智能響應(yīng)性改性氧化石墨烯納米粒子的制備與性能表征

◎張偉麗

(商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院交通學(xué)院,河南 商丘 476100）

目前，化療藥物多種多樣，但由于細(xì)胞的多藥耐藥性導(dǎo)致療效低下，通常需要注射大量藥物，在治療癌癥的同時(shí)，伴隨著強(qiáng)烈的毒副作用。為了減少藥物在輸送過程中的滲漏，降低其毒副作用，各種形態(tài)與功能的納米載體層出不窮，其中聚合物載藥系統(tǒng)的包封穩(wěn)定性好、尺寸可控、易于功能化，能較好地實(shí)現(xiàn)藥物的輸送與控釋，尤其是納米級(jí)的載體材料，其尺寸小，血管的滲透保留效應(yīng)（EPR）高，能有效降低藥物的毒副作用[1]。但由于許多納米載體無法被生物降解，導(dǎo)致其穿過膠原基質(zhì)進(jìn)入腫瘤血管中、到達(dá)腫瘤深處的藥量不足，療效不理想。此外，許多納米載體雖包封效果好，能有效減少藥物的外滲，但進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后，藥物的釋放能力差，在所需的治療濃度下，細(xì)胞內(nèi)藥物積累有限，導(dǎo)致抗腫瘤效果不佳。因此，需要設(shè)計(jì)一種智能響應(yīng)性納米載體，在腫瘤的病理環(huán)境刺激（高溫、酸性）或外源刺激（溫度、電場/磁場、光）下，展現(xiàn)智能響應(yīng)性行為，實(shí)現(xiàn)靶向給藥。

光熱療法是一種無創(chuàng)的癌癥治療手段，當(dāng)含有光熱劑的納米載體進(jìn)入腫瘤細(xì)胞時(shí)，通過局部光照射，光熱劑將通過光熱轉(zhuǎn)換，提高腫瘤細(xì)胞局部溫度，從而殺滅細(xì)胞[2]。這種方式可增加抗癌藥物的靶向特異性，降低其毒副作用。在眾多的光熱劑中，金的光熱轉(zhuǎn)換能力強(qiáng)，用途最廣，因此，許多科研工作者致力于研究不同形態(tài)[3]的金納米載體。如今，石墨烯，一種具有多環(huán)芳烴表面結(jié)構(gòu)的二維碳納米材料，也可將近紅外光的能量高效轉(zhuǎn)換為熱能。作為一種良好的光熱劑，石墨烯在抗菌與抗癌領(lǐng)域中都具有廣闊的應(yīng)用前景[4]。作為石墨烯的衍生物，氧化石墨烯制備成本低，在大規(guī)模應(yīng)用中更具潛力。同時(shí)，氧化石墨烯由石墨烯經(jīng)部分氧化制得，極性較強(qiáng)，可通過靜電相互作用提高對(duì)某些抗癌藥物的裝載能力，且GO 攜帶-COOH，在藥物控釋過程中將對(duì)酸性環(huán)境產(chǎn)生響應(yīng)，加速藥物的釋放。然而，作為一種無機(jī)材料，GO 膠體穩(wěn)定性較差，在靜脈注射時(shí)容易團(tuán)聚[5]。純GO 與某些藥物間的作用過強(qiáng)也會(huì)降低藥物的釋放率[6]。因此，可利用親水性納米凝膠修飾GO，這種方式不僅可改善其膠體穩(wěn)定性，納米凝膠柔韌的結(jié)構(gòu)也可快速對(duì)外界刺激產(chǎn)生響應(yīng)[7]。此外，納米凝膠的結(jié)構(gòu)與軟組織/細(xì)胞相似，其組織穿透性及細(xì)胞攝取率將優(yōu)于其他載體材料[8]。

