高通量技術(shù)篩選的米托蒽醌促進(jìn)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制

晏毛毛，劉宇華，蔡珊珊，何星星，謝步善

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，南昌 330006)

原發(fā)性肝癌在我國是一類典型惡性腫瘤，其具體機(jī)制依舊不夠清晰，且其發(fā)病率高，治療效果不佳。肝癌的治療方案，當(dāng)前借助的是個體化綜合治療，然而患者5年生存率仍然極低[1]。隨著我國臨床藥理學(xué)的飛速發(fā)展，開發(fā)肝癌新型抗腫瘤藥已越來越受到人們的重視。高通量篩選技術(shù)(high throughout screening，HTS)是新型特異性抗腫瘤藥物篩選的新策略和手段。

筆者前期研究[2]利用3個數(shù)據(jù)庫(Tocriscreen、Prestwick、Selleck Chem)，共有3272個小分子化合物(參選的化合物其生物和藥理特性、安全性和有效性在臨床前期試驗和臨床試驗中，獲得了對應(yīng)的驗證)，將肝癌2種細(xì)胞株(HepG2和Huh7)添加到384孔的篩選化合物板，進(jìn)而利用激光掃描成像儀(acumen?Cellista Laser Scanning Imaging Cytometer)(全孔藥物篩選和細(xì)胞生物學(xué)高內(nèi)涵分析平臺)對上述小分子化合物進(jìn)行了初步篩選，其中對于2種細(xì)胞系生長，起到同時抑制的效果，且z-score<-4的7類hits化合物中，包括常用的抗腫瘤藥物鹽酸米托蒽醌(mitoxantrone hydrochloride,MTX)。然而，MTX對肝癌細(xì)胞增殖抑制的作用機(jī)制仍然不清楚。本研究擬探討不同濃度MTX對肝癌細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用并初步探索其分子機(jī)制，為臨床MTX治療肝癌提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

肝癌HepG2細(xì)胞(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)和分子生物學(xué)系饋贈)；Caspase-3 antibody購自美國CST公司；BCA試劑盒及化學(xué)發(fā)光試劑購自美國PIERCE公司，N1,N2亞甲基雙丙烯酰胺、丙烯酰胺購自美國sigma公司；DMEM購自美國Gibco公司；DMSO購自美國Sigma公司；其他為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

迅速取出HepG2細(xì)胞凍存管，輕輕搖晃，于37 ℃水浴鍋，進(jìn)行細(xì)胞融化；將細(xì)胞懸液以800 r·min-1離心5～10 min，棄去上清液；添加1mLDMEM培養(yǎng)基，其包含10%血清，反復(fù)吹打重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞培養(yǎng)皿，放置于培養(yǎng)箱。等到細(xì)胞到達(dá)對數(shù)期時，棄去培養(yǎng)基，用PBS洗滌1次。加入一定體積的0.25%胰酶于常溫進(jìn)行消化，借助移液管對細(xì)胞進(jìn)行吹打，根據(jù)特定比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，添加DMEM培養(yǎng)基(包含血清)。置培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，展開相關(guān)實驗。

1.3 MTT試驗

將細(xì)胞接種在96孔培養(yǎng)板(104個·孔-1)，每孔培養(yǎng)基總量200 μL，于培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)進(jìn)行為期24 h的培養(yǎng)；將不同濃度的MTX(0、0.5、1、2.5、5、10、20 μmol·L-1)處理肝癌HepG2細(xì)胞，作用24 h，添加MTT液，濃度為2 mg·mL-1，50 μL·孔-1，培養(yǎng)3 h。吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，添加DMSO液(100 μL·孔-1)，將培養(yǎng)板置于微孔板扳蕩器上振蕩，10 min，使結(jié)晶物溶解。于570 nm處，針對各孔OD值，進(jìn)行酶標(biāo)儀檢測。將結(jié)果記錄下來，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測

