基于lncRNA/GABAA受體探討產(chǎn)后抑郁的發(fā)病及干預(yù)機制

冀 荔，王烈宏，劉淑敏

(青海紅十字醫(yī)院a.婦產(chǎn)科； b.檢驗科，西寧 810000)

產(chǎn)后抑郁癥(PPD)是一種以產(chǎn)褥期持續(xù)抑郁為特征的精神障礙，主要表現(xiàn)為抑郁、失眠、焦慮、悲傷、內(nèi)疚、易怒甚至自殺傾向[1]。PPD不僅影響產(chǎn)婦的身心健康，而且剝奪了母親對嬰兒的有效照顧[2]。因此，探討PPD的病理機制，尋找其發(fā)展的關(guān)鍵目標，是一個重要而緊迫的課題。過去幾十年基因組測序技術(shù)的改進使轉(zhuǎn)錄本發(fā)現(xiàn)達到了革命性的規(guī)模。蛋白質(zhì)編碼序列僅占人類基因組的2%，大量非編碼序列被轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA(ncRNA)，在許多生物過程的調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。長非編碼RNA(lncRNA)是一種長度超過200 nt的非編碼RNA，大量存在于大腦中(占所有l(wèi)ncRNA的40%)，并在哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)中顯示出精確調(diào)控的表達模式[3]。有研究[4]表明lncRNA可能參與抑郁癥的病理生理過程。然而，lncRNA對PPD的調(diào)節(jié)作用目前還未見報道。本研究制備了激素模擬妊娠誘導(dǎo)的PPD小鼠模型，之后將MAGI2-AS3鑒定為PPD模型中異常高表達的lncRNA。MAGI2-AS3為多種疾病中細胞活力的調(diào)節(jié)劑，但其與PPD發(fā)病機制之間的確切關(guān)聯(lián)在很大程度上仍然未知[5]。此外，綜合生物信息分析和表達譜檢測表明在PPD模型中存在推定的MAGI2-AS3/miR-330/γ-氨基丁酸A(GABAA)相互作用。因此，本研究旨在誘導(dǎo)這些分子的表達改變以探測它們在PPD發(fā)病和發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1.1 小鼠和PPD模型建立

C57BL/6J小鼠(雌性，3月齡)購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。小鼠飼養(yǎng)于環(huán)境溫度為(22±2)℃和12:12 h光/暗循環(huán)的房間內(nèi)自由獲取食物和水。參照文獻[6]方法將3月齡的雌性C57BL/6J小鼠建立激素模擬妊娠誘導(dǎo)的PPD模型。在1%戊巴比妥鈉(60 mg·kg-1，i.p.)麻醉下使用無菌技術(shù)對小鼠進行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，并放置7 d。將去卵巢的小鼠皮下注射苯甲酸雌二醇(20 μg·kg-1)和黃體酮(32 mg·kg-1)，每天1次，連續(xù)16 d。然后停用黃體酮并繼續(xù)服用高劑量苯甲酸雌二醇(400 μg·kg-1)7 d。苯甲酸雌二醇和黃體酮購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，并溶于芝麻油中。對照小鼠進行假手術(shù)并僅接受芝麻油處理。

1.2 行為評估

在造模前和造模第33天測量蔗糖偏好，在造模第33天進行尾懸試驗和強迫游泳測試。

1.2.1 蔗糖偏好測試(SPT)

SPT試驗持續(xù)4 d。在開始2 d，分別給小鼠兩瓶含1%蔗糖溶液和純水。每6 h切換1次兩瓶溶液的位置。在接下來的2 d里，小鼠禁止飲水和飲食18 h，然后暴露在預(yù)先稱重的瓶子中6 h，每2 h切換1次瓶子的位置。蔗糖偏好指數(shù)計算為消耗的蔗糖溶液與液體攝入總量的百分比。

1.2.2 尾懸試驗(TST)

小鼠的尾巴用膠帶纏住，倒扣在鉤子上。在6 min 試驗期的最后4 min內(nèi)，由一名對研究一無所知的觀察人員記錄不動時間。不動定義為小鼠被動地懸掛并且完全靜止。

1.2.3 強迫游泳測試(FST)

將每只試驗小鼠放置在含有淡水[(25±1)℃，深15 cm)]的透明圓柱體(高25 cm，內(nèi)徑15 cm)中6 min。在6 min試驗期的最后4 min內(nèi)，由一名對研究一無所知的觀察人員記錄不動時間。每次試驗后都要換水。不動定義為小鼠漂浮在水中不掙扎或只是輕微移動以保持呼吸。

