miR-219-5p對(duì)人腎癌細(xì)胞增殖和遷移、侵襲的影響及其作用機(jī)制

王曉燕，馮景見，何英霞，李 康，李 鑫

(石家莊市人民醫(yī)院腫瘤科五病區(qū)，石家莊 050000)

腎細(xì)胞癌(腎癌)是泌尿系最常見的腫瘤之一，占腎臟惡性腫瘤的80%以上[1]。腎癌約有25%的患者在診斷時(shí)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，30%的患者在根治性腎癌切除術(shù)后出現(xiàn)轉(zhuǎn)移[2]。因此，探索與腫瘤發(fā)生和進(jìn)展相關(guān)的生物標(biāo)志物可能會(huì)改善腎癌的潛在治療策略和預(yù)后。微小RNA(microRNA，miRNA/miR)是一類內(nèi)源性非編碼小RNA，轉(zhuǎn)錄后通過抑制mRNA的翻譯或促進(jìn)其降解來(lái)抑制靶基因的表達(dá)[3]。miRNA的失調(diào)已被證明在包括腎癌在內(nèi)的各種癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用[4-5]。有研究[6-7]表明，miR-219-5p在肝癌、肺癌中下調(diào)表達(dá)，miR-219-5p在癌細(xì)胞中主要作為抑癌基因來(lái)發(fā)揮作用，但目前miR-219-5p對(duì)腎癌的影響還未可知。另研究[8-9]發(fā)現(xiàn)NIMA相關(guān)激酶6(NEK6)在卵巢癌、肝癌中上調(diào)表達(dá)，是影響癌癥預(yù)后的重要因素。本研究生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示，NEK6可能是miR-219-5p的下游靶基因?；诖耍狙芯刻接憁iR-219-5p在腎癌中的表達(dá)，以及在腎癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中的作用，旨在探索其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

腎癌細(xì)胞786-O、ACHN購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，腎上皮細(xì)胞HEK293購(gòu)自上海雅言生物科技有限公司，RPMI 1640培養(yǎng)基(Roswell Park Memorial Institute)、Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，熒光素酶報(bào)告載體、miR-219-5p、anti-miR-219-5p、si-NEK6、pcDNA3.1-NEK6及各自陰性對(duì)照購(gòu)自上海GenePharma公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)相關(guān)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司，細(xì)胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、P21、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體購(gòu)自美國(guó)Cellular Signaling Technology公司，NEK6抗體購(gòu)自上海艾博抗公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.2 臨床組織標(biāo)本

30例腎癌組織和癌旁組織(距離腎癌組織≥3 cm 的正常組織)來(lái)源于石家莊市人民醫(yī)院2015年6月至2019年5月接受手術(shù)治療的腎癌患者，其中女13例，男17例；年齡30～74歲，平均53歲。所有患者術(shù)前未接受任何放、化療。組織標(biāo)本離體后立即于液氮中凍存，用于qPCR檢測(cè)和蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)。

1.3 qPCR檢測(cè)miR-219-5p表達(dá)

為了檢測(cè)miR-219-5p表達(dá)，使用TRIzol試劑提取腎癌組織或細(xì)胞中的總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明，制成cDNA之后進(jìn)行qPCR反應(yīng)，根據(jù)2-ΔΔCt方法量化miR-219-5p表達(dá)。miR-219-5p上游引物序列為5′-ACACTCCAGCTGGGTGATTGTCCAAACGC-3′，下游引物序列為5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；內(nèi)參U6上游引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物序列為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

786-O、ACHN細(xì)胞置于包含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37 ℃、5% CO2條件下孵育，每周換液2～3次，進(jìn)行常規(guī)傳代培養(yǎng)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h前，將786-O和ACHN細(xì)胞接種于6孔板，達(dá)約70%匯合時(shí)，根據(jù)Lipofectamine 2000試劑說(shuō)明書的指示，將miR-219-5p、anti-miR-219-5p、si-NEK6、pcDNA3.1-NEK6及各自陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染到兩株細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h。收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，根據(jù)“1.3”所述方法測(cè)定786-O和ACHN細(xì)胞中miR-219-5p水平，并進(jìn)行其他指標(biāo)檢測(cè)。

1.5 噻唑藍(lán)(MTT)檢測(cè)細(xì)胞增殖

將密度為1×104個(gè)·mL-1的786-O、ACHN細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)48 h后每孔加入MTT溶液100 μL，37 ℃孵育4 h，每孔加入二甲基亞砜200 μL，搖床震蕩培養(yǎng)10 min，酶標(biāo)儀讀取每孔細(xì)胞的吸光度(OD)值，檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm，并根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞存活率：存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.6 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)

