敲減miR-145增強(qiáng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對大鼠盆底功能障礙的修復(fù)作用

張小燕，陳 慧，陳 婧，耿月華

(中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇九醫(yī)院a.婦產(chǎn)科； b.病理科，福建 漳州 363000)

盆底功能障礙性疾病(pelvic floor dysfunction，PFD)是一種嚴(yán)重影響女性生活質(zhì)量的常見病及多發(fā)病，尤其常見于中老年女性，主要表現(xiàn)為壓力性尿失禁(stress urinary inconti-nence，SUI)和盆底器官脫垂(pelvic organ prolapse，POP)，給患者帶來巨大的精神壓力和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，已引起盆底醫(yī)學(xué)研究者的廣泛關(guān)注。隨著社會進(jìn)入老齡化時期，PFD患者越來越多，SUI及POP分別影響著15%～17%和3%～ 6%的成年女性[1]。PFD的發(fā)生與盆底支持組織結(jié)構(gòu)的破壞或缺陷有關(guān)[2-3]。盆底支持組織主要是含有細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的膠原蛋白及彈性蛋白等纖維蛋白，而這些蛋白的缺乏可能導(dǎo)致PFD[4-5]。目前臨床上對于癥狀嚴(yán)重的PFD患者主要以手術(shù)恢復(fù)其解剖學(xué)位置為主，但術(shù)后并發(fā)癥多，復(fù)發(fā)率高[6]。因此，有必要開發(fā)一種新的盆底支持結(jié)構(gòu)用于PFD的治療，實(shí)現(xiàn)其在分子水平及組織生理功能上的重建，并維持盆底支持結(jié)構(gòu)的微環(huán)境平衡。

干細(xì)胞具有多向分化的能力，能夠參與組織修復(fù)，有可能分化為多種細(xì)胞類型的支持組織，因此在PFD治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchyma stem cell，BMSC)是最具特征性的干細(xì)胞來源之一，具有很強(qiáng)的分化能力，并分泌有利于組織修復(fù)的生物活性因子；同時BMSC也是最早應(yīng)用于盆底功能修復(fù)的間充質(zhì)干細(xì)胞類型[7]。在SUI動物模型中，注射BMSC能修復(fù)受損的外尿道括約肌，并顯著減輕SUI癥狀[8-9]。此外，miRNA在BMSC分化過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。有研究[10]表明敲減miR-145表達(dá)可增強(qiáng)皮膚成纖維細(xì)胞重編程及誘導(dǎo)其分化為多能干細(xì)胞的能力?；贐MSC的細(xì)胞治療，也是盆底醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，BMSC是一種很有臨床應(yīng)用前景的治療策略，有可能成為徹底改變POP和SUI的治療方法[11-13]。因此，本研究旨在觀察干預(yù)BMSC中miR-145的表達(dá)是否能協(xié)同增強(qiáng)BMSC對PFD的骨盆支持組織缺損的修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物

35只SPF級6月齡雌性SD大鼠購自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動物有限公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK(滬)2018-0004；本研究的所有動物獲得中國人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇九醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)，且所有實(shí)驗(yàn)步驟均符合動物實(shí)驗(yàn)“3R”指南。

1.1.2 主要試劑與儀器

IMDM培養(yǎng)基(美國HyClone公司)；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(美國Gibco公司)；1%鏈霉素/青霉素雙抗溶液(美國Sigma-Aldrich公司)；曲拉通(Triton X-100)試劑和牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)(北京索萊寶科技有限公司)；大鼠BMSC的標(biāo)記抗體Alexa Fluor 647-CD29、FITC-CD44、FITC-CD45、PE-CD73和APC-CD90抗體(美國BD公司)；Ⅰ型膠原(Collagen Ⅰ)(英國Abcam公司)；彈性蛋白(Elastin)(美國Santa Cruz公司)；SlowFade Gold抗淬滅熒光封片劑(美國Life Technologies公司)；miR-145-shRNA慢病毒載體和miR-NC慢病毒對照載體由漢恒生物科技(上海)有限公司合成；RNeasy Plus Mini試劑盒和QuantiTect逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Qiagen公司)；RIPA裂解液、DAPI染色劑、BCA蛋白測定試劑盒和β-actin抗體(上海碧云天生物科技有限公司)；CCK-8細(xì)胞活力檢測試劑盒、ECL發(fā)光底物試劑盒和HRP標(biāo)記的二抗(萬類生物科技(上海)有限公司)。IX81顯微鏡(日本Olympus公司)；CytoFLEX S流式細(xì)胞儀(德國Beckman公司)；壓力傳感器(美國Grass Instruments公司)；ELX800酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司；注射泵(美國KD Scientifi公司)；電泳電轉(zhuǎn)系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠原代BMSC的分離和培養(yǎng)

