VEGF-A在腎臟疾病中的研究進(jìn)展

吳 瑤，柯 本，房向東，涂衛(wèi)平

(南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科，南昌 330006)

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)也被稱(chēng)作血管通透性因子(VPF),是新生血管形成的重要介質(zhì)。20世紀(jì)末，SENGER等[1]首先從腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)液中純化得到VEGF分子，并證明其可以誘導(dǎo)血管滲漏；而后，LEUNG等[2]發(fā)現(xiàn)該分子也是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異的有絲分裂原,能夠引起強(qiáng)烈的血管生成反應(yīng)。VEGF-A作為VEGF家族的重要一員，已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在腎臟血管網(wǎng)系統(tǒng)的形成和發(fā)育階段發(fā)揮關(guān)鍵性作用[3]。VEGF-A的異常表達(dá)與腎臟疾病有著密切聯(lián)系，并且VEGF-A抑制劑和VEGF-A補(bǔ)充治療都在腎臟疾病實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭酗@示了一定的腎臟保護(hù)作用。本文主要總結(jié)和討論了血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子VEGF-A對(duì)正常腎臟生理的維持以及它在腎臟疾病中的作用。

1 VEGF-A的概述

VEGF基因家族中含有VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D以及PIGF(胎盤(pán)生長(zhǎng)因子)，它們的基因產(chǎn)物以同二聚體的形式發(fā)揮作用并且由于其分子大小以及結(jié)合肝素、硫酸乙酰肝素或神經(jīng)纖毛蛋白的能力不同而具有不同的擴(kuò)散性和局部活性[4]。其中VEGF-A是人類(lèi)VEGF的主要亞型,也是最有效的血管生成誘導(dǎo)劑之一。

VEGF-A基因含有8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子，對(duì)外顯子進(jìn)行選擇剪接后產(chǎn)生一系列促血管生成的亞型，一般稱(chēng)為VEGF-Axxx(VEGF-A121,VEGF-A145,VEGF-A165,VEGF-A189和VEGF-A206,其數(shù)字表示氨基酸的數(shù)量)。對(duì)第8外顯子上的特異性剪切位點(diǎn)作用可以形成功能不同的亞型，稱(chēng)為VEGF-Axxxb，腎臟中最常見(jiàn)的亞型為VEGF-A165b[5]。

VEGF-A的生理效應(yīng)由2個(gè)同源VEGF-A受體結(jié)合所驅(qū)動(dòng):VEGFR-1(小鼠中為Flt-1)和VEGFR-2(Flk-1;KDR)[6]。在成人中,VEGFR-1和VEGFR-2主要分布在血管內(nèi)皮細(xì)胞中,而VEGFR3主要在淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞[7]。此外,VEGF-A與不同VEGFR亞型的作用效應(yīng)和親和力也不同。VEGFR-1對(duì)VEGF-A反應(yīng)輕微激活;然而,VEGFR-1結(jié)合VEGF-A的親和力卻比VEGFR-2提高了10倍。最新的研究[8]也表明,VEGF-A的各種剪接變異體亞型在與VEGFR結(jié)合的親和力中表現(xiàn)出不同,其中VEGF-A165b抗血管生成亞型優(yōu)先結(jié)合VEGFR2，與促血管生成亞型VEGFA-121及VEGFA165a相反。