收集轉(zhuǎn)染后的786-O和ACHN細(xì)胞，以1000個(gè)細(xì)胞·孔-1的密度置于6孔板中，在37 ℃、5% CO2、飽和濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d。當(dāng)出現(xiàn)肉眼可見的細(xì)胞克隆時(shí)，使用1:1甲醇和丙酮固定，5%龍膽紫染色后計(jì)數(shù)。

1.7 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移、侵襲

在兩株細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測(cè)時(shí)，使用無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)·mL-1，吸取100 μL于上室(檢測(cè)細(xì)胞侵襲時(shí)，實(shí)驗(yàn)前使用無(wú)血清培養(yǎng)基與Matrigel膠混勻包被上室)，吸取500 μL包含血清的RPMI 1640培養(yǎng)基于下室。培養(yǎng)24 h后，甲醛和結(jié)晶紫分別進(jìn)行染色、固定，之后于顯微鏡下觀察，拍照、計(jì)數(shù)。

1.8 Western blot檢測(cè)

收集腎癌組織或轉(zhuǎn)染后的786-O和ACHN細(xì)胞，加入裂解液提取蛋白，蛋白樣品沸水變性后進(jìn)行10%的十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，蛋白分離后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜，加入5%脫脂奶粉封閉，加入1:1000稀釋的NEK6、Cyclin D1、P21、E-cadherin、MMP-2、NEK6及內(nèi)參照GAPDH抗體，于4 ℃條件下孵育過夜，Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液(TBST)洗脫3次，每次10 min，加入二抗，室溫孵育2 h，經(jīng)ELC顯色、顯影，分析蛋白條帶灰度值。

1.9 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

starBase網(wǎng)站(http://starbase.sysu.edu.cn/)預(yù)測(cè)miR-219-5p的靶基因，發(fā)現(xiàn)NEK6的3’非編碼區(qū)域(3’untranslated region，3’UTR)含有與miR-219-5p互補(bǔ)的核苷酸序列。分別構(gòu)建包含miR-219-5p結(jié)合位點(diǎn)的NEK6野生型(WT-NEK6)及突變型(MUT-NEK6)熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒，并利用Lipofectamine 2000試劑分別與miR-219-5p、miR-NC共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后依據(jù)雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒的指示檢測(cè)雙熒光素酶活性。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-219-5p、NEK6在腎癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)

qPCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與癌旁組織比較，腎癌組織中miR-219-5p表達(dá)量[(0.17±0.02)比(1.03±0.10)，P<0.05]明顯減少，NEK6蛋白表達(dá)量[(0.90±0.08)比(0.28±0.03)，P<0.05]顯著增加；與腎上皮細(xì)胞比較，786-O、ACHN腎癌細(xì)胞株中miR-219-5p表達(dá)量[(0.18±0.02)、(0.27±0.03)比(1.01±0.10)，P<0.05]明顯減少，NEK6蛋白表達(dá)量[(0.93±0.08)、(0.78±0.07)比(0.31±0.03)，P<0.05]顯著增加，見圖1。

A：miR-219-5p在腎癌組織中的表達(dá)；B：NEK6在腎癌組織中的表達(dá)；C：miR-219-5p在腎癌細(xì)胞中的表達(dá)；D：NEK6在腎癌細(xì)胞中的表達(dá)；*P<0.05與癌旁組織比較；#P<0.05與腎上皮細(xì)胞比較。

2.2 過表達(dá)miR-219-5p對(duì)腎癌細(xì)胞786-O、ACHN增殖、遷移、侵襲的影響

Transwell檢測(cè)結(jié)果表明，過表達(dá)miR-219-5p組比miR-NC組明顯減少786-O、ACHN細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)[(87.00±5.84)個(gè)比(186.00±16.10)個(gè)、(93.00±6.14)個(gè)比(166.00±15.21)個(gè)，P<0.05]和侵襲細(xì)胞數(shù)[(50.00±5.11)個(gè)比(107.00±11.30)個(gè)、(54.00±5.26)個(gè)比(89.00±7.23)個(gè)，P<0.05](圖2A—B)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，同miR-NC組相比，過表達(dá)miR-219-5p組顯著降低786-O、ACHN細(xì)胞的Cyclin D1[(0.14±0.01)比(0.79±0.08)、(0.22±0.02)比(0.71±0.07)，P<0.05]、MMP-2[(0.31±0.03)比(0.84±0.08)、(0.37±0.04)比(0.77±0.08)，P<0.05]蛋白表達(dá)水平，明顯增加P21[(0.61±0.06)比(0.20±0.02)、(0.56±0.06)比(0.24±0.02)，P<0.05]、E-cadherin[(0.68±0.07)比(0.17±0.02)、(0.58±0.05)比(0.21±0.02)，P<0.05]蛋白表達(dá)水平(圖2C—D)。qPCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，786-O、ACHN細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-219-5p后，miR-219-5p表達(dá)量明顯高于miR-NC組(P<0.05)，見表1。MTT和細(xì)胞克隆檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR-NC組比較，過表達(dá)miR-219-5p顯著降低786-O、ACHN細(xì)胞的存活率和克隆數(shù)(P<0.05)，見表1。