從3只6個月齡雌性SD大鼠股骨骨髓中分離BMSC，培養(yǎng)于含有20% FBS和1%鏈霉素/青霉素的IMDM培養(yǎng)基中，每3 d換液1次。待細(xì)胞融合至80%時，用0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，并重新以5×105個·mL-1密度接種到培養(yǎng)瓶中，標(biāo)記為第1代，按照此方法傳代，取純化的第3代BMSC用于鑒定。

1.2.2 免疫熒光法和流式細(xì)胞術(shù)鑒定BMSC

免疫熒光法：第3代BMSC以每孔2500個細(xì)胞的密度種于24孔室玻片上，細(xì)胞貼壁后，用4%多聚甲醛固定過夜，PBS沖洗，用10% BSA封閉45 min，再用0.1% Triton X-100透過5 min，4 ℃下分別孵育Alexa Fluor 647-CD29(1:200)和FITC-CD44(1:100)抗體過夜，PBS沖洗，DAPI染核5 min，用SlowFade Gold防淬滅劑封片，并用熒光顯微鏡觀察。流式細(xì)胞術(shù)：將第3代BMSC制成1×105個·mL-1密度的細(xì)胞懸液，用10% BSA封閉30 min，然后分別避光孵育1:200稀釋比例的表面抗體FITC-CD44、FITC-CD45、PE-CD73和APC-CD90抗體，并設(shè)立同種型對照，流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.3 miR-145-shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染BMSC

取第3代BMSC以每孔1×105個接種到24孔板中，次日用2 mL含6 μg·mL-1聚酰胺的新鮮IMDM培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，分別加入20 病毒感染復(fù)數(shù)(multiple of infection,MOI)miR-145-shRNA慢病毒載體或?qū)φ誱iR-NC慢病毒載體培養(yǎng)24 h，然后更換新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞，用RNeasy Plus Mini試劑盒提取細(xì)胞的總RNA，然后逆轉(zhuǎn)為cDNA，并用RT-qPCR法檢測轉(zhuǎn)染miR-NC或miR-145-shRNA的BMSC中miR-145的表達(dá)水平，用來評估轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4 CCK-8法檢測細(xì)胞活力

分別取轉(zhuǎn)染miR-NC或miR-145-shRNA的BMSC以每孔1×104個接種到96孔板中，分別培養(yǎng)0、3、5和7 d。加入CCK-8試劑在37 ℃條件下孵育2 h，用酶標(biāo)儀測量450 nm波長處吸光度值。

1.2.5 大鼠PFD模型的建立

將剩余32只大鼠按照隨機(jī)對照表法分為4組：對照組(Con)、PFD模型組(PFD)、miR-NC治療組(miR-NC)和miR-145-shRNA治療組(miR-145-shRNA)，每組8只。按照文獻(xiàn)[14]方法，用陰道擴(kuò)張方式構(gòu)建PFD模型：將18F導(dǎo)管插入大鼠陰道，并用3-0絲線固定，然后向連接壓力傳感器的Foley球囊進(jìn)行注水3.0 mL，并維持對盆底支持組織產(chǎn)生持續(xù)0.15 kg壓力狀態(tài)4 h，放水并與壓力傳感器一并取出。Con組只插導(dǎo)管不注水。miR-NC組和miR-145-shRNA組大鼠在取出壓力傳感器后，分別通過尾靜脈注射1×106個已轉(zhuǎn)染miR-NC和miR-145-shRNA慢病毒載體的BMSC。于陰道擴(kuò)張14 d后，分別測定膀胱內(nèi)壓和漏尿點(diǎn)壓。

1.2.6 膀胱內(nèi)壓測定

腹腔注射1.2 g·kg-1烏拉坦麻醉各組大鼠，然后將PE-50膀胱導(dǎo)管插入大鼠膀胱，導(dǎo)管經(jīng)三通裝置連接到一個微量注射泵和一個壓力傳感器。用手排空膀胱，記錄膀胱基線壓力值；然后通過導(dǎo)管以5 mL·h-1的速度向每個膀胱輸注37 ℃的生理鹽水，充滿膀胱直到出現(xiàn)自發(fā)性排尿現(xiàn)象，在此過程中記錄膀胱自發(fā)性收縮壓力值、最高收縮壓力值和自發(fā)性收縮時的排尿容積。每只大鼠重復(fù)進(jìn)行3次試驗(yàn)。排尿時膀胱內(nèi)壓=最高收縮壓力平均值-膀胱基線壓力平均值。