在還原性交聯(lián)劑BAC、乳化劑十二烷基硫酸鈉（SDS）及引發(fā)劑過硫酸鉀（KPS）與促進(jìn)劑NaHSO3的存在下，通過原位聚合法，將GO 包裹于溫敏性聚合物PNIPAM 的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中，制備了生理穩(wěn)定性強(qiáng)、光熱效應(yīng)顯著的GO@PNIPAM NPs，并分別在不同溫度下（25～45℃）、不同酸堿度（pH=7.4、6.5 或 5.0）、808nm近紅外光（NIR） 照射的條件下監(jiān)測了GO@PNIPAM NPs 在模擬腫瘤細(xì)胞微環(huán)境中的智能響應(yīng)性行為，為開發(fā)生理穩(wěn)定性強(qiáng)、低毒、高效的氧化石墨烯納米載體提供了一種簡單有效的方法（圖 1）。

圖1 GO@PNIPAM NPs 合成示意圖

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

N–異丙基丙烯酰胺（NIPAM，A.R.級(jí)），東京化工有限公司；N,N’–雙（丙烯酰）胱胺（BAC，純度 98%）與二甲亞砜（DMSO，A.R.級(jí)），Sigma 公司；氧化石墨烯（GO，純度98%），蘇州恒球科技公司；十二烷基硫酸鈉（SDS，C.R.級(jí)）、過硫酸鉀（KPS）、亞硫酸氫鈉（NaHSO3，純度 98%），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；谷胱甘肽（GSH，B.R.級(jí)），Amresco 公司。NIPAM 以正己烷為溶劑進(jìn)行重結(jié)晶。KPS 以蒸餾水為溶劑進(jìn)行室溫下重結(jié)晶處理。除此之外，其他試劑均可直接使用，無須進(jìn)一步純化。

傅里葉變換紅外光譜儀（FTIR，Spectrum one 型）、熱失重分析儀（TGA，TG-DTA 型），美國Perkin-Elmer 公司；激光粒度分析儀（ZS90 型），英國Malvern 公司；場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM，JSM7100F 型），日本電子株式會(huì)社；波長808nm 的近紅外激光器，北京華源拓達(dá)激光技術(shù)有限公司；熱成像儀，美國Apresys 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 PNIPAM NPs、GO@PNIPAM NPs 的合成

納米粒子制備：將3.26mL 0.5mg/mL 的GO水 溶 液 、0.0648mmol/L NIPAM、0.0016mmol/L BAC 及 0.0073mmol/L SDS 溶于 50mL 超純水中，置于單口燒瓶中攪拌并加熱，至溶質(zhì)完全分散，向其中通入氮?dú)猓瑫r(shí)持續(xù)攪拌、加熱，當(dāng)升溫至60℃時(shí)，加入0.0200mmol/L KPS 及0.0259 mmol/L NaHSO3，并于60℃下持續(xù)攪拌6h；產(chǎn)物純化：將產(chǎn)物置于透析袋（分子量為8,000-12,000Da）中，并在室溫下于超純水中透析三天，除去未反應(yīng)完的化學(xué)物質(zhì)；凍干保存：將得到的GO@PNIPAM NPs 冷凍干燥，以備后續(xù)研究使用。不加入GO，采用上述方法，制備PNIPAM NPs。

1.2.2 光熱轉(zhuǎn)換評(píng)價(jià)

采用808nm、2W/cm2的近紅外激光器與熱成像儀測試樣品的光熱轉(zhuǎn)換能力。將1mL 250μg/mL的 GO、PNIPAM NPs 與 GO@PNIPAM NPs 的水溶液分別置于離心管中（1mL 水為對(duì)照組），對(duì)不同樣品均光照7min，并由熱成像儀監(jiān)測樣品溫度，繪制樣品溫度隨照射時(shí)間的變化曲線。