A：過表達(dá)miR-219-5p對(duì)腎癌細(xì)胞786-O遷移、侵襲的影響；B：過表達(dá)miR-219-5p對(duì)腎癌細(xì)胞ACHN遷移、侵襲的影響；C：786-O中Cyclin D1、P21、E-cadherin、MMP-2蛋白的表達(dá)；D：ACHN中Cyclin D1、P21、E-cadherin、MMP-2蛋白的表達(dá)；*P<0.05與miR-NC組比較。

表1 過表達(dá)miR-219-5p對(duì)腎癌細(xì)胞786-O、ACHN存活率和克隆數(shù)的影響

2.3 miR-219-5p靶向、調(diào)控NEK6

starBase網(wǎng)站預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-219-5p與NEK6部分堿基序列可形成互補(bǔ)配對(duì)(圖3A)。Western blot檢測(cè)結(jié)果表明，與miR-NC組比較，miR-219-5p組786-O、ACHN細(xì)胞的NEK6蛋白表達(dá)水平[(0.36±0.03)比(0.91±0.09)、(0.20±0.02)比(0.72±0.07)，P<0.05]明顯減少；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-219-5p組NEK6蛋白表達(dá)水平[(1.41±0.14)比(0.88±0.09)、(1.09±0.10)比(0.71±0.07)，P<0.05]顯著提高(圖3B)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與miR-NC和WT-NEK6共轉(zhuǎn)染786-O細(xì)胞相比，miR-219-5p和WT-NEK6共轉(zhuǎn)染明顯降低細(xì)胞的熒光素酶活性(P<0.05)，而miR-NC或miR-219-5p分別和MUT-NEK6共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，細(xì)胞的熒光素酶活性無(wú)顯著變化(P>0.05)，見表2。

A：NEK6的3’UTR含有miR-219-5p的互補(bǔ)序列；B：miR-219-5p調(diào)控NEK6的表達(dá)；*P<0.05與miR-NC組比較；#P<0.05與anti-miR-NC組比較。

表2 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 抑制NEK6對(duì)腎癌細(xì)胞786-O、ACHN增殖、遷移、侵襲的影響

與si-NC組比較，抑制NEK6明顯減少786-O、ACHN細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)[(96.00±6.89)個(gè)比(187.00±12.80)個(gè)、(102.00±6.74)個(gè)比(167.00±15.53)個(gè)，P<0.05]和侵襲細(xì)胞數(shù)[(59.00±6.14)個(gè)比(108.00±11.50)個(gè)、(63.00±5.28)個(gè)比(90.00±7.23)個(gè)，P<0.05]，以及顯著降低NEK6[(0.41±0.04)比(0.91±0.09)、(0.32±0.03)比(0.80±0.07)，P<0.05]、Cyclin D1[(0.29±0.03)比(0.81±0.08)、(0.34±0.03)比(0.70±0.07)，P<0.05]、MMP-2[(0.44±0.04)比(0.81±0.08)、(0.41±0.04)比(0.78±0.08)，P<0.05]蛋白表達(dá)水平，顯著提高P21[(0.50±0.05)比(0.22±0.02)、(0.51±0.05)比(0.25±0.02)，P<0.05]、E-cadherin[(0.47±0.05)比(0.19±0.02)、(0.48±0.05)比(0.22±0.02)，P<0.05]蛋白水平，并且顯著降低細(xì)胞存活率、克隆數(shù)(P<0.05)。抑制NEK6對(duì)786-O、ACHN細(xì)胞中miR-219-5p表達(dá)無(wú)顯著影響(P>0.05)。見圖4、表3。