HepG2細(xì)胞[(5×105)～(1×106)個·mL-1]鋪入6孔板，于培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)培養(yǎng)24 h；20 μmol·L-1MTX處理肝癌HepG2細(xì)胞，作用24 h；取出1 mL細(xì)胞懸液，1000 r·min-1離心10 min，溫度控制在4 ℃，將上清液棄去。添加冷的PBS 1 mL，輕輕震蕩，使得細(xì)胞處于懸浮狀態(tài)，1000 r·min-1離心10 min，溫度控制在4 ℃，將上清液棄去。針對貼壁細(xì)胞，借助胰酶完成消化過程，進(jìn)而借助PBS進(jìn)行洗滌。于Binding Buffer(200 μL)中，進(jìn)行細(xì)胞重懸過程。添加Annexin V-FITC，體積為10 μL，混勻，在避光室溫條件，進(jìn)行30 min的反應(yīng)。添加Binding Buffer，體積為300 μL，進(jìn)而添加5 μL PI，上機(jī)進(jìn)行檢測。

1.5 免疫印跡檢測

HepG2細(xì)胞[(5×105)～(1×106)個·mL-1]鋪入6孔板，于培養(yǎng)箱(37 ℃、5%CO2)培養(yǎng)24 h；5、10、20 μmol·L-1MTX處理肝癌HepG2細(xì)胞，作用24 h，RIPA Lysis Buffer裂解相應(yīng)處理肝癌細(xì)胞后，用95 ℃煮沸，時長5～10 min變性蛋白，采用BCA試劑盒，針對蛋白濃度進(jìn)行相應(yīng)的測定。將15%和10% SDS-PAGE轉(zhuǎn)移至PDVF膜，借助脫脂牛奶，進(jìn)行1 h的常溫封閉，孵一抗，在4 ℃條件下封閉過夜；辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗常溫封閉2 h，針對特異蛋白條帶，借助化學(xué)發(fā)光劑進(jìn)行相應(yīng)的檢測。借助Image Lab軟件，展開灰度分析過程，得到具體數(shù)值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 MTX抑制肝癌細(xì)胞增殖、提高cleaved Caspase-3表達(dá)水平

MTT試驗檢測結(jié)果顯示，MTX抑制肝癌HepG2細(xì)胞增殖和生長，且呈濃度依賴性，其中5、10、20 μmol·L-1MTX處理的肝癌HepG2細(xì)胞增殖抑制率分別為0.69、0.67、0.43；與10 μmol·L-1MTX比較，20 μmol·L-1MTX的增殖抑制率顯著下降(P<0.001)(圖1A)。

細(xì)胞凋亡時Caspase家族是關(guān)鍵元件，前體Caspase-3(pro Caspase-3)經(jīng)酶剪切后成為有活性的Caspase-3(cleaved Caspase-3)，Caspase-3在細(xì)胞凋亡調(diào)控中屬于一類重要的效應(yīng)分子，可作為細(xì)胞凋亡的標(biāo)記分子。免疫印跡檢測結(jié)果顯示，5、10 μmol·L-1MTX作用肝癌細(xì)胞時cleaved Caspase-3輕度升高，其相應(yīng)灰度值為2.25和2.37，而20 μmol·L-1MTX作用時cleaved Caspase-3顯著增高，其灰度值為5.78(圖1B)，與0 μmol·L-1MTX比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。表明MTX抑制肝癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡分子Caspase-3的表達(dá)，提示細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)可能與肝癌細(xì)胞增殖抑制相關(guān)。

A:MTT試驗檢測細(xì)胞增殖；B：免疫印跡檢測檢測cleaved Caspase-3表達(dá)水平。

2.2 MTX促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡

光學(xué)顯微鏡下觀察顯示，20 μmol·L-1MTX作用于HepG2細(xì)胞后，呈現(xiàn)出變圓、皺縮、脫落狀態(tài)，飄浮在培養(yǎng)基中(圖2A)，提示20 μmol·L-1MTX誘導(dǎo)肝癌HepG2凋亡。Annexin V FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，20 μmol·L-1MTX誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率為21.12%，0 μmol·L-1MTX細(xì)胞凋亡率為9.07%，二者相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2B)，結(jié)果表明MTX誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞凋亡產(chǎn)生。

A:光學(xué)顯微鏡下的細(xì)胞凋亡；B：AnnexinV-FITC/PI雙熒光流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡。

