miR-124誘導(dǎo)糖尿病性白內(nèi)障患者晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的作用及機制

陳祎祎，彭建軍

(武漢科技大學(xué)附屬普仁醫(yī)院眼科，武漢 430081)

白內(nèi)障是世界上致盲率居首位眼病，同時也是糖尿病的常見并發(fā)癥，是造成糖尿病患者視力下降以及失明的重要原因[1-2]。白內(nèi)障的主要病理過程包括晶狀體上皮細(xì)胞(LEC)受到活性氧或紫外線等氧化應(yīng)激損傷，隨后LEC功能失調(diào)并發(fā)生細(xì)胞凋亡，繼而晶狀體內(nèi)環(huán)境的平衡被破壞，最終導(dǎo)致晶狀體混濁[3]。近年來隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，大量研究[4-5]表明miRNA參與調(diào)控LEC細(xì)胞的細(xì)胞功能，并參與白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展。本研究基于生物信息學(xué)分析與細(xì)胞試驗，探討晶狀體上皮細(xì)胞高表達(dá)的miR-124在糖尿病性白內(nèi)障發(fā)病進(jìn)程中的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

人LEC細(xì)胞系(HLE-B3，豐暉生物科技有限公司)，90%高糖DMEM+10%FBS(美國Gibco公司)，引物序列(上海生工科技公司)，miR-124 inhibitor、dsControl、dsBcl-2-640(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，轉(zhuǎn)染試劑盒(Lipofectamine 2000，美國Invitrogen公司)，mirVan miRNA分離試劑(美國Ambion公司),miRNeasy Mini試劑盒(德國Qiagen公司)，miRCURY Hy3/Hy5 Power 標(biāo)記試劑盒(丹麥Exiqon公司)。

1.1.2 標(biāo)本來源

根據(jù)分層抽樣法選取糖尿病性白內(nèi)障眼10例(男5例、女5例)與健康捐獻(xiàn)眼(健康對照眼，尸眼)4例晶狀體前囊膜，排除黃斑變性、玻璃體積血或繼發(fā)于視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜病變的黃斑水腫、高度近視以及高血壓、心肺肝腎功能障礙、惡性腫瘤或其他腦部疾病者。另外健康眼捐獻(xiàn)者同時排除糖尿病或內(nèi)眼手術(shù)史。所有自愿參與本試驗的志愿者或家屬均已簽署書面知情同意書，全部試驗流程遵守《赫爾辛基宣言》的原則進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取、文庫制備、測序

使用mirVan miRNA分離試劑分離標(biāo)本總RNA，隨后使用miRNeasy Mini試劑盒進(jìn)行純化，將分離出的RNA通過Nanodrop光譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)進(jìn)行量化。提純后的RNA用干冰冷凍，保存在-80 ℃。使用miRCURY Hy3/Hy5 Power標(biāo)記試劑盒制備miRNA標(biāo)記，將純化后的RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補DNA(cDNA)，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。構(gòu)建NEBNext Ultra RNA定向文庫，使用Illumina HiSeq4000平臺進(jìn)行測序[6]：1)將總RNA(1 g)溶于Nebnext第一鏈合成反應(yīng)緩沖液中，剪切成200～500個核苷酸片段，利用這些片段生成雙鏈cDNA；2)對cDNA進(jìn)行末端修復(fù)，并用Illumina特異性適配器連接；3)用200 bp堿基對文庫進(jìn)行大小篩選，選擇合適的片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增；4)用Phusion High-Fidelity DNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增，用QIAquick Nucleotide Removal試劑盒進(jìn)行純化。用Illumina hiseq 4000系統(tǒng)基于2×50堿基配對末端讀長測序?qū)NA文庫進(jìn)行測序。Fastx-toolkit軟件(ver.0.0.13，http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit)被用來從原始數(shù)據(jù)中去除3′引物。此外，質(zhì)量分?jǐn)?shù)<20的堿基被淘汰。如果一個序列中30%堿基被剔除，整個序列就會被丟棄，不再進(jìn)行進(jìn)一步的分析。對2組樣本表達(dá)miRNA作歸一化處理后，歸一化每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取reads(TPM)[7]=(miRNA表達(dá)量/樣品總表達(dá)量)×106。

1.2.2 生物信息學(xué)分析

依次使用cutadapt軟件、DCC軟件(v0.4.4)、STAR(v2.51 b)、miRBase數(shù)據(jù)庫和miRWalk數(shù)據(jù)庫對所測得的miRNA進(jìn)行注釋。隨后使用edgeR軟件(v3.16.5)對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，篩選差異表達(dá)miRNA。使用F檢驗比較糖尿病性白內(nèi)障眼和健康對照眼的miRNA豐度差異。在fold-change≥2.0，且P值<0.05的條件下篩選出顯著差異表達(dá)的miRNAs。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及分組