2 結(jié)果與討論

2.1 GO@PNIPAM NPs 的合成與表征

為提高含GO 材料的膠體穩(wěn)定性，通過簡單一鍋法，在混合NIPAM 與GO 溶液時(shí)，單體NIPAM 插層入少量堆疊的GO 片層中，在交聯(lián)劑與引發(fā)體系的存在下進(jìn)行原位聚合、交聯(lián)，促使GO 堆疊的片層剝離，形成二維納米片，包裹在PNIPAM 基質(zhì)中，最終制得球狀GO@PNIPAM NPs，制備過程見圖 1。圖 2 給出了 GO、GO@PNIPAM NPs 及 PNIPAM NPs 的傅里葉變換紅外光譜圖。在GO@PNIPAM NPs 的光譜圖中，1546 cm-1與 1384 cm-1處出現(xiàn)了 NIPAM 的氨基的伸縮振動(dòng)特征峰。紅外光譜結(jié)果表明成功合成了GO@PNIPAM NPs。同時(shí)，如圖3 所示，通過熱失重分析（TGA），得到了納米材料中GO 的含量為0.073%。

圖2 GO、GO@PNIPAM NPs 及 PNIPAM NPs 的傅里葉變換紅外光譜圖

圖3 GO、GO@PNIPAM NPs 及 PNIPAM NPs 的熱失重曲線圖

為驗(yàn)證“合成過程中GO 堆疊的片層被剝離”這一假設(shè)，使用SEM 表征了GO@PNIPAM NPs 的結(jié)構(gòu)和形態(tài)。如圖5 所示，通過原位聚合后，納米粒子呈現(xiàn)均勻分散的球狀，且SEM 圖片中無明顯的GO 層狀結(jié)構(gòu)，SEM 顯示的結(jié)果與一些同行論文中的圖片契合[9]。樣品經(jīng)GSH 處理10min 后，如圖5 所示，納米粒子堆疊在一起并被雪紡狀物質(zhì)包裹。相比原GO（圖4），釋放出的GO 片層更薄、尺寸更?。▓D 6）。最初，GO 納米片位于GO@PNIPAM NPs 內(nèi)。在還原劑（GSH）的作用下，納米粒子降解，釋放出已被剝離的GO。

圖4 37℃下，GO 水溶液（0.5mg/ml）的 SEM 圖像

圖5 37 ℃下，溶于超純水中的GO@PNIPAM NPs 的SEM 圖像

圖6 37 ℃下，用 5 mM GSH 處理 10 分鐘后GO@PNIPAM NPs 的 SEM 圖像

2.2 GO@PNIPAM NPs 的智能響應(yīng)行為

為探究GO@PNIPAM NPs 在腫瘤細(xì)胞微環(huán)境（高溫、酸性）及近紅外光照下的智能響應(yīng)行為，探索其在癌癥治療領(lǐng)域中的應(yīng)用潛能，進(jìn)行了不同環(huán)境下的體外性能測試。圖7 給出了相同濃度 GO、PNIPAM NPs 及 GO@PNIPAM NPs 的水溶液在不同溫度下的水力半徑，從圖中可看出，溫度變化時(shí)GO 的水力半徑也發(fā)生無規(guī)律的變化，而 PNIPAM NPs 與 GO@PNIPAM NPs 的水力半徑則隨著溫度的升高而降低，說明通過原位聚合得到的目標(biāo)產(chǎn)物GO@PNIPAM NPs 已具備了PNIPAM NPs 的溫度響應(yīng)性。此外，將GO@PNIPAM NPs 溶于不同 pH 的生理緩沖（PBS）溶液中，測其Zeta 電位，結(jié)果如圖8 所示。在中性環(huán)境中 （pH=7.4），GO@PNIPAM NPs 的Zeta 電 位 為 -28 mV， 在 酸 性 環(huán) 境 中 ，GO@PNIPAM NPs 的Zeta 電位增大，且酸性越強(qiáng)，Zeta 電位越大，當(dāng)粒子處于腫瘤細(xì)胞的酸性微環(huán)境（pH=5.0）中時(shí)，其Zeta 電位最大，達(dá)到-8 mV，說明 GO@PNIPAM NPs 具備 pH 響應(yīng)性，它在中性環(huán)境中的低電位使其可通過靜電相互作用負(fù)載帶正電的抗癌藥物（如鹽酸阿霉素），在酸性環(huán)境中的較高電位又將降低其與藥物之間的作用力，使藥物到腫瘤細(xì)胞后加速釋放，GO@PNIPAM NPs 在高溫與酸性環(huán)境下的智能響應(yīng)行為切合腫瘤細(xì)胞的微環(huán)境，展現(xiàn)出其在藥物靶向遞送中的較大潛能。