1.2.7 漏尿點(diǎn)壓測定

腹腔注射1.2 g·kg-1烏拉坦麻醉各組大鼠，然后將PE-50膀胱導(dǎo)管插入大鼠膀胱，導(dǎo)管經(jīng)三通裝置連接到一個微量注射泵和一個壓力傳感器。用手排空膀胱，并記錄此時的膀胱基線壓力值；然后通過導(dǎo)管以5 mL·h-1的速度向每個膀胱輸注37 ℃的生理鹽水，當(dāng)達(dá)到0.4 mL(約膀胱容量的一半)時，用手緩慢按壓大鼠下腹部以增加膀胱內(nèi)壓力，直到漏尿現(xiàn)象，迅速松開手，記錄無張力收縮時漏尿的峰壓力值。每只大鼠重復(fù)進(jìn)行3次試驗(yàn)。漏尿點(diǎn)壓=無張力收縮時漏尿的峰壓力平均值-膀胱基線壓力平均值。

1.2.8 western blot法檢測目的蛋白表達(dá)

麻醉大鼠后，斷頭處死，解剖并收集大鼠盆底支持組織。用RIPA提取組織樣品中總蛋白。用BCA蛋白測定試劑盒對樣品的總蛋白定量后，將各樣品等量蛋白變性后，經(jīng)SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。用5%脫脂乳封閉膜后，4 ℃下分別孵育Collagen Ⅰ(1:1000)、Elastin(1:2000)和β-actin(1:8000)過夜，用TBST洗膜后，室溫孵育HRP標(biāo)記的二抗1 h，再次洗膜后，用ECL發(fā)光底物試劑盒使得條帶顯像。用Image J測量蛋白的相對表達(dá)量。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSC的鑒定

免疫熒光法顯示，第3代BMSC中，BMSC的特異表面標(biāo)志物CD29和CD44的表達(dá)均呈陽性(圖1A)。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，第3代BMSC中間充質(zhì)干細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD44、CD73和CD90的表達(dá)均呈陽性，而造血干細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD45的表達(dá)呈陰性(圖1B)。表明成功分離獲得BMSC。

A：BMSC細(xì)胞中CD29和CD44的表達(dá)(免疫熒光染色，×400)；B：BMSC細(xì)胞表面CD73、CD44、CD90和CD45的表達(dá)(流式細(xì)胞術(shù))。

2.2 BMSC中miR-145的表達(dá)及其活力

RT-qPCR結(jié)果顯示，與miR-NC組比較，miR-145-shRNA組BMSC中miR-145的表達(dá)降低(P<0.001)。見圖2。CCK-8結(jié)果顯示，與miR-NC組比較，miR-145-shRNA組BMSC的細(xì)胞活力明顯增加(P<0.01或P<0.001)。見圖3。

*P<0.001與miR-NC組比較；n=4。

2.3 各組大鼠的尿流動力學(xué)比較

與Con組相比，PFD組大鼠的膀胱容積(圖4A)、排尿時膀胱內(nèi)壓(圖4B)以及漏尿點(diǎn)壓(圖4C)均顯著降低(P<0.01或P<0.001)，表明大鼠PFD造模成功。與PFD組比較，注射轉(zhuǎn)染miR-NC的BMSC可在一定程度上增高PFD大鼠的膀胱容積(圖4A)、排尿時膀胱內(nèi)壓(圖4B)以及漏尿點(diǎn)壓(圖4C)(P<0.05或P<0.01)。與miR-NC組比較，miR-145-shRNA組大鼠的膀胱容積(圖4A)、排尿時膀胱內(nèi)壓(圖4B)以及漏尿點(diǎn)壓(圖4C)均升高(P<0.05或P<0.01)。

A：膀胱容積；B：膀胱內(nèi)壓；C：漏尿點(diǎn)壓。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001；n=8。

2.4 各組大鼠盆底支持組織中Elastin和Collagen Ⅰ的蛋白表達(dá)比較

western blot結(jié)果顯示，與Con組比較，PFD組大鼠盆底支持組織中Elastin和Collagen Ⅰ表達(dá)水平顯著降低(均P<0.001)；與PFD組大鼠比較，miR-NC組和miR-145-shRNA組大鼠盆底支持組織中Elastin和Collagen Ⅰ表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05或P<0.001)，其中miR-145-shRNA組大鼠盆底支持組織中Elastin和Collagen Ⅰ表達(dá)水平明顯高于miR-NC組(P<0.05)。見圖5。