2 VEGF-A對(duì)正常腎功能的維持

腎小球?yàn)V過(guò)屏障(GFB)由臟層上皮細(xì)胞(足細(xì)胞)、有窗孔的毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞和中間的基底膜組成。足細(xì)胞VEGF-A的旁分泌以及自分泌作用對(duì)GFB的發(fā)育和完整性必不可少。在腎皮質(zhì)中,足細(xì)胞表達(dá)和分泌VEGF-A占大部分,而小管上皮細(xì)胞分泌較少。ROBERT等[9]在發(fā)育中的腎小球檢測(cè)到,VEGF-A的幾種主要亞型在足細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá),其中VEGF-A164亞型表達(dá)最豐富。免疫電子顯微鏡研究[10]顯示,VEGF定位于足細(xì)胞足突、腎小球基底膜(GBM)以及內(nèi)皮的管腔和非管腔表面,并證明足細(xì)胞分泌的VEGF可以通過(guò)腎小球?yàn)V液逆流向內(nèi)皮細(xì)胞。VEGF-A表達(dá)在腎小球發(fā)育的S形階段首先被檢測(cè)到,此時(shí)足細(xì)胞前體與發(fā)育中的毛細(xì)血管裂隙直接相鄰。隨后,腎間質(zhì)中存在的Flk-1陽(yáng)性?xún)?nèi)皮細(xì)胞前體在VEGF陽(yáng)性的足細(xì)胞作用下遷移到血管裂隙中進(jìn)行增殖和分化[7]。這2種細(xì)胞的相互作用表明足細(xì)胞分泌的VEGF能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、生長(zhǎng)和存活，即足細(xì)胞旁分泌發(fā)揮作用。有趣的是,足細(xì)胞自身也能表達(dá)功能性VEGFR2,尤其是在足突上。Nephrin蛋白是狹縫隔膜的基本跨膜蛋白,足細(xì)胞釋放的VEGF-A與足突上的Nephrin-VEGFR2復(fù)合物結(jié)合后將信息傳導(dǎo)到足細(xì)胞肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架,從而影響?yīng)M縫橫膈膜的功能和維持GFB的完整[11]。此外,FOSTER等[10]報(bào)道VEGF-A可以調(diào)節(jié)足細(xì)胞的Ca2+穩(wěn)態(tài)和保護(hù)足細(xì)胞存活。CD2相關(guān)蛋白(CD2AP)是一種狹縫隔膜的相關(guān)支架蛋白,最近的研究[12]表明VEGF-A刺激可誘導(dǎo)足細(xì)胞CD2AP分子中的SH3-1結(jié)構(gòu)域Y10位置的酪氨酸磷酸化反應(yīng),并且該磷酸化反應(yīng)對(duì)Nephrin蛋白的穩(wěn)定性必不可少,可能是足細(xì)胞內(nèi)源性維持機(jī)制的一部分。除此之外，DIMKE等[13]發(fā)現(xiàn)VEGF-A可由腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)，而其受體(KDR/VEGFR2)的表達(dá)主要在相鄰的管周毛細(xì)血管中。特異性敲除腎小管VEGF-A后，小鼠腎臟變小，管周毛細(xì)血管密度顯著降低。

3 VEGF-A與急性腎損傷

急性腎損傷(AKI)是一種嚴(yán)重的臨床疾病,其特點(diǎn)是血肌酐迅速增高、腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)迅速減少。AKI患病率在過(guò)去幾十年呈逐漸增加趨勢(shì)，它也是慢性腎臟病(CKD)迅速發(fā)展并進(jìn)展成終末期腎病(ESRD)的重要危險(xiǎn)因素[14]。由于尿量和血清肌酐在檢測(cè)腎損傷的早期階段方面并不理想，往往不能及時(shí)診斷AKI。有研究[15]表明，高水平的VEGF促血管生成因子與較低的AKI患病率(31%)和死亡率(54%)風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。因此，對(duì)血管生成等過(guò)程進(jìn)行深入研究將有助于診斷和設(shè)計(jì)治療AKI的策略。

早期VEGF-121治療可以保護(hù)缺血-再灌注(I/R)小鼠模型的腎臟微血管結(jié)構(gòu),并改善慢性腎功能[16]。缺血再灌注損傷(IRI)為AKI的主要病因，I/R小鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵脖粡V泛運(yùn)用于AKI的機(jī)制研究。腎缺氧可以發(fā)生在不同病因的AKI中,而缺氧誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子(HIF)的激活已被確認(rèn)為是細(xì)胞適應(yīng)低氧環(huán)境的重要機(jī)理[17]。HIF在氧充足條件下表達(dá)，可以被羥化酶抑制劑(PHD)降解；低氧條件下PHD活性較弱，穩(wěn)定的HIF可以激活多個(gè)促血管生成基因，VEGF-A也是HIF的一個(gè)靶基因。最近研究[18]表明，HIF脯氨酸羥化酶抑制劑在急性缺血和CKD中可通過(guò)穩(wěn)定HIF來(lái)改善VEGF-A反應(yīng)從而增強(qiáng)肌肉血管生成。SNCHEZ NAVARRO等[19]利用腎切除術(shù)加I/R模型探討AKI向CKD發(fā)展的機(jī)制,發(fā)現(xiàn)HIF1α結(jié)合位點(diǎn)VEGF-A啟動(dòng)子基因高度甲基化,導(dǎo)致再灌注后VEGF-A一直處于降低水平。VEGF-A水平下降導(dǎo)致血管稀疏,進(jìn)而使慢性缺氧永久化,促進(jìn)腎缺血損傷后CKD的發(fā)展。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)移植是一種在AKI中恢復(fù)腎小管結(jié)構(gòu)和改善腎功能的新技術(shù)。VEGF修飾的hMSC植入順鉑誘導(dǎo)的腎損傷裸鼠模型，與單獨(dú)MSC植入相比，可增強(qiáng)MSC抗凋亡作用、改善微循環(huán)和細(xì)胞增殖,在預(yù)防AKI方面提供更大的益處[20]。這些研究均表明上調(diào)VEGF-A和HIF的水平對(duì)AKI起到保護(hù)性作用。然而,XU等[21]發(fā)現(xiàn)miR-195-5P負(fù)性調(diào)控靶基因VEGF-A,抑制炎癥和氧化應(yīng)激從而減輕AKI。這表明VEGF-A在AKI的發(fā)展中也可起促進(jìn)作用。VEGF-A在AKI中的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4 VEGF-A與糖尿病腎病