1.3 蘇木精和伊紅(HE)染色

行為評估后，對每組小鼠進行麻醉并向上固定，暴露心臟。左心灌注4%多聚甲醛固定，獲得小鼠腦組織。將海馬分離固定在Bouin氏液中，梯度酒精脫水，二甲苯浸泡，石蠟包埋，切成5 μm切片，二甲苯脫蠟。然后使用HE染色試劑盒(上海Beyotime公司)對切片進行染色。將切片在蘇木精中浸泡12 min，在1%鹽酸乙醇中分色10 s，然后在伊紅中浸泡4 min。之后，將切片脫水、透明、中性香脂密封，并在顯微鏡(日本Olympus公司)下觀察。

1.4 微陣列分析

分別取3只PPD模型小鼠和假手術(shù)小鼠用于RNA微陣列分析。收集海馬組織，使用TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)提取總RNA。然后，基于260、280和230 nm處的光密度，使用NanoDrop 2000C(Thermo Fisher)確定RNA純度。取50 μg總RNA，使用miRNA Complete Labeling and Hyb Kit(美國Agilent公司)標記miRNA，然后在60 ℃下用雜交混合物和Hyb標記雜交處理20 h。將miRNA與Human miRNA Microarray Release(美國Agilent公司)進一步雜交，并使用SureScan Dx 微陣列掃描儀(美國Agilent公司)進行掃描。同樣，進行l(wèi)ncRNA微陣列分析，其中使用50 μg RNA，并將lncRNA與小鼠LncRNA微陣列V6.0(上海SHBIO公司)雜交。獲得的數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)量中心分析和標準化，以確定差異表達的miRNA和lncRNA。

1.5 逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)

使用TRIzol試劑收集海馬組織和細胞的總RNA，并使用PrimeScript Master Mix Kit(日本Takara公司)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ試劑盒(日本Takara公司)確定相對基因表達，并在Mx3005P qPCR系統(tǒng)(美國Stratagene公司)上運行qPCR。使用2-ΔΔCT方法將目標基因的相對表達水平歸一化為U6(對應(yīng)于miR-330表達計算)和GAPDH(對應(yīng)于MAGI2-AS3、GABAA表達計算)的相對表達水平。MAGI2-AS3引物(正向：5′-TCCTAAGGTCAAGAGAAGTGTCAG-3′；反向：5′-GTGGCGATGTGGCAGAGA A-3′)；miR-330引物(正向：5′-TCGAATCTAGAGATCCGACGCCGC-3′；反向：5′-GACGTGT AAACATCCTACACTCAGCT-3′)；GABAA引物(正向：5′-TATACAAGGGCAAGCTCUCTG T-3′；反向：5′-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC-3′)；U6引物(正向：5′-CTCGCTTCGGCAG CACA-3′；反向：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′)和GAPDH引物(正向：5′-GGGAGCCAAAAGGGTCATCA-3′；反向：5′-TGATGGCATGGACTGTGGTC-3′)由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。

1.6 病毒注射

PPD模型建立后第1天，實驗小鼠用1%戊巴比妥鈉(60 mg·kg-1，i.p.)麻醉，頭部固定在SR-5立體定向框架(日本Narishige公司)。硬腦膜暴露后，在無菌條件下用微量注射器(瑞典Dakumar Machinery公司)將2 μL慢病毒(sh-NC、sh-MAGI2-AS3、sh-GABAA)注入海馬CA3區(qū)(AP-1.94 mm；ML±2.4 mm；DV-1.9 mm；相對于前囟)。注射后將注射器保持在原位10 min，以盡量減少液體回流。小鼠在(31±1)℃的溫暖房間中恢復(fù)3 d。

1.7 細胞培養(yǎng)

大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞系PC12購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心，并維持在含有5%胎牛血清(FBS)、10%馬血清、100 U·mL-1青霉素和100 μg·mL-1鏈霉素(美國Gibco公司)的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM，美國Gibco公司)中培養(yǎng)。取指數(shù)生長期細胞，用PBS重懸至4×104細胞·mL-1，接種到24孔板上，然后加入100 ng·mL-1神經(jīng)生長因子(美國Sigma公司)和10%FBS進行72 h的分化刺激。