A：Collagen Ⅰ和Elastin蛋白印跡圖；B：Collagen Ⅰ的相對表達(dá)；C：Elastin的相對表達(dá)。*P<0.05，**P<0.001；n=8。

3 討論

目前，盆底支持組織缺陷被認(rèn)為是導(dǎo)致PFD病理生理學(xué)發(fā)展的重要原因之一[2-5]。Elastin是多種支持組織(如韌帶和主動脈)ECM中彈性纖維的主要成分，其能在沒有能量的情況下促進(jìn)組織的伸展和恢復(fù)到原來的狀態(tài)[15]。膠原蛋白是ECM中另外一種重要的結(jié)構(gòu)蛋白，其在維持盆底支持組織的彈性和韌性中起重要作用[16]。彈性蛋白纖維降解及膠原蛋白流失可導(dǎo)致韌帶、筋膜等盆底支持組織的張力降低和支持組織結(jié)構(gòu)的松弛，并最終導(dǎo)致PFD的發(fā)生[4-5]。因此，恢復(fù)PFD盆底支持組織中Elastin和膠原蛋白的含量可增加盆底支持組織的彈性和韌性，可在一定程度上逆轉(zhuǎn)PFD的癥狀。

BMSC因具有很強(qiáng)的分化能力和分泌有利于組織修復(fù)的生物活性因子的能力，其在軟組織修復(fù)和重建中的潛力已被廣泛報(bào)道[17-18]。如，BMSC移植能促進(jìn)新生組織的生長以及體內(nèi)傷口愈合動物模型中沉積的膠原[18]。在與PFD相關(guān)的治療研究中，CORCOS等[7]發(fā)現(xiàn)，注射BMSC能修復(fù)受損的外尿道括約肌，顯著改善SUI癥狀；JIN等[8]研究顯示，注射BMSC能恢復(fù)PFD盆底支持組織中Elastin和膠原蛋白的含量，緩解PFD的SUI癥狀。本研究也同樣顯示，與PFD模型組比較，注射BMSC能增加PFD盆底支持組織中Elastin和膠原蛋白的含量，并一定程度上恢復(fù)因陰道擴(kuò)張而受損盆底組織的功能(增加膀胱容積、排尿時膀胱內(nèi)壓和漏尿點(diǎn)壓)。近來研究[16,19-20]顯示，改變BMSC中某些miRNAs的表達(dá)可增強(qiáng)BMSC對受損組織的恢復(fù)功能，如上調(diào)BMSC中miR-29表達(dá)能增強(qiáng)BMSC對PFD受損盆底支持組織彈性和韌性的恢復(fù)[16]；miR-145修飾的BMSC可通過TGF-β/Smad調(diào)節(jié)大鼠陰莖中平滑肌細(xì)胞和Collagen Ⅰ含量，改善其勃起功能[19]。另外，已有報(bào)道[20]顯示，過表達(dá)miR-145能增加血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠腹主動脈中Elastin和膠原蛋白降解的發(fā)生率，反之，敲減miR-145能降低血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠腹主動脈中Elastin和膠原蛋白降解的發(fā)生率。本研究結(jié)果顯示，在PFD大鼠模型中，與注射miR-NC慢病毒載體轉(zhuǎn)染的BMSC比較，注射miR-145-shRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染的BMSC的大鼠Elastin和Collagen Ⅰ表達(dá)水平均明顯增加，且膀胱容積、排尿時膀胱內(nèi)壓和漏尿點(diǎn)壓均明顯增高，說明敲減BMSC中miR-145表達(dá)能增強(qiáng)BMSC對PFD的修復(fù)作用。雖然如此，本研究依然具有很多局限性需要考慮：比如，注射miR-145-shRNA-BMSC是通過何種信號途徑上調(diào)PFD大鼠盆底支持組織中Elastin和Collagen Ⅰ表達(dá)，以及注射miR-145-shRNA-BMSC是否能調(diào)節(jié)其他修復(fù)相關(guān)蛋白參與增強(qiáng)BMSC對PFD的修復(fù)作用；另外，改變BMSC中其他miRNAs的表達(dá)是否也能影響B(tài)MSC對PFD的修復(fù)作用等一些未知的問題。這些未知的問題仍有待更多的研究去證明。

總之，本研究結(jié)果提示抑制BMSC中miR-145的表達(dá)可提高BMSC移植對PFD大鼠的治療潛力。同時，本研究綜合了miRNA生物學(xué)和基因工程BMSC技術(shù)，為尋找PFD的潛在療法提供了一個新方向。