LEC細(xì)胞使用90%高糖DMEM+10%FBS+雙抗培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)。dsRNA轉(zhuǎn)染前1 d，將細(xì)胞以50%～60%的密度接種在不含抗生素的培養(yǎng)基中。根據(jù)Lipofectamine 2000(Invitrogen)說明書進(jìn)行dsRNA轉(zhuǎn)染或miRNA inhibitor質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。

分組：設(shè)置空白對照組、dsControl(與所有已知人類序列缺乏顯著同源性的對照dsRNA)轉(zhuǎn)染組、miR-124 inhibitor組(轉(zhuǎn)染miR-124 inhibitor)、dsBcl-2-640(與預(yù)測的miR-124在Bcl-2啟動子的靶位點完全互補的另一個dsRNA分子)轉(zhuǎn)染組、miR-124 inhibitor+dsBcl-2-640共轉(zhuǎn)染組。

1.2.4 qRT-PCR

使用RNeasy micro kit(QIAGEN)提取總RNA，并用SuperScriptII試劑盒(Invitrogen)合成cDNA。使用qPCR SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems)在CFX 96實時PCR系統(tǒng)(TaKaRa)上進(jìn)行qRT-PCR，并以GAPDH作為內(nèi)參，使用2-ΔΔCT法計算相對表達(dá)量。miR-124引物：5′-GCCCTGGCAGTGTCTTAG-3′；5′-CAGTGCGTGTCGTGGAG T-3′。Bcl-2引物：5′-CCTTGTACCTGACCATGTCAACA-3′；5′-CCTGGGAGGCATAGA-CCATGTA-3′。GAPDH引物：5′-GGCCTCCAAGGAGTAAGACC-3′；5′-AGGGGAGATTCAGTGTGGTG-3′。

1.2.5 Western Blot

使用RIPA裂解緩沖液(Thermo Fisher Scientific)從LEC細(xì)胞提取總蛋白。通過BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(CoWin Biotechnology)檢測蛋白質(zhì)濃度。使用40 μg總蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳，隨后將總蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Millipore)。然后將PVDF膜用5%牛奶封閉4 h，隨后使用TBST清洗5 min×3次，最后將PVDF膜與一抗4 ℃過夜孵育。次日，將PVDF膜用TBST清洗5 min×3次，并與二抗常溫孵育2 h。孵育完成后，再次將PVDF膜用TBST清洗5 min×3次，并使用ECL發(fā)光液(Millipore)進(jìn)行檢測，并計算各蛋白的表達(dá)量。

1.2.6 凋亡檢測

將上述各組細(xì)胞培養(yǎng)在35.5 mmol·L-1高糖環(huán)境中48 h，使用Annexin V/FITC和PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Invitrogen)和流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞凋亡。將轉(zhuǎn)染的LEC細(xì)胞用胰蛋白酶消化、收獲、洗滌并用100 μL結(jié)合緩沖液重懸，使細(xì)胞最終濃度為1×106個·L-1。然后將細(xì)胞用5 μL的Annexin V/FITC染色，然后用1 μL的PI染色，并在室溫下避光孵育15 min。通過FACSCalibur流式細(xì)胞儀(FACScalibur)分析細(xì)胞凋亡率。

1.2.7 統(tǒng)計學(xué)方法

統(tǒng)計分析采用SPSS17.0軟件進(jìn)行，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用非配對t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-124在糖尿病性白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜中高表達(dá)

高通量測序結(jié)果顯示，在糖尿病性白內(nèi)障眼和健康對照眼晶狀體前囊膜標(biāo)本中共檢測到37 767種miRNAs。其中2組有1275個差異表達(dá)的miRNAs(變化倍數(shù)≥2，P<0.05)。在差異表達(dá)的miRNAs中，糖尿病性白內(nèi)障組有627個上調(diào)，648個明顯下調(diào)，其中糖尿病性白內(nèi)障眼和健康對照眼miR-124豐度值(TPM)分別為281 208和64 669(變化倍數(shù)：2.26，P<0.05)，是上調(diào)最為顯著的miRNAs之一，見圖1。

2.2 miR-124與Bcl-2表達(dá)在糖尿病性白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜中呈負(fù)相關(guān)

凋亡在白內(nèi)障發(fā)病過程中起重要作用，因此本試驗通過qRT-PCR檢測了miR-124與Bcl-2這一凋亡抑制蛋白的相關(guān)性。結(jié)果顯示，miR-124與Bcl-2相對表達(dá)量分別為(0.537±0.068)和(1.621±0.424)，兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.872 9，P=0.023 7)，見圖2。