1.8 細胞轉(zhuǎn)染

將PC12細胞分為MAGI2-AS3 NC(NC為陰性對照，轉(zhuǎn)染MAGI2-AS3空載體)組、MAGI2-AS3-OE組(OE過表達，轉(zhuǎn)染MAGI2-AS3 RNA片段)、miR-330對照組(轉(zhuǎn)染miR-330 control)、miR-330模擬物組(轉(zhuǎn)染miR-330 mimic)、sh-NC組(轉(zhuǎn)染空載體病毒)、sh-MAGI2-AS3組(轉(zhuǎn)染sh-MAGI2-AS3病毒)和sh-GABAA組(轉(zhuǎn)染sh-GABAA病毒)。RNA片段和慢病毒構(gòu)建均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司完成。在轉(zhuǎn)染前24 h將細胞接種在6孔板上。當細胞匯合度達到約70%時，使用Lipofectamine 3000試劑(美國Thermo Fisher Scientific公司)進行轉(zhuǎn)染。

1.9 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine(EdU)標記

使用Cell-Light EdU Apollo567 In Vitro Kit(廣東RiboBio公司)測定細胞的增殖活性。將50 μL細胞固定溶液加載到培養(yǎng)板上，在室溫下進行30 min細胞孵育，用PBS洗滌細胞，用甘氨酸溶液孵育8 min，用含有0.5% Triton X-100的PBS洗滌。然后，將細胞用標記溶液在黑暗中反應(yīng)30 min，用甲醇和PBS洗滌2次，在室溫下用1×Hoechst溶液在黑暗中處理20 min。在CX23熒光顯微鏡(日本Olympus公司)下觀察標記，其中涉及3個隨機場。計數(shù)EdU標記的細胞數(shù)(增殖細胞)和Hoechst標記的細胞數(shù)(總細胞數(shù))，計算細胞增殖率：細胞增殖率=增殖細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。進行了3個獨立的實驗。

1.10 熒光素酶測定

篩選出的lncRNA與miRNA的結(jié)合位點在StarBase(http://starbase.sysu.edu.cn/)上預(yù)測，miRNA與mRNA的結(jié)合位點在StarBase、TargetScan(http://www.targetscan .org/)和miRDB(http://www.mirdb.org/)上預(yù)測。將miR-330和MAGI2-AS3的3′UTR，或HIC2、GABAA、AFF4或ZUP1和miR-330的3′UTR插入pMIR-REPORT(Thermo Fisher)熒光素酶報告載體并共轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中。24 h后裂解細胞，并使用雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)(美國Promega Corporation公司)測量相對熒光素酶活性。

1.11 統(tǒng)計學方法

使用SPSS22.0軟件分析數(shù)據(jù)。通過Kolmogorov-Smirnov檢驗檢查數(shù)據(jù)是否處于正態(tài)分布。測量數(shù)據(jù)顯示為平均值±標準偏差。使用t檢驗評估2組之間的差異，并使用單向或雙向方差分析(ANOVA)比較多組之間的差異，然后使用Tukey的多重比較檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PPD模型小鼠表現(xiàn)出抑郁樣行為

為了驗證PPD模型的成功建立，通過SPT、FST和TST評估抑郁樣行為。SPT開始時，PPD組和假手術(shù)組的蔗糖偏好無顯著差異，而建模后PPD組蔗糖偏好率下降了(11.1±3.4)%(交互作用F(1,32)=5.423，P=0.026；模型F(1,32)=6.149,P=0.019；PPD F(1,32)=13.280,P=0.001)(圖1A)。與假手術(shù)組相比，PPD組的FST不動時間增加了(65.47±9.65)s(t=6.786，P<0.001)，TST不動時間增加了(70.06±5.09)s(t=13.76，P<0.001)(圖1B—C)。HE染色結(jié)果表明，PPD組小鼠海馬組織中的錐體細胞排列不規(guī)則，形狀和邊界不清，數(shù)量減少(圖1D)?；赑PD小鼠和假手術(shù)組小鼠的海馬組織進行l(wèi)ncRNA微陣列分析，發(fā)現(xiàn)在PPD小鼠中l(wèi)ncRNA MAGI2-AS3顯著上調(diào)(圖1E)。這一發(fā)現(xiàn)通過RT-qPCR得到驗證，在PPD小鼠海馬組織中MAGI2-AS3表達水平高于假手術(shù)組(圖1F)。

A—C：PPD小鼠SPT蔗糖偏好率(A)、FST不動時間(B)、TST不動時間(C)的測定結(jié)果。D：HE染色觀察PPD小鼠海馬組織損傷。與假手術(shù)組相比，**P<0.01，***P<0.001；與第0天相比，#P<0.05。

E：微陣列分析測定的PPD小鼠和假手術(shù)小鼠海馬組織間差異表達的lncRNAs。F：通過RT-qPCR測量小鼠海馬組織中MAGI2-AS3表達。與假手術(shù)組相比，***P<0.001。

