率[16].本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)三個(gè)不同采樣地點(diǎn)的唐古特大黃種子，在超聲時(shí)間范圍10～50min內(nèi)均對種子的萌發(fā)有效果不一的促進(jìn)作用.超聲處理過的種子比對照組提前1～2天發(fā)芽，其中三個(gè)不同采樣地點(diǎn)的唐古特大黃種子均在超聲波處理30min時(shí)，萌發(fā)能力最佳.這與楊君麗[17]等的研究結(jié)果基本一致.有研究發(fā)現(xiàn)，超聲波可以促進(jìn)植物的種子萌發(fā)，但隨著超聲波處理時(shí)間的不斷增加，發(fā)芽率、發(fā)芽勢等指標(biāo)逐漸下降，這可能是因?yàn)槌^植物的承受范圍，細(xì)胞膜和各種代謝受到干擾，進(jìn)而逐漸引起胚的死亡[18-20].因此當(dāng)本研究超聲時(shí)間處理超30min時(shí)，種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和活力簡化指數(shù)呈下降趨勢.浸種處理作為提高種子萌發(fā)的有效措施，合適的浸種溫度能夠打破種子休眠，軟化種皮，促進(jìn)種子吸水，從而促進(jìn)種子的萌發(fā)[21，22].本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)浸種水溫為20℃時(shí)，對唐古特大黃種子的萌發(fā)有促進(jìn)作用，但效果不明顯，而水溫高于30℃時(shí)，種子發(fā)芽率降至一半以下，當(dāng)水溫高于60℃時(shí)種子被燙傷而導(dǎo)致不能萌發(fā).同時(shí)蘇曉敏[23]等研究發(fā)現(xiàn)適宜溫度有助于種子萌發(fā)，但浸種溫度過低時(shí)可能無法破除硬實(shí)，而較高的水溫浸泡會(huì)傷害種胚，造成部分種子死亡，從而導(dǎo)致種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)的下降.任何種子的萌發(fā)都需要一定的溫度條件，適宜的溫度可以促進(jìn)種子發(fā)芽內(nèi)部所進(jìn)行的一系列酶促反應(yīng)，過高或過低的溫度都不利于種子的萌發(fā)[24].本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對于唐古特大黃種子，當(dāng)在20～30℃的條件下培養(yǎng)種子，均對種子的萌發(fā)有一定的促進(jìn)作用，其中25℃時(shí)，唐古特大黃種子的萌發(fā)能力最強(qiáng).而在溫度低于20℃及高于30℃的范圍內(nèi)，反而不利于種子的萌發(fā).有研究發(fā)現(xiàn)，溫度過低會(huì)影響酶的活性和種子的吸水能力，而溫度過高會(huì)破壞種子內(nèi)酶的結(jié)構(gòu)，同樣會(huì)影響種子的萌發(fā)[25].

本研究通過實(shí)驗(yàn)選出對青海高海拔野生唐古特大黃種子萌發(fā)有促進(jìn)作用的三種物理因素，即超聲波30min處理，熱水20℃浸種處理，溫度25℃處理，以期為人工栽培唐古特大黃提供一定的理論科學(xué)依據(jù).