復(fù)方雪蓮燒傷膏對深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合的作用及機制

任雨潔，羅錦花，詹劍華

(南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院燒傷科，南昌 330006)

燒傷是臨床上較為常見的外傷，燒傷創(chuàng)面愈合是一個極其復(fù)雜的生物過程，有效地修復(fù)創(chuàng)面一直是臨床外科相關(guān)研究的重點之一。傳統(tǒng)中醫(yī)藥作為我國的民族瑰寶及文化遺產(chǎn)，在創(chuàng)面修復(fù)治療方面歷史悠久，中醫(yī)的“祛腐生肌”理論一直指導(dǎo)著中醫(yī)外科的臨床研究與經(jīng)驗傳承，復(fù)方雪蓮燒傷膏是中藥和藏藥相結(jié)合的燒傷治療藥膏，有促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用，臨床上多用于燒燙傷的創(chuàng)面治療[1]。本研究采用大鼠深Ⅱ度燙傷模型，探討復(fù)方雪蓮燒傷膏對深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合的作用及其機制，報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及藥品

選取70只成年清潔級SD大鼠,雌雄各35只,體重(210±20)g,由南昌大學(xué)江西醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。分籠飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度為20～25 ℃，自由攝食。復(fù)方雪蓮燒傷膏：福建省三明天泰制藥有限公司；燒傷濕潤膏：汕頭市美寶制藥有限公司；凡士林：南昌白云藥業(yè)有限公司。

1.2 建模方法

采用隨機數(shù)字表法將SD大鼠分成4組：A組(假燙傷組)10只、B組(單純燙傷組)20只、C組(燒傷濕潤膏陽性對照組)20只、D組(復(fù)方雪蓮燒傷膏組)20只。致傷前12 h禁食，腹腔注射5%鹽酸胺碘酮(2 mL·kg-1)，待充分麻醉后，背部去毛，稱重，108 ℃、時間設(shè)計為4 s蒸汽燙傷，造成約10%的燙傷創(chuàng)面。傷后1 h，取創(chuàng)面皮膚組織做HE染色，觀察是否形成深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面。傷后經(jīng)腹腔注射乳酸林格液(40 mL·kg-1)，避免大鼠傷后因休克死亡。于造模后第4、7、10、14天，B、C、D組各取5只活殺取材，A組活殺2只取材，備用。

1.3 給藥方法

每天上、下午定時換藥2次，創(chuàng)面用生理鹽水清洗后，分別外敷給藥，B組給予創(chuàng)面外敷凡士林厚度約2 mm；C組給予創(chuàng)面外敷燒傷濕潤膏厚度約2 mm；D組給予創(chuàng)面外敷復(fù)方雪蓮燒傷膏厚度約2 mm；再用消毒紗布包扎固定。A組不做任何處理。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測方法

觀察各組創(chuàng)面愈合時間和創(chuàng)面愈合率，檢測各觀察時點的創(chuàng)面組織含水量、CD68巨噬細(xì)胞含量、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、VEGFmRNA相對表達(dá)量以及bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平。

創(chuàng)面愈合率:在大鼠燒傷后的第4、7、10、14天使用滌綸投影膜描計創(chuàng)面大小,利用圖像分析軟件計算出創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率=[(原始創(chuàng)面面積-殘余創(chuàng)面面積)/原始創(chuàng)面面積]×100%[2]。

創(chuàng)面組織含水量:分別在各時相點取燙傷大鼠創(chuàng)面全程皮膚,先用濾紙把血液吸干,稱濕重,再將皮膚組織用80 ℃烤箱烘烤24 h,稱干重。創(chuàng)面組織含水量=[(濕重-干重)/干重]×100%。

CD68巨噬細(xì)胞含量和不同時間點創(chuàng)面組織中VEGF表達(dá)：采用免疫組織化學(xué)方法檢測。

創(chuàng)面組織中VEGFmRNA的相對表達(dá)量：采用逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法檢測。

B、C、D組創(chuàng)面組織及A組皮膚組織中bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平：采用蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合時間比較

D組創(chuàng)面愈合時間為(18.4±2.1)d，短于C組的(19.8±1.7)d以及B組的(22.08±1.2)d，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 各組深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面愈合率比較