2.2 抑制MAGI2-AS3表達減輕神經(jīng)元損傷

為了確定MAGI2-AS3在神經(jīng)元恢復(fù)中的潛在作用，在PC12細胞中施用sh-MAGI2-AS3慢病毒，導(dǎo)致細胞中MAGI2-AS3表達降低(圖2A)。EdU標記分析結(jié)果表明，MAGI2-AS3表達降低增加了PC12細胞的活力(圖2B)。PPD小鼠海馬注射sh-MAGI2-AS3慢病毒后，海馬組織的錐體細胞排列緊密，細胞數(shù)量增加，邊界清晰(圖2C)。

A：通過RT-qPCR確定sh-MAGI2-AS3慢病毒轉(zhuǎn)染后PC12細胞中MAGI2-AS3表達。B：通過EdU標記分析確定的細胞活力(增殖活性)。C：HE染色觀察sh-MAGI2-AS3慢病毒對PPD小鼠海馬組織神經(jīng)元損傷影響。與sh-NC組相比，**P<0.01，***P<0.001。

2.3 LncRNA MAGI2-AS3作為miR-330的海綿發(fā)揮作用

miRNA微陣列分析發(fā)現(xiàn)了20個異常低表達的miRNA(圖3A)。將結(jié)果與StarBase上預(yù)測的MAGI2-AS3的目標miRNA進行比較，發(fā)現(xiàn)miR-330相交(圖3B)。RT-qPCR發(fā)現(xiàn)PPD小鼠海馬中miR-330表達相對于假手術(shù)小鼠的表達降低(圖3C)。通過熒光素酶測定進一步驗證MAGI2-AS3和miR-330之間的結(jié)合關(guān)系(圖3D)。表明lncRNA MAGI2-AS3可能通過充當miR-330的海綿來上調(diào)GABAA表達，從而在PPD進展中發(fā)揮神經(jīng)損傷作用。

A：通過微陣列分析確定的假手術(shù)和PPD小鼠之間差異表達的miRNA。B：在StarBase(http://starbase.sysu.edu.cn/)上預(yù)測的MAGI2-AS3的miRNA微陣列分析結(jié)果和目標miRNA的維恩圖。C：通過RT-qPCR測定的小鼠海馬組織中的miR-330表達。與假手術(shù)組相比，***P<0.001。D：通過雙熒光素酶報告基因檢測驗證MAGI2-AS3和miR-330之間的靶標關(guān)系。與MAGI2-AS3+NC組相比，***P<0.001。

2.4 miR-330直接與GABAA結(jié)合

根據(jù)上述發(fā)現(xiàn)，進一步探測miR-330的下游分子。整合的在線預(yù)測確定了miR-330的4個靶mRNA：HIC2、GABAA、AFF4、ZUP1(圖4A)。雙熒光素酶報告基因分析確定僅GABAA野生型(WT)序列的共轉(zhuǎn)染(圖4B)。因此，GABAA被選為以下研究的對象，并發(fā)現(xiàn)GABAA在PPD小鼠海馬組織中表達增加(圖4C)。上調(diào)PC12細胞中MAGI2-AS3表達導(dǎo)致GABAA表達增加，但轉(zhuǎn)染miR-330模擬物使細胞中GABAA表達降低(圖4D)。

A：在StarBase上預(yù)測miR-330整合靶mRNA的Venn圖。B：通過雙熒光素酶報告基因分析(WT：野生型；MT：突變型)；與miR-330 control相比，***P<0.001。C：RT-qPCR檢測PPD小鼠和假手術(shù)小鼠海馬組織中GABAA表達。與假手術(shù)組相比，***P<0.001。D：通過RT-qPCR測定MAGI2-AS3-OE和miR-330模擬轉(zhuǎn)染PC12細胞后GABAA的表達。與MAGI2-AS3-NC組相比，***P<0.001；與miR-330 control組相比，###P<0.05。

2.5 抑制GABAA表達減輕神經(jīng)元損傷

為了驗證GABAA的確切作用，建立了GABAA表達降低的PC12細胞(圖5A)。發(fā)現(xiàn)GABAA表達降低使PC12細胞增殖活性增加(圖5B)。同樣，HE染色結(jié)果表明敲低PPD小鼠海馬組織中GABAA表達使神經(jīng)元損傷減輕(圖5C)。這些結(jié)果表明，GABAA表達降低可以增加神經(jīng)元的活力，減少PPD小鼠神經(jīng)元損傷。

A：通過RT-qPCR測定sh-GABAA轉(zhuǎn)染后PC12細胞中GABAA表達。B：通過EdU標記試驗測定細胞活力(增殖活性)。C：HE染色觀察sh-GABAA慢病毒對PPD小鼠海馬組織神經(jīng)元損傷影響。與sh-NC組相比，*P<0.05，***P<0.001。