圖2 qRT-PCR法檢測miR-124與Bcl-2表達(dá)相關(guān)性

2.3 miR-124可與Bcl-2啟動子序列中相對于轉(zhuǎn)錄起始位點的核苷酸-645處結(jié)合

本試驗使用RegRNA軟件(http://regrna.mbc.nctu.edu.tw)搜索miR-124與Bcl-2的mRNA、靶基因以及調(diào)控序列中的互補結(jié)合位點。結(jié)果顯示miR-124與Bcl-2啟動子中相對于轉(zhuǎn)錄起始位點的核苷酸-645處序列高度互補，見圖3。

A：Bcl-2啟動子、CpG島以及miR-124預(yù)測結(jié)合位點的示意圖；B：結(jié)合位點位于相對于轉(zhuǎn)錄起始位點的核苷酸-645處；粗體部分表示啟動子DNA有義鏈中的靶位點；紅色部分為miR-124中與靶位點互補的堿基(包括擺動配對)。

2.4 miR-124通過與Bcl-2啟動子序列結(jié)合進(jìn)而下調(diào)Bcl-2的表達(dá)

為進(jìn)一步驗證miR-124可與Bcl-2啟動子序列結(jié)合進(jìn)而下調(diào)Bcl-2的表達(dá)，本試驗合成了與預(yù)測的miR-124在Bcl-2啟動子的靶位點完全互補的另一個dsRNA分子(dsBcl-2-640)。此外還設(shè)計并合成了一種與所有已知人類序列缺乏顯著同源性的對照dsRNA(dsControl)，見圖4A—B。

試驗分別將這2種dsRNA轉(zhuǎn)染到LEC中，并在72 h后分析了Bcl-2蛋白的表達(dá)。Western Blot結(jié)果顯示，與空白對照組相比，dsBcl-2-640組LEC細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)被沉默[(0.22±0.03)比(0.41±0.04)，P<0.05]，而下調(diào)miR-124表達(dá)則可顯著提高高糖培養(yǎng)條件下LEC中Bcl-2的表達(dá)[(0.91±0.09)比(0.41±0.04)，P<0.05]。此外dsControl組與空白對照組相比，Bcl-2蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義[(0.44±0.03)比(0.41±0.04)，P>0.05]。值得注意的是，miR-124 inhibitor和dsBcl-2-640對LEC進(jìn)行共轉(zhuǎn)染時，并沒有進(jìn)一步增加Bcl-2蛋白的表達(dá)[(0.37±0.03)比(0.41±0.04)，P=0.76]，這意味著2種dsRNA分子對Bcl-2啟動子的靶位點彼此呈競爭性結(jié)合，也就是說二者實際上都靶向相同的位點。見圖4C—D。

A：miR-124的序列和結(jié)構(gòu)，紅色序列對應(yīng)于與目標(biāo)位點互補的堿基；B：dsBcl-2-640的序列和結(jié)構(gòu)；C：使用50 nmol·L-1的dsRNA轉(zhuǎn)染LEC細(xì)胞72 h，利用Western Blot，以GAPDH為內(nèi)參評估Bcl-2的表達(dá)量；D：轉(zhuǎn)染LEC細(xì)胞后，Western Blot的定量分析；*P<0.05與空白對照組相比。

2.5 miR-124通過與Bcl-2啟動子序列結(jié)合進(jìn)而促進(jìn)LEC細(xì)胞凋亡

將各組細(xì)胞培養(yǎng)在高糖環(huán)境中48 h，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測LEC細(xì)胞凋亡率。結(jié)果顯示，與空白對照組相比，miR-124 inhibitor組LEC細(xì)胞凋亡率顯著降低[(11.33±1.86)%比(25.81±2.33)%，P<0.05]，dsBcl-2-640組LEC細(xì)胞凋亡率顯著增加[(32.30±4.54)%比(25.81±2.33)%，P<0.05]。然而miR-124 inhibitor和dsBcl-2-640對LEC進(jìn)行共轉(zhuǎn)染時，并沒有進(jìn)一步影響LEC細(xì)胞凋亡率[(23.20±4.30)%比(25.81±2.33)%，P>0.05)]。此外dsControl組與空白對照組相比差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義[(24.80±3.59)%比(25.81±2.33)%，P>0.05)]，見圖5。說明干擾Bcl-2表達(dá)后會逆轉(zhuǎn)miR-124 inhibitor抗凋亡作用，這也提示了2種dsRNA分子實際上都靶向相同的位點。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組LEC細(xì)胞凋亡率