3 討論

當(dāng)前，抗腫瘤藥物的研究過程中，HTS的應(yīng)用較為廣泛。筆者前期研究[2]借助3個數(shù)據(jù)庫進(jìn)行小分子化合物的初篩過程，z-score小于-4的hits化合物7種，包括常用于血液系統(tǒng)腫瘤的藥物米托蒽醌MTX，研究證實HTS可以快速獲得有效的新型抗腫瘤藥物，可為將來快速研發(fā)抗肝癌藥物打下扎實的基礎(chǔ)。

MTX是一種蒽醌抗腫瘤新藥，且在臨床上較為常用，對惡性淋巴瘤等具備一定程度的治療效果。MTX作用機(jī)制為：DNA進(jìn)行結(jié)合，在核酸合成過程中起到抑制效果，引發(fā)細(xì)胞死亡，為細(xì)胞周期非特異性藥物。本研究發(fā)現(xiàn)不同濃度的MTX會抑制肝癌細(xì)胞的增殖，其中高濃度(20 μmol·L-1)較為顯著。細(xì)胞死亡被分為3類，即細(xì)胞凋亡、壞死及自噬性死亡。第3類定義為Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，區(qū)別于細(xì)胞凋亡[3]。本研究顯示高濃度MTX可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，其抗肝癌作用與其相關(guān)。筆者觀察到不同濃度MTX對肝癌細(xì)胞生長增殖的作用機(jī)制不盡相同，低濃度米托蒽醌主要促進(jìn)自噬死亡從而產(chǎn)生抗腫瘤作用，高濃度的米托蒽醌卻以促進(jìn)細(xì)胞凋亡從而發(fā)揮抗腫瘤作用。筆者前期研究[4]顯示，低濃度如5 μmol·L-1MTX細(xì)胞凋亡較少出現(xiàn)，主要以誘導(dǎo)自噬性死亡為主，而10 μmol·L-1MTX的抗腫瘤機(jī)制與前者相似；而濃度高達(dá)20 μmol·L-1時，米托蒽醌則會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡出現(xiàn)。細(xì)胞凋亡并非被動過程，該過程包括了基因調(diào)控過程，其目的是為了對環(huán)境有更好的適應(yīng)性。既往筆者研究[5]苦參堿抗肝癌的作用機(jī)制得到類似結(jié)果，研究發(fā)現(xiàn)低劑量苦參堿誘導(dǎo)肝癌HepG2和SMMC-7721細(xì)胞系自噬性死亡，幾乎凋亡無誘導(dǎo)；高劑量苦參堿誘導(dǎo)自噬性死亡和凋亡同時出現(xiàn)，以凋亡為主。自噬性死亡可以通過相應(yīng)調(diào)控機(jī)制轉(zhuǎn)化為細(xì)胞凋亡。低濃度的MTX通過自噬性死亡發(fā)揮抗腫瘤作用，可呈現(xiàn)，或者不呈現(xiàn)凋亡標(biāo)志。于特定狀況下，于自噬和凋亡兩者當(dāng)中，細(xì)胞會選取出相應(yīng)的死亡途徑。

細(xì)胞凋亡的過程涉及了Caspase-3家族等。凋亡是不同死亡信號刺激后發(fā)生的一系列由細(xì)胞內(nèi)源性基因、酶類和信號傳導(dǎo)途徑調(diào)控的過程，借助下游基因內(nèi)源性基因可直接控制細(xì)胞凋亡；而細(xì)胞外部因素可間接影響細(xì)胞凋亡。米托蒽醌促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制知之甚少。本研究利用免疫印跡法觀察到用MTX處理肝癌細(xì)胞后會顯著增加切割后的Caspase-3蛋白酶活性，并且該活性具有濃度依賴性，這表明MTX誘導(dǎo)Caspase-3蛋白酶依賴的肝癌細(xì)胞凋亡。筆者由此判斷米托蒽醌作用肝癌細(xì)胞時，Caspase通過與特異的輔因子結(jié)合而激活，進(jìn)而通過有序切割、激活效應(yīng)，最終激活Caspase-3蛋白酶，且將其他蛋自酶作切割底物，使得細(xì)胞凋亡。筆者推測Caspase-3是一種效應(yīng)分子，是級聯(lián)反應(yīng)的核心，在MTX誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中，也是較為關(guān)鍵的步驟。