糖尿病腎病(DKD/DN)是糖尿病的一種高流行的并發(fā)癥,大約30%～40%的糖尿病患者進(jìn)展為DKD[22]。它不僅是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因,而且還是糖尿病患者全因死亡率和心血管疾病(CVD)死亡率過(guò)高的主要因素[23]。DKD的主要臨床特點(diǎn)是蛋白尿和進(jìn)行性腎功能衰竭,組織學(xué)特征為腎小球基底膜進(jìn)行性加厚、腎小球系膜基質(zhì)的積聚及晚期伴或不伴有微動(dòng)脈瘤和系膜溶解的Kimmelstiel-Wilson結(jié)節(jié)性疾病,最后出現(xiàn)腎小球硬化[24]。異常血管生成已被發(fā)現(xiàn)與DKD的病理生理學(xué)重要相關(guān)[25]。然而,目前抗血管生成治療局限于糖尿病患者視網(wǎng)膜病變的治療,DKD的血管生成機(jī)制仍然有待進(jìn)一步研究。

在實(shí)驗(yàn)性DKD早期,VEGF-A水平已被證明顯著升高。影響糖尿病發(fā)展的各種病理因素與腎臟VEGF-A水平變化相關(guān)。高糖水平(HG)可通過(guò)血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)刺激腎近端小管上皮細(xì)胞VEGF的合成[26]。HG也可以通過(guò)激活蛋白激酶C(PKC)和ERK刺激足細(xì)胞中VEGF164的生成[27]。晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)通過(guò)增加核因子-κB(NF-κB)和激活蛋白-1(AP-1)上調(diào)VEGF mRNA水平[28]。此外,足細(xì)胞表達(dá)胰島素受體,胰島素以neprhin依賴(lài)的方式增加足細(xì)胞中VEGF-A mRNA和蛋白質(zhì)水平。體外或體內(nèi)下誘導(dǎo)足細(xì)胞胰島素抵抗時(shí),VEGF-A的生成受損且發(fā)生在胰島素抵抗導(dǎo)致足細(xì)胞損傷之前[29]。同樣,異常VEGF-A通過(guò)不同機(jī)制促進(jìn)DKD的發(fā)展?！癡EGF-A與NO解偶聯(lián)”可能是DKD患者體內(nèi)血管異常的主要機(jī)制之一。DKD患者腎臟NO生物利用度率低,VEGF-A水平升高。內(nèi)皮細(xì)胞分泌的NO是一種抑制因子，可以防止過(guò)多的內(nèi)皮細(xì)胞增殖，血管平滑肌細(xì)胞增生和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)。VEGF與NO解偶聯(lián)可通過(guò)KDR(VEGFR2)和ERK途徑促使內(nèi)皮細(xì)胞增殖和巨噬細(xì)胞趨化，形成病理性血管[30]。最近研究[31]表明,低水平的β2糖蛋白I(β2GPI)可以部分逆轉(zhuǎn)高血糖引起的VEGF-NO軸解偶聯(lián)；β2GPI是一種主要由肝細(xì)胞合成的血漿磷脂結(jié)合蛋白。