圖7 不同溫度下，0.5mg/mL 的GO、PNIPAM NPs 及GO@PNIPAM NPs 溶液的水力半徑圖

圖8 37 ℃，不同 pH 下 0.5 mg/mL GO、PNIPAM NPs及GO@PNIPAM NPs 的水PBS 溶液的Zeta 電位圖

除溫度與pH 響應(yīng)性外，GO@PNIPAM NPs也具備近紅外光響應(yīng)性。為探究GO@PNIPAM NPs 的光刺激響應(yīng)性及其在光熱療法中的潛力，將GO@PNIPAM NPs 的水溶液（GO 的濃度為250μg/mL）在波長 808nm、功率密度 2W/cm2的近紅外激光下照射7min。樣品溫度的變化由熱像儀在實(shí)驗(yàn)期間測定并成像。如圖9 所示，在光熱轉(zhuǎn)換實(shí)驗(yàn)過程中，GO@PNIPAM NPs 水溶液的溫度升高了近50℃，而在相同的激光照射條件下，對(duì)照組超純水的溫度僅升高了2℃左右，GO水溶液的溫度也僅上升了35℃左右。同時(shí)，隨著GO 含量的增大，相同近紅外光照射時(shí)，GO@PNIPAM NPs 水溶液的溫度上升越快，說明GO@PNIPAM NPs 具有顯著的光熱效應(yīng)（圖10）。此外，如圖7 所示，GO@PNIPAM NPs 具備溫度響應(yīng)性，因此，在近紅外激光照射下，GO@PNIPAM NPs 將進(jìn)行光熱轉(zhuǎn)化，使環(huán)境溫度提高，既發(fā)揮熱療作用，也使材料的溫度響應(yīng)性更加明顯，光熱效應(yīng)可通過遠(yuǎn)程操作，更易控制。

圖9 GO 濃度為 250 μg/mL 的 GO、GO@PNIPAM NPs及PNIPAM NPs 水溶液的光熱轉(zhuǎn)換曲線圖

圖10 不同 GO 濃度（2.5 ～ 200 μg/mL）的GO@PNIPAM NPs 水溶液的光熱轉(zhuǎn)換效率圖

3 結(jié)語

通過單體插層和原位乳液聚合制備了一種具有光熱效應(yīng)、生物相容性好的新型溫度/pH/光熱多重響應(yīng)的納米藥物載體GO@PNIPAM NPs。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：37℃、pH=7.4 下，GO@PNIPAM NPs 的尺寸在 73nm 左右，Zeta 電位為 28.1 mV。GO@PNIPAM NPs 呈規(guī)則球形，且還原環(huán)境中可降解。體外性能測試結(jié)果表明GO@PNIPAM NPs的水力半徑隨環(huán)境溫度的升高而減小、Zeta 電位隨環(huán)境酸性增強(qiáng)而增大，在模擬腫瘤的微環(huán)境中展現(xiàn)出迅速的智能響應(yīng)性行為。同時(shí)在808nm、2W/cm2的近紅外激光刺激下，GO@PNIPAM NPs的光熱轉(zhuǎn)換能力強(qiáng)、光熱轉(zhuǎn)換效率高，展現(xiàn)出其在藥物靶向遞送及光熱療法中的應(yīng)用潛能。