A：抑制NEK6對(duì)786-O細(xì)胞遷移侵襲的影響；B：抑制NEK6對(duì)ACHN細(xì)胞遷移侵襲的影響；C：786-O細(xì)胞中Cyclin D1、P21、E-cadherin、MMP-2蛋白的表達(dá)；D：ACHN細(xì)胞中Cyclin D1、P21、E-cadherin、MMP-2蛋白的表達(dá)；*P<0.05與si-NC組比較。

表3 抑制NEK6對(duì)腎癌細(xì)胞786-O、ACHN存活率和克隆數(shù)的影響

2.5 過表達(dá)NEK6能逆轉(zhuǎn)miR-219-5p對(duì)腎癌細(xì)胞786-O、ACHN的增殖

與miR-219-5p和pcDNA3.1共轉(zhuǎn)染比較，miR-219-5p和pcDNA3.1-NEK6共轉(zhuǎn)染的786-O、ACHN細(xì)胞中NEK6[(0.79±0.08)比(0.37±0.04)、(0.75±0.06)比(0.33±0.03)]、Cyclin D1[(0.63±0.06)比(0.13±0.01)、(0.60±0.06)比(0.22±0.02)]蛋白表達(dá)水平顯著增加，P21[(0.33±0.03)比(0.60±0.06)、(0.35±0.03)比(0.56±0.06)]蛋白表達(dá)水平顯著降低，且顯著提高細(xì)胞存活率和克隆數(shù)(P<0.05)，見圖5、表4。

A:786-O細(xì)胞NEK6、Cyclin D1、P21蛋白的表達(dá)；B：ACHN細(xì)胞NEK6、Cyclin D1、P21蛋白的表達(dá)；*P<0.05與miR-219-5p+pcDNA3.1轉(zhuǎn)染比較。

表4 過表達(dá)NEK6能逆轉(zhuǎn)miR-219-5p對(duì)腎癌細(xì)胞786-O、ACHN存活率和克隆數(shù)的影響

2.6 過表達(dá)NEK6能逆轉(zhuǎn)miR-219-5p對(duì)腎癌細(xì)胞786-O、ACHN遷移、侵襲的影響

相比于miR-219-5p和pcDNA3.1共轉(zhuǎn)染，miR-219-5p和pcDNA3.1-NEK6共轉(zhuǎn)染的786-O、ACHN細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)[(171.00±9.78)個(gè)比(88.00±6.36)個(gè)、(150.00±9.95)個(gè)比(91.00±6.13)個(gè)，P<0.05]和侵襲細(xì)胞數(shù)[(97.00±8.94)比(52.00±5.22)個(gè)、(80.00±7.94)比(53.00±5.17)個(gè)，P<0.05]顯著減少，同時(shí)細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)量[(0.29±0.03)比(0.70±0.07)、0.26±0.03)比(0.56±0.05)，P<0.05]顯著降低，MMP-2蛋白水平[(0.68±0.07)比(0.29±0.03)、(0.63±0.06)比(0.39±0.04)，P<0.05]顯著增加，見圖6。

A：過表達(dá)NEK6能逆轉(zhuǎn)miR-219-5p對(duì)腎癌細(xì)胞786-O遷移侵襲的影響；B：過表達(dá)NEK6能逆轉(zhuǎn)miR-219-5p對(duì)腎癌細(xì)胞ACHN遷移侵襲的影響；C:786-O細(xì)胞E-cadherin、MMP-2蛋白的表達(dá)；D：ACHN細(xì)胞E-cadherin、MMP-2蛋白的表達(dá)；*P<0.05與miR-219-5p+pcDNA3.1轉(zhuǎn)染比較。

3 討論

腎癌是泌尿系惡性腫瘤的第二大致死原因。2018年，全球約有40.3萬(wàn)例新的腎癌病例發(fā)生，造成17.5萬(wàn)人死亡[10]。據(jù)統(tǒng)計(jì)[11]，2014年我國(guó)腎癌約有6.83萬(wàn)例新發(fā)病例，2.56萬(wàn)例死亡病例。在過去的30年中，腎癌患者總體5年生存率從50%提高到74%，這種改善主要?dú)w因于腎癌早期診斷的比例不斷增加，而醫(yī)學(xué)成像使用的日益增加促進(jìn)了這種診斷[12-13]。雖然早期發(fā)現(xiàn)有所改善，但晚期或轉(zhuǎn)移性腎癌的治療仍然有限，部分原因是高復(fù)發(fā)率和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，闡明腎癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制，以發(fā)現(xiàn)重要的生物標(biāo)志物并制定新的治療策略具有重要意義。