在DKD早期使用VEGF-A抑制劑可以上調(diào)磷酸化AKT水平而減少足細(xì)胞損傷和改善腎功能[32]。BUS等[33]在鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)1型糖尿病小鼠模型之后進(jìn)行sFLT-1(VEGF-A抑制劑)轉(zhuǎn)染,結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染FLT-1可使蛋白尿、腎小球肥大情況和系膜基質(zhì)含量(即腎小球IV型膠原蛋白水平)正?；?從而顯著降低腎臟損傷。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)sFLT-1轉(zhuǎn)染可減少內(nèi)皮細(xì)胞活化、腎小球巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)和腎小球TNF-α蛋白水平。sFLT-1轉(zhuǎn)染是在小鼠造模5周后進(jìn)行,已經(jīng)證明發(fā)生了腎損害。這表明VEGF-A抑制劑在DKD小鼠模型中起到逆轉(zhuǎn)腎損傷的作用。此外,大量證據(jù)表明VEGF-A抗血管生成亞型VEGF-A165b可能發(fā)揮重要的腎臟保護(hù)作用。OLTEAN等[34]發(fā)現(xiàn)早期糖尿病腎病患者的腎臟中VEGF-A165亞型水平升高,而晚期腎病患者的腎臟中VEGF-A165b亞型水平升高；在糖尿病小鼠中通過(guò)足細(xì)胞特異性VEGF-A165b表達(dá)或重組人VEGF-A165b給藥可減少蛋白尿,而在培養(yǎng)的足細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF-A165b以VEGFR-2依賴(lài)性方式減少高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)VEGF-A165b可以恢復(fù)腎小球內(nèi)皮糖萼進(jìn)而保護(hù)腎功能。VEGFR2激酶抑制劑SU5416可減輕系膜基質(zhì)擴(kuò)張和基底膜增厚、腎小管間質(zhì)炎癥和腎小管萎縮和改善2型糖尿病小鼠的蛋白尿[35]。上述發(fā)現(xiàn)表明,通過(guò)抑制VEGF-A可能是DN患者的一種潛在治療方法。然而,SIVASKANDARAJAH等[36]發(fā)現(xiàn)腎小球VEGF-A特異性敲除的小鼠誘導(dǎo)1型糖尿病產(chǎn)生更嚴(yán)重的腎臟損傷。此外VEGF-A抑制劑在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者中的臨床應(yīng)用也顯示出有爭(zhēng)議的結(jié)果[37]。這說(shuō)明VEGF過(guò)低或過(guò)高都可能是有害的。因此,DN患者的抗VEGF-A治療必須保持VEGF-A表達(dá)在正常水平范圍。

5 VEGF-A與多囊性腎病

多囊性腎病(PKD)患者的腎臟中含有多個(gè)充滿液體的囊腫，破壞正常腎臟結(jié)構(gòu)和功能，常導(dǎo)致ESKD。常染色體顯性遺傳性PKD(ADPKD)是最常見(jiàn)的PKD形式，通常是一種發(fā)生于成人的多系統(tǒng)疾病，其主要原因?yàn)榉謩e編碼多囊素1和2的PKD1和PKD2基因發(fā)生突變[38]。PKD1和PKD2基因定位于腎小管上皮細(xì)胞，其編碼的多囊素1和2蛋白功能障礙使細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)減少，細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(cAMP)升高，蛋白激酶A依賴(lài)性基因的轉(zhuǎn)錄增加，引起腎小管上皮過(guò)度增生并最終導(dǎo)致囊腫形成和擴(kuò)張[39]。大量研究[40-41]表明，囊腫的生長(zhǎng)除了與腎小管上皮機(jī)制有關(guān)外，也與血管生成有關(guān)。SONG等[42]對(duì)ADPKD患者不同大小的囊腫的轉(zhuǎn)錄組分析顯示，與最小囊腫組織相比，體積更大的囊腫中VEGF-A上調(diào)。此外，VEGF-A在健康小鼠腎小管中的靶向過(guò)表達(dá)導(dǎo)致了囊腫形成亦支持VEGF-A的致病作用[43]。在另一項(xiàng)對(duì)腎功能正常的年輕ADPKD患者的研究[41]中，患者循環(huán)VEGF-A增加，血清VEGF-A水平與腎臟總?cè)莘e和囊腫容積相關(guān)。需要更多PKD與血管生成的動(dòng)物和細(xì)胞研究來(lái)揭示所涉及的分子機(jī)制，可能為ADPKD提供潛在的新治療靶點(diǎn)。