D組創(chuàng)面愈合率明顯高于B、C組(P<0.05)，見表1。

2.3 各組深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面組織含水量比較

D組創(chuàng)面組織含水量明顯少于B、C組(P<0.05)，見表2。

表2 各組深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面組織含水量比較

2.4 各組CD68巨噬細(xì)胞含量比較

D組的CD68巨噬細(xì)胞含量低于A組，高于B、C組(P<0.05)，說明D組的CD68巨噬細(xì)胞含量調(diào)控在一定范圍內(nèi)。見表3。

表3 各組CD68巨噬細(xì)胞含量比較 個·視野-1

2.5 各組創(chuàng)面組織VEGF含量比較

D組創(chuàng)面組織VEGF含量明顯高于A、B、C組(P<0.05)，見表4。

表4 各組創(chuàng)面組織VEGF含量比較陽性信號數(shù)/400×光鏡視野

2.6 各組創(chuàng)面組織中VEGFmRNA的相對表達(dá)量

D組創(chuàng)面組織中VEGFmRNA的相對表達(dá)量明顯高于A、B、C組(P<0.05)，見表5。

表5 各組創(chuàng)面組織中VEGFmRNA的相對表達(dá)量拷貝數(shù)·g-1

2.7 各組創(chuàng)面組織bcl-2蛋白表達(dá)水平

D組的bcl-2蛋白表達(dá)水平高于A、B、C組(P<0.05)，見表6。

表6 各組創(chuàng)面組織bcl-2蛋白表達(dá)水平

2.8 各組創(chuàng)面組織Bax蛋白表達(dá)水平

D組的Bax蛋白表達(dá)水平低于A、B、C組(P<0.05)，見表7。

表7 各組創(chuàng)面組織Bax蛋白表達(dá)水平

3 討論

燒傷是全球范圍內(nèi)的四大外傷之一,嚴(yán)重影響著人們的日常生活。燒傷創(chuàng)面因其嚴(yán)重程度不同,愈合時間也不相同,深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面較深，傷及真皮乳頭層以下但仍殘留部分真皮層，創(chuàng)面愈合依靠創(chuàng)面邊沿和燒傷區(qū)殘留的皮膚附件上皮增殖形成上皮小島，皮島再拓展覆蓋創(chuàng)面。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)促進(jìn)燒傷創(chuàng)面愈合的手段主要為應(yīng)用細(xì)胞因子、研制與應(yīng)用新型敷料、應(yīng)用組織工程皮膚等以及物理治療。但這些方法各有利弊。對于選擇保守治療的患者,外用藥物的選擇是創(chuàng)面愈合以及治療結(jié)局的關(guān)鍵。濕潤燒傷膏是治療燒傷的經(jīng)典藥物,外部涂抹后通過促進(jìn)肉芽組織增殖分化等機制促進(jìn)創(chuàng)面愈合[3]。復(fù)方雪蓮燒傷膏是根據(jù)中醫(yī)醫(yī)學(xué)理論研制而成,主要含有雪蓮花、西紅花、熊膽、麝香、紫草、冰片等中藥,這些藥物聯(lián)合使用可以達(dá)到去腐生肌、消腫止痛和抗炎抑菌的作用,還可以使創(chuàng)面滲出減少,具有較強的收斂效果[4]。本研究結(jié)果顯示,復(fù)方雪蓮燒傷膏較之濕潤燒傷膏在縮短創(chuàng)面愈合時間和減少滲出方面有一定的改善,組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義。眾所周知,血管生成與重建是創(chuàng)面愈合的兩個關(guān)鍵因素,而VGEF作為血管形成中不可忽視的刺激因子細(xì)胞，影響著血管生成過程，并在此過程中發(fā)揮著中樞性的調(diào)控作用；另一方面,細(xì)胞凋亡是創(chuàng)面愈合中一種重要的生物學(xué)現(xiàn)象,而在此調(diào)控過程中bcl-2家族起到了關(guān)鍵性作用，其中bcl-2蛋白起到抑制凋亡作用,而Bax蛋白是促進(jìn)凋亡蛋白。巨噬細(xì)胞被稱為創(chuàng)面修復(fù)的“調(diào)控細(xì)胞”,不僅可以清除壞死細(xì)胞、趨化修復(fù)細(xì)胞，還可以刺激新生毛細(xì)血管形成以及成纖維細(xì)胞增殖。CD68是巨噬細(xì)胞重要膜表面分子,可標(biāo)志著巨噬細(xì)胞的存在。

相關(guān)研究[5]表明,在深Ⅱ度燒傷治療中,復(fù)方雪蓮燒傷膏可減少創(chuàng)面滲液量,促進(jìn)創(chuàng)面愈合,減少瘢痕的發(fā)生,且安全性良好。本研究表明,D組愈合時間短于B、C組(P<0.05)，創(chuàng)面愈合率D組(79.8%)明顯高于C組(48.6%)(P<0.05)，D組創(chuàng)面組織含水量明顯少于B、C組(P<0.05)，與上述研究[5]結(jié)果一致。A組皮膚組織同B、C、D組燒傷創(chuàng)面組織VEGF含量以及VEGFmRNA表達(dá)量相比,D組明顯高于其余3組(P<0.05)；D組的bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯高于其余各組(P<0.05),而Bax蛋白表達(dá)水平低于其余各組(P<0.05)。目前人們對巨噬細(xì)胞在創(chuàng)面修復(fù)過程中所起作用意見不一,部分研究[6]表明巨噬細(xì)胞可以促進(jìn)創(chuàng)面愈合,而MORSI等[7]認(rèn)為巨噬細(xì)胞通過引起炎癥反應(yīng)而不利于創(chuàng)面愈合。本研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方雪蓮燒傷膏對巨噬細(xì)胞的數(shù)量有影響,可調(diào)控巨噬細(xì)胞數(shù)量在一定范圍從而參與燒傷創(chuàng)面愈合過程。本研究運用多種現(xiàn)代科學(xué)技術(shù),探討了復(fù)方雪蓮燒傷膏促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機制,為該藥在臨床的應(yīng)用提供依據(jù),為促進(jìn)創(chuàng)面愈合提供治療手段。本研究僅在新鮮創(chuàng)面上進(jìn)行實驗,而臨床上多存在經(jīng)久不愈的創(chuàng)面,且復(fù)方雪蓮燒傷膏針對難愈性創(chuàng)面的療效和機制如何，尚無詳細(xì)報道，故計劃在未來進(jìn)行拓展研究。

綜上所述,復(fù)方雪蓮燒傷膏治療深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面是通過調(diào)控巨噬細(xì)胞含量,促進(jìn)VEGF分泌、VEGFmRNA的表達(dá),上調(diào)bcl-2的同時下調(diào)Bax蛋白來減少創(chuàng)面滲液量,從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。