miRNA在各種類型的癌癥中扮演著癌基因或抑癌基因的角色，在腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和對(duì)化療的敏感性或耐藥方面起著至關(guān)重要的作用[14-16]。據(jù)報(bào)道[17]，miR-219-5p在結(jié)直腸癌等一些人類腫瘤中異常表達(dá)，是潛在的腫瘤抑制劑。miR-219-5p在胃癌組織和細(xì)胞系中明顯低于癌旁組織和正常胃上皮細(xì)胞，miR-219-5p過表達(dá)顯著降低了胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲[18]。miR-219-5p的表達(dá)可通過靶向高遷移率族蛋白A2(HMGA2)抑制卵巢癌細(xì)胞系SKOV3的增殖、侵襲和遷移，并在體內(nèi)顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)[19]。miR-219-5p在黑色素瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)明顯降低，miR-219-5p水平低的患者總體生存率明顯較低，miR-219-5p的上調(diào)通過靶向Bcl-2抑制黑色素瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，增強(qiáng)黑色素瘤細(xì)胞的化學(xué)敏感性[20]。miR-219-5p在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)，過表達(dá)抑制結(jié)直腸癌HCT-8細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲，起到抑癌作用[21]。然而，miR-219-5p在腎癌中的表達(dá)及生物學(xué)功能尚未可知。本研究中，qPCR檢測(cè)數(shù)據(jù)表明，腎癌組織或細(xì)胞中miR-219-5p表達(dá)量明顯減少，過表達(dá)miR-219-5p顯著減少786-O和ACHN細(xì)胞的存活率、克隆數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)，并顯著降低Cyclin D1、MMP-2蛋白表達(dá)，提高P21、E-cadherin蛋白表達(dá)，說(shuō)明與前述報(bào)道相同，miR-219-5p在腎癌中同樣充當(dāng)抑癌基因，可以抑制腎癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，可能有助于為腎癌患者識(shí)別新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

NEK6是一種蛋白激酶，參與細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡、衰老和耐藥等多種細(xì)胞過程，成為新型抗癌藥物開發(fā)的有吸引力的靶標(biāo)[22-23]。HE等[24]采用免疫組織化學(xué)和Western blot方法分析133例乳腺癌標(biāo)本中Nek6的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)與鄰近的非腫瘤組織相比，大多數(shù)乳腺癌標(biāo)本中的NEK6表達(dá)上調(diào)，能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖。徐繼等[25]檢測(cè)到NEK6 mRNA水平在胃癌組織和細(xì)胞內(nèi)明顯高于癌旁組織和正常胃黏膜上皮細(xì)胞，敲減NEK6表達(dá)使胃癌細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯減弱。這些研究表明，NEK6可能作為癌基因促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)中，NEK6蛋白水平在腎癌組織或細(xì)胞中顯著增加，抑制NEK6明顯降低腎癌786-O和ACHN細(xì)胞中Cyclin D1、MMP-2蛋白表達(dá)，顯著提高P21、E-cadherin蛋白水平，并且明顯減少細(xì)胞存活率、克隆數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)，與前人研究[25]相符。

miRNA通過與靶基因特異性結(jié)合，發(fā)揮基因調(diào)控功能。如miR-219-5p在卵巢癌中靶向HMGA2[19]，在黑色素瘤中靶向Bcl-2[20]，參與癌癥病理演進(jìn)過程。在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中，長(zhǎng)鏈非編碼RNA HOXA11-AS可以作為競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA來(lái)抑制miR-506-3p表達(dá)，從而調(diào)節(jié)下游靶基因NEK6[26]。NEK6被證明是miR-23a的靶標(biāo)，介導(dǎo)小檗堿誘導(dǎo)的抗肝癌作用[27]。本研究的生物信息學(xué)和雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)，NEK6是miR-219-5p的下游靶基因，其蛋白水平明顯被miR-219-5p所調(diào)控。進(jìn)一步的功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過表達(dá)NEK6逆轉(zhuǎn)了miR-219-5p抑制腎癌細(xì)胞786-O、ACHN增殖、遷移、侵襲、Cyclin D1、MMP-2蛋白表達(dá)的作用，以及逆轉(zhuǎn)了miR-219-5p促進(jìn)P21、E-cadherin蛋白表達(dá)的作用，說(shuō)明miR-219-5p通過直接靶向調(diào)控NEK6的表達(dá)，從而影響腎癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力。

綜上所述，miR-219-5p在腎癌組織中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)miR-219-5p可以抑制腎癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，其作用機(jī)制與靶向調(diào)控NEK6表達(dá)密切相關(guān)，這為腎癌發(fā)病和轉(zhuǎn)移機(jī)制的深入探索提供了新的思路。