*P<0.05與空白對照相比。

3 討論

miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為19～25個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，具有與靶基因的3’端非翻譯區(qū)結(jié)合從而抑制mRNA翻譯或促進(jìn)mRNA降解的能力[5]。隨著下一代測序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，miRNA已成為國內(nèi)外研究的熱點。而miRNA在白內(nèi)障發(fā)病機制中的作用也受到了越來越多的關(guān)注，其中尤其以miRNA對靶基因的負(fù)調(diào)控最為多見。如MiR-30a可以抑制晶狀體上皮細(xì)胞中BECN1的表達(dá)[8]、miR-34a可以抑制晶狀體上皮細(xì)胞中E2F3的表達(dá)[9]、miR-204可以抑制晶狀體上皮細(xì)胞中TRPM3的表達(dá)[10]。隨后PLACE等[11]發(fā)現(xiàn)并證實了miRNA不僅可以抑制靶基因的表達(dá)，而且也可以通過與靶基因的啟動子序列結(jié)合從而上調(diào)靶基因的表達(dá)。

miRNA具有物種間保守性的同時，也表現(xiàn)出組織和細(xì)胞表達(dá)的特異性[12]。在本研究中，通過高通量測序，發(fā)現(xiàn)miR-124在糖尿病性白內(nèi)障患者晶狀體前囊膜中表達(dá)上調(diào)。據(jù)既往研究[13-18]報道，miR-124的主要功能與凋亡有關(guān)，但其效應(yīng)機制存在組織特異性。如：在心肌梗死的發(fā)病機制中，miR-124通過靶向SphK1促進(jìn)心肌細(xì)胞的凋亡[13]；在冠狀動脈粥樣硬化的發(fā)病機制中，miR-124可下調(diào)小鼠MEKK3表達(dá)，抑制p38MAPK信號通路表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡[14]。此外，miR-124還可通過抑制PI3K/AKT信號通路，促進(jìn)活性氧(ROS)的產(chǎn)生，最終誘導(dǎo)腦血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[15]。CHE等[16]的研究顯示miR-124還可通過激活Wnt/β-catenin信號通路抑制大鼠神經(jīng)元凋亡。SHAO等[17]的研究也表明了miR-124對大鼠神經(jīng)元凋亡有保護(hù)作用。陳艷文[18]的研究結(jié)果表明miR-124在中青年及老年白內(nèi)障患者晶狀體中高表達(dá)，然而目前尚無研究闡明miR-124對LEC凋亡的影響，因此本試驗以miR-124為出發(fā)點探討其在糖尿病性白內(nèi)障發(fā)病過程中的作用。

通過qRT-PCR的相關(guān)性分析，本研究發(fā)現(xiàn)miR-124與Bcl-2這一凋亡抑制蛋白的表達(dá)有較強的負(fù)相關(guān)性。這提示了miR-124可能是通過調(diào)控Bcl-2啟動子序列從而下調(diào)了Bcl-2表達(dá)。于是，本研究對Bcl-2啟動子序列與miR-124的序列進(jìn)行了比對，發(fā)現(xiàn)二者存在高度互補區(qū)。進(jìn)一步細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗的Western Blot結(jié)果顯示，在LEC細(xì)胞中下調(diào)miR-124可顯著上調(diào)Bcl-2的表達(dá)。這證實了miR-124具有抑制Bcl-2表達(dá)的作用。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步利用高糖環(huán)境誘導(dǎo)LEC細(xì)胞凋亡，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，下調(diào)miR-124表達(dá)可以顯著降低LEC細(xì)胞在氧化應(yīng)激條件下的凋亡率，而dsBcl-2-640則可進(jìn)一步上調(diào)LEC細(xì)胞在高糖環(huán)境中的凋亡，說明dsBcl-2-640與miR-124 inhibitor生物學(xué)作用相反。這也證明了miR-124可通過靶向Bcl-2啟動子中相對于轉(zhuǎn)錄起始位點的核苷酸-645處序列參與抑制糖尿病性白內(nèi)障患者LEC細(xì)胞凋亡。既往針對miR-124功能的研究[19-20]揭示了其針對不同的細(xì)胞類型即可促進(jìn)凋亡也可抑制凋亡，因此盡管本研究揭示了miR-124抑制LEC細(xì)胞凋亡的一個途徑，但并未排除miR-124通過其他途徑發(fā)揮對LEC細(xì)胞凋亡調(diào)控作用的可能[21]，也不排除miR-124是通過多條途徑保持LEC細(xì)胞凋亡動態(tài)平衡的一個調(diào)控分子的可能性[22]。

本研究表明在糖尿病性白內(nèi)障發(fā)生時，下調(diào)miR-124可能起到延緩糖尿病性白內(nèi)障病情發(fā)展的作用，其作用機制之一可能與減弱對Bcl-2表達(dá)的影響有關(guān)，因此miR-124/Bcl-2軸有望成為糖尿病性白內(nèi)障預(yù)防和治療的潛在靶點。研究補充了人們對miR-124在糖尿病性白內(nèi)障發(fā)病機制中作用的認(rèn)識。