6 VEGF-A與其他腎小球疾病

基于VEGF-A在GFB發(fā)育和維持中的重要作用,VEGF-A在各種腎小球疾病包括IgA腎病(IgAN)、膜性腎病、微小病變型腎病中也表現(xiàn)出異常,具有潛在的治療價(jià)值。

IgAN是最典型的原發(fā)性腎小球腎炎,也是我國(guó)終末期腎病(ESRD)的主要病因。IgA腎病主要機(jī)制是存在循環(huán)和球狀免疫復(fù)合物,包括缺糖IgA1、針對(duì)鉸鏈區(qū)域O-glycans的IgG自身抗體和C3[44]。最新的一項(xiàng)研究[45]中,IgAN患者腎活檢顯示VEGF-A在腎小球各類(lèi)細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)增加,尿VEGF-A水平也顯著增加,該研究小組進(jìn)一步研究IgAN患者尿VEGF-A水平與腎臟預(yù)后的關(guān)系,隨訪了63例IgAN患者,平均隨訪38個(gè)月,發(fā)現(xiàn)尿VEGF-A基線水平較高的IgAN患者腎臟預(yù)后較差。

局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥(FSGS)是一組腎小球組織學(xué)疾病,被認(rèn)為是導(dǎo)致ESKD的最常見(jiàn)球狀病因。不同病因引起的FSGS有共同臨床特征：足細(xì)胞的損傷和病變[46]。HIV病毒相關(guān)的腎臟并發(fā)癥表現(xiàn)為FSGS塌陷。在表達(dá)HIV-1的小鼠足細(xì)胞中可觀察到VEGF-A水平升高[47]。在VEGF-A以足細(xì)胞特異性方式過(guò)度表達(dá)的動(dòng)物模型中也觀察到這種FSGS表型[48],表明VEGF-A表達(dá)可能與HIVAN的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。然而,在一項(xiàng)對(duì)抗VEGF-A治療的癌癥患者出現(xiàn)腎臟不良反應(yīng)的回顧性研究[49]中,出現(xiàn)FSGS樣病變占27%,主要由酪氨酸激酶抑制劑引起。說(shuō)明過(guò)表達(dá)和抑制VEGF-A水平均可引起FSGS樣病變。有趣的是,膜性腎病伴局灶性節(jié)段性腎小球硬化病變(MN-FSGS)組比MN不伴FSGS組顯示出明顯的GBM厚度增加、ECM積聚以及足細(xì)胞損傷伴有足突消失,但兩組足細(xì)胞上VEGF的表達(dá)沒(méi)有差異[50]。VEGF-A在FSGS中的作用有待進(jìn)一步證實(shí)。

膜性腎病(MN)一種腎臟局限性自身免疫性疾病，多發(fā)生于成人。目前臨床上使用傳統(tǒng)療法免疫抑制劑聯(lián)合糖皮質(zhì)激素以及利妥昔單抗療法仍存在爭(zhēng)議和挑戰(zhàn)，部分原因則是對(duì)該病發(fā)病機(jī)制的了解不足，以及缺乏敏感的疾病活動(dòng)生物標(biāo)記物[51]?？沽字窤2受體(PLA2R),1型血小板反應(yīng)蛋白7A域(TSHD7A)是特發(fā)性MN患者足細(xì)胞最主要的兩種自身抗原。MATSUMOTO等[52]報(bào)告的2例THSD7A相關(guān)的MN合并血管淋巴樣增生伴嗜酸性粒細(xì)胞增多癥(ALHE)中，發(fā)現(xiàn)VEGF-A可以上調(diào)THSD7A的表達(dá)。這為MN的發(fā)病機(jī)制研究提供了新的方向。

7 小結(jié)

VEGF-A以及其他血管內(nèi)皮因子在腎臟發(fā)育和腎臟疾病中起著重要作用。VEGF-A抑制劑在各種癌癥中的運(yùn)用中得到了發(fā)展,但也導(dǎo)致腎臟各種病理?yè)p傷。在DN中,盡管VEGF-A抑制治療還未從實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)向臨床,但在闡述血管生成機(jī)制的復(fù)雜性方面取得了重要進(jìn)展。VEGF-A的水平在監(jiān)測(cè)各種腎小球疾病的預(yù)后方面也有重要作用。此外,VEGF-A剪接亞型VEGF-Axxb的腎臟保護(hù)作用研究也為腎臟疾病提供了新的治療靶點(diǎn)。