3 討論

現(xiàn)代女性工作和生活壓力很大，PPD的發(fā)病率也呈上升趨勢[1]。PPD不僅嚴重損害女性的身心健康，而且對嬰兒的健康成長、家庭和睦、社會穩(wěn)定也帶來有害影響[7]?；诨虔煼ǖ姆乔秩胩匦裕罱难芯考性趯⑵鋺?yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的控制中[8]。涉及l(fā)ncRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的ceRNA網(wǎng)絡(luò)已在多種人類疾病中得到驗證，并引起了人們對包括PPD在內(nèi)的抑郁樣行為治療的日益關(guān)注[9]。本研究證明lncRNA MAGI2-AS3可能通過充當miR-330的海綿來上調(diào)GABAA表達，從而在PPD進展中發(fā)揮神經(jīng)損傷作用。

本研究對PPD小鼠模型進行l(wèi)ncRNA微陣列分析，并確定MAGI2-AS3為PPD小鼠海馬組織中表達顯著升高的lncRNA。目前，越來越多l(xiāng)ncRNA被鑒定為對抑郁樣行為具有高度特異性或在PPD發(fā)病機制中發(fā)揮新興作用[10]。例如，有研究[11]發(fā)現(xiàn)LncRNA Gm14205通過抑制催產(chǎn)素受體誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞NLRP3炎癥小體激活對PPD具有保護作用。MAGI2-AS3已被確定為多種疾病中細胞活力的調(diào)節(jié)劑，并在卵巢癌和肝細胞癌中為miR-374b-5p的海綿體[12-13]。最近研究[14]報道了MAGI2-AS3過表達可以增強Aβ25-35對神經(jīng)元活力和神經(jīng)炎癥的影響，并且MAGI2-AS3敲低可以減輕神經(jīng)毒性和神經(jīng)炎癥，表明MAGI2-AS3在神經(jīng)疾病進展和治療中的潛在作用。此外，還有研究[15]證明了lncRNA MAGI2-AS3調(diào)控Fas/FasL通路抑制神經(jīng)母細胞瘤生長。本研究發(fā)現(xiàn)抑制MAGI2-AS3表達增加了細胞活力，從而促進神經(jīng)元恢復(fù)并抑制PPD誘導(dǎo)小鼠海馬組織中的神經(jīng)元損傷。這些結(jié)果表明MAGI2-AS3促進了PPD誘導(dǎo)的神經(jīng)元丟失。

lncRNA通過與其他RNA分子的相互作用來實現(xiàn)其功能。本研究通過miRNA微陣列分析篩選出PPD小鼠海馬中前20個下調(diào)的miRNA，并根據(jù)StarBase上的數(shù)據(jù)將結(jié)果與MAGI2-AS3的靶miRNA進行比較，進而確定miR-330為靶標。體內(nèi)分析顯示，miR-330在PPD小鼠海馬組織中表達下調(diào)。此后，在3個數(shù)據(jù)庫中預(yù)測了miR-330的靶標mRNA，確定了4個mRNA(HIC2、GABAA、AFF4和ZUP1)。熒光素酶報告基因檢測驗證了miR-330和GABAA之間的結(jié)合關(guān)系，但沒有發(fā)現(xiàn)其與HIC1、AFF4和ZUP1之間的結(jié)合關(guān)系。GABAA表達在PPD模型小鼠海馬組織中上調(diào)，這與之前的研究[16]一致，該研究[16]表明GABAA是GEO數(shù)據(jù)庫中關(guān)于PPD的主要上調(diào)基因之一。有研究表明，敲除小鼠海馬星形膠質(zhì)細胞中的GABAA受體具有抗抑郁作用[17]。一項DNA甲基化研究[18]證實，GABAA受體甲基化與妊娠焦慮密切相關(guān)。此外，由Sage Therapeutics Biopharmaceutical公司開發(fā)的Zulresso(一種可同時作用于突觸和突觸外GABAA受體的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑)獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)的批準用于治療PPD[19]，表明GABAA在PPD發(fā)展過程中的重要作用。本研究證實了GABAA在PPD小鼠海馬組織中高表達，通過基因轉(zhuǎn)染抑制GABAA表達促進了神經(jīng)元恢復(fù)。

綜上所述，本研究確定了一個涉及MAGI2-AS3/miR-330/GABAA的新型ceRNA網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)可能涉及神經(jīng)元損傷并增加PPD模型中的神經(jīng)元丟失。